Summary
La fecondazione in vitro è una tecnica comunemente utilizzata con una varietà di organismi modello per mantenere le popolazioni di laboratorio e produrre embrioni sincronizzati per applicazioni a valle. Qui, presentiamo un protocollo che implementa questa tecnica per diverse popolazioni del pesce tetra messicano, Astyanax mexicanus.
Abstract
Il messicano Astyanax sta emergendo come organismo modello per una varietà di campi di ricerca nella scienza biologica. Parte del recente successo di questa specie di pesci teleost è che possiede popolazioni interfertili di grotte e di riveri. Ciò consente la mappatura genetica dei tratti eritorabili che sono stati fissati durante l'adattamento ai diversi ambienti di queste popolazioni. Mentre questa specie può essere mantenuta e allevata in laboratorio, è difficile sia ottenere embrioni durante il giorno che creare embrioni ibridi tra i ceppi. La fecondazione in vitro (IVF) è stata utilizzata con una varietà di organismi modello diversi per allevare con successo e ripetutamente animali in laboratorio. In questo protocollo, mostriamo come, acclimatando A. mexicanus a diversi cicli di luce accoppiati con variazioni della temperatura dell'acqua, possiamo spostare i cicli riproduttivi a un momento scelto della giornata. Successivamente, mostriamo come identificare i pesci parentali adatti, raccogliere gameti sani da maschi e femmine e produrre prole vitale utilizzando la fecondazione in vitro. Ciò consente procedure correlate come l'iniezione di costrutti genetici o l'analisi dello sviluppo durante le normali ore di lavoro. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per creare ibridi tra la grotta e le popolazioni che vivono in superficie, e quindi consentire lo studio della base genetica degli adattamenti fenotipici in ambienti diversi.
Introduction
Negli ultimi anni, Astyanax mexicanus è diventato un organismo modello in diversi campi come la biologia dello sviluppo, la biologia evolutiva, la biologia comportamentale e la fisiologia1,2,3,4 . L'unicità di questo sistema deriva da questa specie che ha diversi morfotipi che si sono adattati ad ambienti molto diversi. Il morfotipo di abitazione superficiale vive in fiumi dove c'è un'alta biodiversità e un sacco di fonti di cibo per il pesce. Al contrario, i morfotipi delle caverne di A. mexicanus,i pesci grotta, vivono in grotte dove la biodiversità, le fonti di cibo e l'ossigeno sono drasticamente diminuite1. I pesci cavernicolo differiscono dai pesci di superficie in una varietà di fenotipi come l'assenza di occhi e pigmentazione, insulino-resistenza e la capacità di immagazzinare grasso2,3,4. Tuttavia, i pesci di superficie e i pesci cavernile appartengono ancora alla stessa specie e sono, quindi, interfertili.
Per entrambi i morfotipi è stata definita una serie di condizioni per consentire la manutenzione e l'allevamento di routine in condizioni di laboratorio5,6. Tuttavia, le modifiche genetiche, i giusti studi sullo sviluppo embrionale e la creazione di ibridi sono ancora impegnativi per diversi motivi. A. mexicanus depongono principalmente le uova durante le ore notturne, il che è scomodo per i successivi esperimenti sulle prime fasi embrionali come l'iniezione di costrutti genetici o il monitoraggio dei primi processi di sviluppo embrionale. Inoltre, la generazione di ibridi di superficie e grotta è difficile con la deposizione naturale delle uova, poiché i morfotipi della grotta hanno un ritmo circadiano alterato7 che in ultima analisi influisce sulla produzione di ovuli vitali. Sono state descritte procedure di successo, ma invasive, in fecondazione in vitro per altre specie di Astyanax, dove la produzione di gameti e il comportamento riproduttivo sono stati innescati con iniezioni ormonali8,9. Sono state descritte procedure di fecondazione in vitro meno invasive (ad esempio, l'ottenimento di gameti dalla deposizione manuale delle uova senza l'iniezione di preparati ormonali) ma non considerano le differenze nel ciclo di deposizione delle uova tra morfotipi di grotta e superficie di A. mexicanus 6.
