Summary
Экстракорпоральное оплодотворение является широко используемой техникой с различными модельными организмами для поддержания популяций лабораторий и производства синхронизированных эмбрионов для применения ниже по течению. Здесь мы представляем протокол, который реализует эту технику для различных популяций мексиканской рыбы тетра, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus становится образцовым организмом для различных исследовательских областей в биологической науке. Часть недавнего успеха этого вида телеост ных рыб является то, что он обладает межплодной пещеры и речной обитаемой популяции. Это позволяет генетическое отображение наследственных признаков, которые были зафиксированы во время адаптации к различным средам этих популяций. Хотя этот вид может быть сохранен и выведен в лаборатории, это сложно как получить эмбрионы в дневное время и создать гибридные эмбрионы между штаммами. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) было использовано с различными модельными организмами для успешного и многократного разведения животных в лаборатории. В этом протоколе мы показываем, как, акклиматизируя A. mexicanus к различным световым циклам в сочетании с изменениями температуры воды, мы можем перенести циклы размножения в выбранное время суток. Впоследствии мы покажем, как определить подходящую родительскую рыбу, собрать здоровых гамет у самцов и самок, а также производить жизнеспособное потомство с помощью ЭКО. Это позволяет проводить соответствующие процедуры, такие как инъекция генетических конструкций или анализ развития в обычное рабочее время. Кроме того, этот метод может быть использован для создания гибридов между пещерными и поверхностными популяциями, и тем самым позволит изучать генетическую основу фенотипической адаптации к различным средам.
Introduction
В последние годы, Astyanax mexicanus стал образцовым организмом в различных областях, таких как биология развития, эволюционная биология, поведенческая биология, и физиология1,2,3,4 . Уникальность этой системы исходит от этого вида, имеющего несколько морфотипов, которые адаптировались к очень разным средам. Поверхностный морфотип жилища обитает в реках, где существует высокое биоразнообразие и много источников пищи для рыб. В отличие от пещеры морфотипов A. mexicanus, пещеры, живут в пещерах, где биоразнообразие, источники пищи, и кислород резко уменьшилась1. Пещерные рыбы отличаются от поверхностных рыб различными фенотипами, такими как отсутствие глаз ипигментации, резистентность к инсулину, и способность хранить жир 2,3,4. Однако поверхностные рыбы и пещерные рыбы по-прежнему принадлежат к одному и тому же виду и, следовательно, являются взаимоплодными.
Для обоих морфотипов был определен набор условий, позволяющихпроводить плановое техническое обслуживание и разведение в лабораторных условиях 5,6. Тем не менее, генетические модификации, надлежащие эмбриональные исследования развития, и создание гибридов по-прежнему сложной задачей по нескольким причинам. A. mexicanus в основном порождается в ночные часы, что неудобно для последующих экспериментов на ранних эмбриональных стадиях, таких как инъекция генетических конструкций или мониторинг ранних эмбриональных процессов развития. Кроме того, генерация поверхностных и пещерных гибридов является сложной задачей с использованием естественного нереста, так как пещерные морфотипы имеют измененный циркадный ритм7, который в конечном счете влияет на выработку жизнеспособной яйцы. Успешные, но инвазивные, процедуры ЭКО были описаны для других видов Astyanax, где производство гамет и нереста поведение было загрунтовано с помощью гормональных инъекций8,9. Менее инвазивные процедуры ЭКО (т.е. получение гамет от ручного нереста без инъекции гормональных препаратов) были описаны, но не учитывают различия в цикле нереста между пещерными и поверхностными морфотипами A. mexicanus 6.
Другие организмы модели рыб, такие как зебра, могут быть легко генетически модифицированы и изучены на эмбриональном уровне, потому что препятствия, изложенные выше, были успешно решены. Внедрение стандартизированных методов размножения, экстракорпоральное оплодотворение и криоконсервация спермы продвинули зебры вперед и укрепило использование модели в биологических науках10. Таким образом, распространение этих методов на A. mexicanus будет еще больше укрепить его в качестве модели системы.
Здесь мы представляем подробный протокол для ЭКО, который поможет сделать A. mexicanus более доступным. Мы представим установку разведения, которая позволяет смещать световые циклы рыбы с дневного на ночное время, чтобы жизнеспособная яйца могла быть получена в дневные часы без инъекций гормональных препаратов. Затем мы предоставляем подробное описание того, как получить яйец и milt используется для ЭКО. Этот метод позволит вырабатывать эмбрионы в обычное рабочее время и сделает более возможнымприменение по сравнению с использованием эмбрионов при естественном нересте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Института медицинских исследований Stowers.
1. Манипуляция легким циклом
- Настройка аквариумов в непрозрачной, полностью закрытой (световой защите), системе проточной аквакультуры, содержащей несколько рядов цистерн(рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная система, как показано на рисунке 1 использует системную воду, чтобы промыть отходы через заднюю трубу стенда каждого резервуара и впадает в водоотлив, который впадает в санитарный сток. В этом эксперименте, обменный курс воды одного галлона (США) в час через капельный излучатель был использован. - Поддерживайте температуру каждого резервуара с независимым нагревательным элементом, который используется для ручного изменения температуры во время процесса грунтовки.
- Настройка отдельных строк таким образом, чтобы включить отдельные фотопериоды в каждом из них. Установите двери на каждом ряду, которые могут быть закрыты, чтобы предотвратить попадание света или побег.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный контроллер может включать в себя манипуляции всех фотопериодов с наименьшим нарушением рыбы. - Оборудуйте стойку красным рабочим светом и затемненными шторами для доступа в темное время суток.
2. Корректировка фотопериода и грунтовки рыбы для коллекции гамет
- Удалите желаемую рыбу(рисунок 2a) из стеллажей общей системы и поместите в разведение стеллажей, чтобы обеспечить регулировку фотопериода за 14 дней до грунтовки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет рыбе акклиматизироваться к новой среде. - Держите рыбу на уровне 22,8 градусов по Цельсию (73 градусов по Фаренгейту) в этот период с помощью установленной системы водного отопления. Обычный фотопериод с 6 утра до 8 вечера света и 8 вечера до 6 утра темно. Для стойки светового цикла переносите фотопериод на 22:00 на 12 часов света и с 12:00 до 22:00, регулируя таймер, который питает свет в стойке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мужчины и женщины размещены в том же баке, чтобы обеспечить естественное поведение грунтовки иметь место. Хотя нерест может иметь место в баке, рыба все еще может быть использована для экстракорпорального оплодотворения, так как гаметы выпускаются в стадии11. - После того, как рыба акклиматизированы, начать грунтовки животных для нереста 5, как описано в шагах 2,3,1 до 2,3,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает шесть дней в общей сложности. За это время, изменить температуру, чтобы премьер-производства явы с помощью установленной водной системы отопления. Используя 50W водные обогреватели (см. ТаблицуМатериалов), установите нагреватель непосредственно к температуре (шкала на нагревателе находится в По фаренгейте), приведенной в протоколе на каждом шагу. В зависимости от размера резервуара и скорости проточного потока воды время корректировки температуры может отличаться. В этом эксперименте, температура была скорректирована в полдень и температуры равновесия взял на следующие 18 ч.- В день 1, поднять температуру от 22.8 C (73 c) до 24.4 C (76 c).
- На второй день поднимите температуру с 24.4 градуса по Цельсию (76 градусов по Фаренгейту) до 26.1 c (79 градусов по Фаренгейту).
- На 3 и 4 днях, держите температуру на 26.1 C (79 cS). Рыба будет готова к нересту в течение дня и ЭКО может быть выполнена.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от отдельных рыб, самки могут нереститься в день 3 и / или день 4. Мы рекомендуем попробовать получить яйцы на 3-й день и/или 4-й день в зависимости от успеха коллекции яйцы. - В день 5, понизить температуру от 26.1 C (79 c) до 24.4 C (76 c).
- На 6-й день понизить температуру с 24,4 градусов по Цельсию (76 градусов по Фаренгейту) до 22,8 градусов по Цельсию (73 градусов по Фаренгейту).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить 7-дневный разрыв перед повторением этого цикла температуры. Рекомендуется продолжать держать рыбу в этом фотопериод, так как это позволит сократить общее время, необходимое для рыбы, чтобы приспособиться к этому сдвигу светового цикла.
3. Коллекция гамет-женщин
- Начните с вставки увлажненной ткани протрите в крышку чашки Петри и закрыв блюдо для создания увлажненной камеры и предотвращения высыхания яйца во время процесса сбора.