Altri organismi modello di pesce, come il pesce zebra, possono essere facilmente geneticamente modificati e studiati a livello embrionale perché gli ostacoli sopra indicati sono stati risolti con successo. L'implementazione di tecniche di allevamento standardizzate, fecondazione in vitro e crioconservazione dello sperma hanno tutti spinto il pesce zebra in avanti e solidificato l'uso del modello nelle scienze biologiche10. Pertanto, estendere queste tecniche ad A. mexicanus lo rafforzerà ulteriormente come sistema modello.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la fecondazione in vitro che contribuirà a rendere A. mexicanus più accessibile. Presenteremo un setup di allevamento che consente di spostare i cicli di luce del pesce dal giorno alla notte in modo che gli ovuli vitali possano essere ottenuti durante le ore diurne senza iniezione di preparati ormonali. Forniamo quindi una descrizione dettagliata di come ottenere gli ovuli e i milt utilizzati per la fecondazione in vitro. Questo metodo consentirà la produzione di embrioni durante il normale orario di lavoro e renderà più fattibili ulteriori applicazioni a valle rispetto all'utilizzo di embrioni provenienti dalla deposizione naturale delle uova.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Istituto Stowers per la ricerca medica.
1. Manipolazione del ciclo di luce
- Impostare vasche di pesce all'interno di un sistema di acquacoltura opaco, completamente chiuso (protezione della luce), acquacoltura fluttuosa contenente più file di serbatoi (Figura 1).
NOTA: Il sistema di flusso come illustrato nella Figura 1 utilizza l'acqua del sistema per lavare i rifiuti attraverso il tubo del supporto posteriore di ogni serbatoio e scorre in un pozzetto che si svuota in uno scarico sanitario. In questo esperimento, è stato utilizzato un tasso di cambio dell'acqua di un gallone (US) all'ora attraverso un emettitore a goccia. - Mantenere la temperatura di ogni serbatoio con un elemento di riscaldamento indipendente che viene utilizzato per modificare manualmente la temperatura durante il processo di innesco.
- Impostare singole righe in modo da abilitare fotoperiodi separati in ciascuna di esse. Installare porte su ogni fila che possono essere chiuse per evitare che la luce entri o escenda.
NOTA: Il controllore automatico può consentire la manipolazione di tutti i fotoperiodi con il minor disturbo al pesce. - Equipaggiare il rack con una luce di lavoro rossa e tende oscuranti per l'accesso durante le ore buie.
2. Regolazione del fotoperiodo e dell'innesco dei pesci per la raccolta dei gameti
- Rimuovere il pesce desiderato (Figura 2a) dai rack di sistema generali e posizionarlo in rack di allevamento per consentire la regolazione del fotoperiodo 14 giorni prima dell'innesco.
NOTA: Questo permette al pesce di acclimatarsi in un nuovo ambiente. - Tenere il pesce a 22,8 gradi centigradi durante questo periodo utilizzando il sistema di riscaldamento acquatico installato. Il fotoperiodo normale è dalle 6:00 alle 20:00 luce e dalle 20:00 alle 6:00. Per il rack del ciclo di luce, spostare il fotoperiodo alle 10:00 di luce e dalle 12 alle 22.00 scuro regolando il timer che alimenta la luce all'interno del rack.
NOTA: Maschi e femmine sono alloggiati nello stesso serbatoio per consentire comportamenti naturali di innesco. Mentre la deposizione delle uova può avvenire nel serbatoio, i pesci possono ancora essere utilizzati per la fecondazione in vitro poiché i gameti vengono rilasciati nelle fasi11. - Una volta che i pesci sono acclimatati, iniziare ad innesco gli animali per la deposizione delle uova5 come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.5.
NOTA: questa procedura richiede sei giorni in totale. Nel corso di questo tempo, modificare la temperatura per innescare la produzione di olio utilizzando un sistema di riscaldamento acquatico installato. Utilizzando i riscaldatori acquatici 50W (vedi Tabella deimateriali), impostare il riscaldatore direttamente alla temperatura (la scala sul riscaldatore è in Fahrenheit) indicata nel protocollo ad ogni passo. A seconda delle dimensioni del serbatoio e della velocità di flusso dell'acqua, il tempo di regolazione della temperatura può variare. In questo esperimento, la temperatura è stata regolata a mezzogiorno e l'equivocazione della temperatura ha assunto i successivi 18 h.- Il primo giorno, alzare la temperatura da 22,8 gradi centigradi a 24,4 gradi centigradi.
- Il secondo giorno, alzare la temperatura da 24,4 gradi centigradi a 26,1 gradi centigradi.
- Il giorno 3 e 4, mantenere la temperatura a 26,1 gradi centigradi. I pesci saranno pronti per la deposizione delle uova durante il giorno e la fecondazione in vitro potrà essere eseguita.
NOTA: A seconda dei singoli pesci, le femmine possono deporre le uova il giorno 3 e/o il giorno 4. Si consiglia di cercare di ottenere ovuli il giorno 3 e/o il giorno 4 a seconda del successo della collezione di ovuli. - Il giorno 5, abbassare la temperatura da 26,1 gradi centigradi a 24,4 gradi centigradi.
- Il giorno 6, abbassare la temperatura da 24,4 gradi centigradi a 22,8 gradi centigradi.
NOTA: fornire un intervallo di 7 giorni prima di ripetere questo ciclo di temperatura. Si raccomanda di continuare a mantenere il pesce in questo fotoperiodo poiché questo ridurrà il tempo complessivo necessario al pesce per adattarsi a questo ciclo di luce spostata.
3. Collezione femminile di gameti
- Iniziare inserendo una salvietta di tessuto inumidito in un coperchio del piatto Petri e chiudendo il piatto per creare una camera umida e impedire che l'ovulo si secchi durante il processo di raccolta.
- Quindi scegliere una femmina per la raccolta. I pesci gravidi con grandi addominali sporgenti saranno probabilmente la scelta migliore per questa procedura (Figura 2a).
NOTA: Per distinguere tra maschi e femmine dell'adulto A. mexicanus,è stato utilizzato il metodo del batuffolo di cotone12. - Immobilizza una femmina usando acqua refrigerata e mettila in posizione supina in un portaanimali spugna inumidita. Fatelo mettendo il pesce in acqua di sistema a 4 gradi centigradi per almeno 30 s o fino a quando il pesce non viene immobilizzato (cioè, perdita di movimento della branchia, vedere Ross e Ross13 per i dettagli).
NOTA: Lavorare rapidamente e cercare di evitare il riscaldamento del pesce fino al completamento della procedura. Questo può includere periodicamente immergere le punte guantate delle dita in acqua fredda o offrire anestesia supplementare. Possono essere utilizzati anche altri metodi di anestesia (ad esempio, MS-22213). Secondo le linee guida IACUC dello Stowers Institute for Medical Research, la raccolta manuale di ovuli è considerata una procedura non invasiva, che non richiede un'anestesia completa (ad esempio, attraverso MS-222). - Una volta posizionato, macchiare il lato ventrale del pesce con una pulizia del tessuto delicato come contatto con l'acqua causerà l'attivazione dell'ovulo.
- Tenere la femmina tra il pollice e l'indice. Stringere delicatamente contro i lati laterali della cavità coelomica nella direzione dell'apertura urogenitale mentre rotola leggermente le dita. Raccogliere l'ovulo espresso utilizzando una spatola usa e getta.
- Trasferire questi ovuli al piatto di Petri umido.
NOTA: Diverse frizioni di ovuli possono essere combinate nello stesso piatto se non sono necessari dati di parentela specifici. L'ova può essere conservato a 24 gradi centigradi e può essere utilizzato per la fecondazione in vitro entro 30-60 min dopo la raccolta. - Dopo la raccolta, restituire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero riempito con acqua di sistema.
NOTA: Riporre il pesce nel serbatoio buio per la futura raccolta di ovuli quando necessario.
4. Collezione di gameti maschili
- Scegli un maschio per la raccolta.
NOTA: Non ci sono segni esteriormente visibili di qualità gameti maschile. Tuttavia, i pesci dovrebbero apparire sani nell'aspetto prima dell'uso in questa procedura. Per distinguere tra maschi e femmine di Adult o. mexicanus,è stato utilizzato il metodo del batuffolo di cotone12. - Immobilizza un maschio usando acqua refrigerata e posizionalo in posizione supina in un portaanimali spugna inumidito. Immobilizzare mettendo il pesce in acqua di sistema a 4 gradi centigradi per almeno 30 secondi o fino a quando il pesce non è immobilizzato (cioè, perdita di movimento della branchia, vedere Ross e Ross13 per i dettagli).