- Далее выбирайте самку для коллекции. Gravid рыбы с большими, выступающие животы, вероятно, будет лучшим выбором для этой процедуры(рисунок 2a).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать мужчин и женщин взрослого A. mexicanus, ватный шарик метод был использован12. - Обездвижить самку с помощью охлажденной воды и поместите ее в положение на спине в увлажненной губке животного держателя. Сделайте это, поместив рыбу в 4 градусов по Цельсию системной воды, по крайней мере 30 с или до тех пор, пока рыба обездвижена (т.е. потеря движения жаберных, см Росс и Росс13 для получения подробной информации).
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро и старайтесь не нагревать рыбу до завершения процедуры. Это может включать в себя периодические погружения в перчатках кончики пальцев в холодную воду или предлагая дополнительную анестезию. Другие методы анестезии (например, МС-22213)могут быть использованы также. В соответствии с руководящими принципами IACUC Института медицинских исследований Stowers, ручная коллекция яйточки считается неинвазивной процедурой, которая не требует полной анестезии (например, через МС-222). - После того, как расположен, пятно брюшной стороне рыбы с деликатной ткани протрите, как контакт с водой вызовет яйец, чтобы активировать.
- Держите самку между большим и указательным пальцами. Аккуратно сжимайте боковые стороны куломической полости в направлении урогенитального отверстия при слегкам свертывании пальцев. Соберите выраженную яйму с помощью одноразового шпателя.
- Перенесите эти яйки в увлажненное блюдо Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько муфт яйточки может быть объединена в том же блюде, если конкретные данные происхождения не требуется. Явка может храниться при 24 градусах Цельсия и лучше всего использовать для ЭКО в течение 30-60 минут после сбора. - После сбора аккуратно верните рыбу в резервуар для восстановления, наполненный системной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите рыбу обратно в темный бак шкаф для будущей коллекции яйи, когда это необходимо.
4. Мужская коллекция гамет
- Выберите мужчину для коллекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть нет внешне видимых признаков мужского качества гамет. Тем не менее, рыба должна выглядеть здоровым по внешнему виду перед использованием в этой процедуре. Для проведения различия между самцами и самками взрослого A. mexicanus,метод ватного шарика был использован12. - Обездвижить самца с помощью охлажденной воды и поместите его в положение на спине в увлажненной губке животного держателя. Обездвижить, поместив рыбу в воду системы 4 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 30 секунд или до тех пор, пока рыба не будет обездвижена (т.е. потеря движения жаберных, см. Росс и Росс13 для получения подробной информации).
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро и старайтесь не нагревать рыбу до завершения процедуры. Это может включать в себя периодические погружения в перчатках кончики пальцев в холодную воду или предлагая дополнительную анестезию. Здесь также могут быть использованы и другие методы анестезии (например, МС-22213). В соответствии с руководящими принципами IACUC Института медицинских исследований Stowers, ручной сбор спермы считается неинвазивной процедурой, которая не требует полной анестезии (например, через МС-222). - Пятно брюшной стороне рыбы с деликатной ткани протрите, как контакт с водой активирует milt.
- Аккуратно поместите конец капиллярной трубки на урогенитальное отверстие.
- Изгнать milt, применяя мягкое давление на стороны рыбы с большим и указательным пальцами. Начните дисталь к жабры, двигаясь к урогенитального отверстия.
- Соберите milt в конце капиллярной трубки. Нежное всасывание может быть необходимо с помощью трубки аспиратора. Избегайте любых кала, которые могут быть исключены с milt.
- Распределите милт в пустую 1,5 мл центрифуги трубки и разбавить в два раза объем спермы Extender E400 (см. Таблица материалов). Продолжайте на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Milt от множественных мужчин может быть объединено совместно если специфически данные parentage не необходимы. Этот шаг может быть использован для продления рабочего времени milt на несколько часов, но он не требуется для немедленного оплодотворения. - После сбора аккуратно верните рыбу в резервуар для восстановления, наполненный системной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите рыбу обратно в темный бак шкаф для будущей коллекции спермы, когда это необходимо.
5. Экстракорпоральное оплодотворение
- Использование новой пипетки для каждого запаса, смешать сперму путем pipetting и / или агитации стороне трубки до оплодотворения, как сперма в milt может поселиться в e400 решение с течением времени.
- Распределите раствор milt или расширенного milt в свежесобранную яйцу.