NOTA: Lavorare rapidamente e cercare di evitare il riscaldamento del pesce fino al completamento della procedura. Questo può includere periodicamente immergere le punte guantate delle dita in acqua fredda o offrire anestesia supplementare. Altri metodi di anestesia (ad esempio, MS-22213) possono essere utilizzati anche qui. Secondo le linee guida IACUC dello Stowers Institute for Medical Research, la raccolta manuale di spermatozoi è considerata una procedura non invasiva, che non richiede un'anestesia completa (ad esempio, attraverso MS-222). - Blot il lato ventrale del pesce con una pulizia del tessuto delicato come contatto con l'acqua attiverà il milt.
- Posizionare delicatamente l'estremità di un tubo capillare all'apertura urogenitale.
- Espellere il milt applicando una leggera pressione sui lati del pesce con il pollice e l'indice. Iniziare a disfare dislocante alle branchie, muovendosi verso l'apertura urogenitale.
- Raccogliere il milt alla fine di un tubo capillare. L'aspirazione delicata può essere necessaria mediante l'uso di un tubo aspiratore. Evitare eventuali feci che possono essere espulse con il milt.
- Distribuisci il milt in un tubo di centrifuga vuoto da 1,5 mL e diluicono con il doppio del volume dello sperma Extender E400 (vedi Tabella deimateriali). Tieniti sul ghiaccio.
NOTA: Milt da più maschi possono essere raggruppati insieme se non sono necessari dati di parentela specifici. Questo passaggio può essere utilizzato per estendere l'orario di lavoro del milt per diverse ore, ma non è necessario per la fecondazione immediata. - Dopo la raccolta, restituire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero riempito con acqua di sistema.
NOTA: Riporre i pesci nel serbatoio buio dell'armadio per la futura raccolta di spermatoceri quando necessario.
5. Fecondazione in vitro
- Utilizzando una nuova pipetta per ogni supporto, mescolare lo sperma pipeting e / o agitare il lato del tubo prima di fertilizzare come sperma in milt può stabilirsi nella soluzione E400 nel tempo.
- Distribuisci la soluzione milt o estesa in un'ova appena raccolta.
- Aggiungere rapidamente 1 mL di acqua di sistema alla frizione per attivare lo sperma e le uova per la fecondazione. Evitare di mescolare o agitare il contenuto del piatto e lasciare che si verifichino 2 min per la fecondazione.
NOTA: La miscelazione e l'agitazione riducono notevolmente i tassi di fecondazione e dovrebbero quindi essere evitati14. - Aggiungere E2 Embryo Media per riempire il piatto 2/3rd pieno.
NOTA: a seconda della procedura successiva, gli embrioni possono essere utilizzati immediatamente (ad esempio, per l'iniezione di costrutti genetici come descritto prima dei15) o gli embrioni possono essere incubati in E2 Embryo Media a 23 gradi centigradi fino a raggiungere i 5 dpf. A questo punto trasferire gli embrioni al sistema di alloggiamento di ricircolo principale utilizzando l'acqua del sistema.
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Representative Results
Il protocollo qui presentato si basa principalmente su un protocollo6pubblicato in precedenza. Tuttavia, dal momento che A. mexicanus depone durante le ore notturne, abbiamo progettato un rack di alloggiamento per l'allevamento dei pesci che può cambiare il fotoperiodo indipendentemente dall'orario di lavoro (Figura 1). Il ciclo della luce del pesce viene modificato all'interno di un sistema di acquacoltura completamente chiuso e fluttuante contenente tre file di serbatoi (Figura 1). Ogni serbatoio contiene un elemento di riscaldamento indipendente che viene utilizzato per aumentare manualmente la temperatura durante il processo di innesco. I singoli ripiani possono essere messi su fotoperiodi separati e possono essere chiusi per evitare che la luce entri o fuorita. Tutti i fotoperiodi possono essere manipolati tramite un controller automatizzato posizionato sul lato del rack del ciclo di luce. Per l'accesso durante le ore buie, il rack è dotato di una luce di lavoro rossa e tende oscuranti. A. mexicanus depone le uova dopo un aumento della temperatura da 23 a 26 gradi centigradi con un incremento di 1,5 gradi centigradi al giorno16. Per raggiungere questo obiettivo nei nostri armadi scuri, abbiamo usato riscaldatori per acquari sommersivi in ogni serbatoio (Figura 1).