- Быстро добавьте 1 мл системной воды в сцепление, чтобы активировать сперму и яйцеклетки для оплодотворения. Избегайте смешивания или агитации содержимое блюда и позволяют 2 мин для оплодотворения происходит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание и агитация значительно снижает уровень оплодотворения и, следовательно, следует избегать14. - Добавить E2 Embryo Media, чтобы заполнить блюдо 2/3rd полный.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от последующей процедуры, эмбрионы могут быть использованы сразу (например, для инъекций генетических конструкций, как описано до15),или эмбрионы могут быть инкубированы в E2 Embryo Media при 23 градусах Цельсия, пока они не достигнут 5 dpf. На данный момент перенос эмбрионов в основную рециркуляционную систему жилищного строительства с использованием системной воды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол в основном основан на ранее опубликованном протоколе6. Однако, так как A. mexicanus нерестится в ночные часы, мы разработали стойку для рыбоводства, которая может изменить фотопериод независимо от рабочего времени (рисунок1). Цикл рыбного света изменяется в полностью замкнутой, проточной системе аквакультуры, содержащей три ряда цистерн(рисунок1). Каждый бак содержит независимый нагревательный элемент, который используется для ручного повышения температуры во время процесса грунтовки. Отдельные полки могут быть помещены на отдельные фотопериоды и могут быть закрыты, чтобы предотвратить свет от входа или побега. Все фотопериоды можно манипулировать с помощью автоматизированного контроллера, расположенного на стороне стойки светового цикла. Для доступа в темное время суток стойка оборудована красным рабочим светом и затемненными шторами. A. mexicanus нерестится после повышения температуры от 23 до 26 градусов с приращением 1,5 градуса по Цельсию в день16. Для достижения этой цели в наших темных шкафах, мы использовали погружные аквариумные обогреватели в каждом резервуаре(рисунок 1).
Ключевым фактором успешной процедуры ЭКО в A. mexicanus является качество собранной яйты. Gravid, самки рыб с большими, выступающими животами, скорее всего, высвобождают жизнеспособную яйцы, которые кажутся четкими и даже по внешнему виду(рисунок 2a-d). Добавление собранного милт к такой ova приводит к развитию оплодотворенных эмбрионов обычно в течение 20-30 мин(рисунок 2e). Жизнеспособные оплодотворенные эмбрионы станут немного более полупрозрачными перед входом в одну клеточную стадию цикла развития, в то время как неоплодотворенная яэ окажется более неравномерной и непрозрачной(рисунок 2e). В результате эмбрионы удерживаются в чашках Петри в iRC E2 Embryo Media и инкубируются при 23 градусах Цельсия в светлом/темном цикле 14/10 градусов по Цельсию. Эмбрионы затем передаются в основную рециркуляционную систему жилищного строительства на 5 дней после оплодотворения для воспитания.
Чтобы продемонстрировать важность техники, мы покажем, как фенотипирование гибридов для конкретных признаков, таких как размер глаз и пигментация тела может помочь в расшифровке их генетической основы. Пещерные рыбы четко отличаются от поверхностных рыб своим размером глаз и пигментацией тела. Чтобы понять генетическую основу этих черт, мы пересекли поверхность и пещеру (F0) и создали гибридные популяции F1 и F2 с помощью ЭКО для наблюдения за полученными фенотипическими изменениями(рисунок 3). Размер глаз меньше в поколении F1, что указывает на то, что наличие глаз является частично доминирующей чертой(рисунок3). В поверхностных пещерах F2 гибридов, мы получаем широкий спектр размеров глаз, указывая, что Есть несколько локусов, которые контролируют размер глаз в A. mexicanus, что делает его количественной чертой (Рисунок 3). Другим примером является пигментация. Наблюдая f1 гибрид поверхности и пещеры, можно сделать вывод, что пигментация тела является доминирующей чертой, как рыбы полностью пигментированные(Рисунок 3). В поколении F2 изменение пигментации тела снова указывает на количественную черту. Сочетание этих фенотипических данных с данными секвенирования может выявить основные генетические локусы, ответственные за эти фенотипы. Эти f2 популяций являются хорошим ресурсом для понимания генетической основы различных черт и такие популяции были использованы ранее для изучения этих черт17,18,19. Стандартизированная методика ЭКО может значительно упорядочить генерацию гибридов, позволяя генетическое отображение локутов, контролирующих такие черты, и помогая нам понять, как некоторые фенотипы невыгодны в некоторых средах обитания и адаптивны в других.