Il fattore chiave per una procedura di fecondazione in vitro di successo in A. mexicanus è la qualità degli ovuli raccolti. Gravid, pesci femminili con grandi addominali sporgenti sono più propensi a rilasciare ovuli vitali, che appaiono chiari e anche in apparenza (Figura2a-d). L'aggiunta del milt raccolto a tali ovuli comporta lo sviluppo di embrioni fecondati di solito entro 20-30 min (Figura 2e). Gli embrioni fecondati vitali diventeranno leggermente più traslucidi prima di entrare nella fase a una cellula del ciclo di sviluppo, mentre gli ovuli non fecondati appariranno più irregolari e opachi (Figura 2e). Gli embrioni risultanti sono conservati in piatti Petri in E2 Embryo Media e incubati a 23 gradi centigradi in un ciclo di luce/buio 14/10. Gli embrioni vengono poi trasferiti al principale sistema di alloggiamento di ricircolo a 5 giorni dopo la fecondazione per l'allevamento.
Per dimostrare l'importanza della tecnica, mostriamo come la fenotipizzazione degli ibridi per tratti specifici come le dimensioni degli occhi e la pigmentazione del corpo può aiutare a decifrare la loro base genetica. I pesci cavernicose differiscono chiaramente dai pesci di superficie per le loro dimensioni degli occhi e la pigmentazione del corpo. Per comprendere la base genetica di questi tratti, abbiamo attraversato i pesci di superficie e delle caverne (F0) e generato le popolazioni ibride di F1 e F2 utilizzando la fecondazione in vitro per osservare la variazione fenotipica ottenuta (Figura 3). La dimensione degli occhi è più piccola nella generazione Di F1 che indica che la presenza di occhi è un tratto parzialmente dominante (Figura 3). Negli ibridi F2 di superficie-cave, otteniamo una vasta gamma di dimensioni degli occhi, indicando che ci sono più loci che controllano le dimensioni degli occhi in A. mexicanus, rendendolo un tratto quantitativo (Figura 3). Un altro esempio è la pigmentazione. Osservando l'ibrido F1 di superficie e pesci grotta, si può concludere che la pigmentazione del corpo è un tratto dominante in quanto i pesci sono completamente pigmentati (Figura 3). Nella generazione F2, la variazione nella pigmentazione corporea punta nuovamente verso un tratto quantitativo. La combinazione di questi dati fenotipici con i dati di sequenziamento può rivelare loci genetici sottostanti responsabili di questi fenotipi. Queste popolazioni di F2 sono una buona risorsa per comprendere la base genetica di vari tratti e tali popolazioni sono state utilizzate in precedenza per studiare questi tratti17,18,19. Una tecnica standardizzata di fecondazione in vitro può semplificare notevolmente la generazione di ibridi, consentendo la mappatura genetica dei loci a controllare tali tratti e aiutandoci a capire come alcuni fenotipi siano svantaggiosi in alcuni habitat e adattivi in altri.
Figura 1 : Progettazione di rack per spostare cicli diurni/notturni A. mexicanus. (a) La configurazione generale di questo sistema rack consente la manipolazione del fotoperiodo, dando una simulazione del tempo notturno durante le ore diurne quando le porte sono chiuse, e le luci di ripiano sono spente. (b) Priming il pesce per stimolare la maturazione degli ovuli si ottiene utilizzando riscaldatori sommergibili (vedi Tabella deimateriali) installati in singole vasche che possono essere regolati separatamente (frecce rosse). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempi di femmine adatte per la raccolta degli ovuli e illustrazione rappresentativa di ovuli vitali e nonvitali. (a) Gravid, pesci femminili con grandi addominali sporgenti sono più adatti per la raccolta manuale degli ovuli rispetto alle femmine (b) con un addome a forma di aerodinamica. (c) Gli ovuli vitali (cioè gli ovuli che producono embrioni vitali quando vengono fecondati) possono essere identificati con il loro aspetto chiaro e uniforme, mentre gli ovuli non vitali (cioè gli ovuli che non producono embrioni vitali quando vengono fecondati), come mostrato in (d), hanno un apparenza. (e) Dopo una fecondazione di successo, gli embrioni vitali diventano più traslucidi e entrano nello stadio a una cellula, mentre gli ovuli non fecondati (frecce rosse) decadiscono lentamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi genetica delle dimensioni degli occhi e dei tratti di pigmentazione del corpo. Pedigree che mostra immagini di pesci di superficie genitori (F0) (in alto a sinistra) e pesci cavernicolo (in alto a destra), ibridi F1 (seconda fila) e gli ibridi F2. I pesci F1 hanno dimensioni oculari intermedie e sono completamente pigmentati, mentre i pesci F2 mostrano un'ampia variazione nei due tratti morfologici: la dimensione degli occhi e la pigmentazione. Tutti i dati originali sottostanti questa figura sono accessibili dal Stowers Original Data Repository http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre la fecondazione in vitro è un metodo standardizzato per molti organismi modello diversi come il pesce zebra, i protocolli esistenti per A. mexicanus non tengono conto del fatto che questa specie depone naturalmente durante le ore notturne6. Dato che i pesci grotta e i pesci di superficie differiscono drasticamente nei loro ritmi circadiani, il ciclo di maturazione dell'ova differisce anche tra i morfotipi della grotta e della superficie. Mentre le temperature di messa in scena e i tempi per la superficie A. mexicanus sono ben studiati12, i pesci grotta possono differire nel loro comportamento di deposizione delle uova e nel ciclo di maturazione. I metodi convenzionali di produzione ibrida sono quindi molto impegnativi e incerti a causa della perdita del ritmo circadiano nel morfotipo della grotta di A. mexicanus7, che si traduce in tempi di deposizione delle uova alterati di questi pesci. Spostando il fotoperiodo, possiamo fornire embrioni ibridi specifici per il tempo senza dover fare affidamento su rari eventi naturali di deposizione delle uova tra i due morfoni. Mantenere separati la grotta e i pesci di superficie impedisce inoltre ai morph di superficie aggressivi di avere un effetto negativo sull'allevamento.
Esistono alcune limitazioni con questo metodo, come le variazioni nella qualità degli ovuli. L'identificazione di una femmina (superficie o pesce grotta) con ovuli maturi non è banale e richiede accurate osservazioni del comportamento dei pesci. Generalmente, le femmine gravide pronte per la deposizione delle uova hanno addominali più grandi e spazzolano ripetutamente contro la superficie inferiore del serbatoio o la trappola per la raccolta degli embrioni20.
Abbiamo osservato che la qualità dello sperma è coerente per tutto il ciclo giorno / notte. La fase critica della fecondazione in vitro di successo (successo in termini di generazione di embrioni fecondati) è ottenere ovuli vitali e di buona qualità. Pertanto, è estremamente importante raccogliere gli ovuli dai pesci che stanno per deporre le uova naturalmente (Figura 2a). Una volta che gli ovuli sono raccolti, possono essere osservati sotto un microscopio di dissezione per esaminare la qualità. La raccolta di ovuli vitali durante la notte, tuttavia, è scomoda e stimolante per il ricercatore. L'impostazione che presentiamo qui consente lo spostamento del ciclo di maturazione degli ovuli, in modo da poter utilizzare la fecondazione in vitro per generare embrioni sincronizzati per l'applicazione a valle durante il normale orario di lavoro.
Con l'avanzamento della crioconservazione del milt (ad esempio, come descritto nel pesce zebra21), la fecondazione in vitro diventerà un potente strumento per stabilire e mantenere linee genetiche per il sistema modello emergente A. mexicanus. In combinazione con i metodi per la modificazione genetica15 e il knockdown17basato su morfolino, queste procedure forniranno la piattaforma metodologica per studiare le basi genetiche e di sviluppo degli adattamenti a diversi habitat in A. mexicanus.
In sintesi, il protocollo qui presentato consentirà la produzione di embrioni sincronizzati di A. mexicanus per altre applicazioni a valle, come l'iniezione di costrutti genetici o lo studio dei fenotipi embrionali precoci. Il punto di forza principale del protocollo è che consente una produzione efficiente di ibridi superficie-grotta che possono essere utilizzati per mappare geneticamente le differenze fenotipiche tra pesci di superficie e pesci cavernicolo attraverso l'analisi QTL (quantitative trait loci). Nel loro insieme, ottenere ovuli vitali durante il giorno per la fecondazione in vitro è una tecnica potente che sarà utile per una varietà di studi futuri in diversi campi delle scienze biologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Philippe Noguera e Kimberly Bland per il loro sostegno alla produzione video. Gli autori desiderano anche riconoscere l'intero team Aquatics dell'Istituto Stowers per l'allevamento degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti istituzionali a DPB e NR. NR è stato sostenuto dalla Edward Mallinckrodt Foundation e dalla JDRF. RP è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
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