Рисунок 1 : Дизайн стеллажей для переноса дневных/ночных циклов А. Мексикан . () Общая установка этой системы стойки позволяет фотопериод манипуляции, давая моделирование ночного времени в дневные часы, когда двери закрыты, и полка огни выключены. (b) Примыкать рыбу для стимулирования созревания яйцы достигается с помощью погружных обогревателей (см. ТаблицаМатериалов), установленных в отдельных резервуарах, которые могут быть отрегулированы отдельно (красные стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Примеры подходящих самок для сбора яйцы и репрезентативная иллюстрация жизнеспособной и нежизнеспособной яйцы. () Gravid, самки рыб с большими, выступающими животами больше подходят для ручной коллекции яйцы, чем (b) самки с обтекаемой формы живота. (c) жизнеспособная яйц (т.е. яйц из жизнеспособных эмбрионов при оплодотворении) может быть идентифицирована по их четкому, даже внешнему виду, в то время как нежизнеспособная яйма (т.е. невыраяжизненные эмбрионы при оплодотворении), как показано в (d), у неподвижного Внешний вид. (e) После успешного оплодотворения жизнеспособные эмбрионы становятся более полупрозрачными и входят в одну клеточную стадию, в то время как неоплодотворенная яйца (красные стрелки) будет медленно распадаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Генетический анализ размера глаз и пигментации тела черты. Родословная, показывающая фотографии родительских (F0) поверхностных рыб (вверху слева) и пещерных рыб (вверху справа), гибридов F1 (второй ряд) и гибридов F2. Рыба F1 имеет промежуточный размер глаз и полностью пигментирована, в то время как рыбы F2 демонстрируют широкое изменение двух морфологических признаков: размера глаз и пигментации. Все исходные данные, лежащие в основе этой цифры, можно получить из хранилища исходных данных Stowers original в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя ЭКО является стандартизированным методом для многих различных типовых организмов, таких как зебрафиш, существующие протоколы для A. mexicanus не принимают во внимание, что этот вид естественным образом нерестится в ночные часы6. Учитывая, что пещерные рыбы и поверхностные рыбы довольно резко различаются по своим циркадным ритмам, цикл созревания яйцы также отличается между пещерными и поверхностными морфотипами. В то время как постановка температуры и раз для поверхности A. mexicanus хорошо изучены12, пещерные рыбы могут отличаться в их нерестового поведения и цикла созревания. Обычные методы гибридного производства поэтому очень сложные и неопределенные из-за потери циркадного ритма в пещере морфотипа A. mexicanus7, что приводит к изменению времени нереста этих рыб. Смещая фотопериод, мы можем предоставить время специфических гибридных эмбрионов, не полагаясь на редкие природные явления нереста между двумя морфотипами. Сохранение пещеры и поверхности рыбы отдельно также предотвращает агрессивные поверхностные морфы от оказывает неблагоприятное воздействие на размножение.
Некоторые ограничения существуют с этим методом, таких как изменения в качестве яйцы. Идентификация самки (поверхности или пещеры) со зрелой ova не тривиальна и требует тщательного наблюдения за поведением рыбы. Как правило, gravid женщины готовы к нересту имеют большие животы и будет неоднократно щеткой против нижней поверхности бака или эмбриона сбора ловушки20.
Мы заметили, что качество спермы соответствует на протяжении всего дня / ночи цикла. Критическим шагом успешного ЭКО (успешного с точки зрения генерации оплодотворенных эмбрионов) является получение хорошего качества, жизнеспособной яйцы. Поэтому крайне важно собирать яйец из рыбы, которая вот-вот нерестится естественным путем(рисунок 2а). После того, как яйцеобразовать яйцеобразовать, их можно наблюдать под микроскопом вскрытия, чтобы изучить качество. Сбор жизнеспособной яйты в ночное время, однако, неудобно и сложной для исследователя. Установка, которую мы представляем здесь, позволяет смещать цикл созревания яйцеклетки, поэтому ЭКО может быть использовано для создания синхронизированных эмбрионов для применения ниже по течению в обычное рабочее время.
С развитием криоконсервации milt (например, как это описано в зебрафиш21),ЭКО станет мощным инструментом для создания и поддержания генетических линий для формирующейся модели системы A. mexicanus. В сочетании с методами генетической модификации15 и морфолино основе нокдаун17, эти процедуры обеспечат методологическую платформу для изучения генетических и развития основы адаптации к различным среды обитания в A. mexicanus.
Таким образом, представленный здесь протокол позволит провести синхронизированные эмбрионы A. mexicanus для других применений, таких как инъекция генетических конструкций или изучение ранних эмбриональных фенотипов. Основная сила протокола заключается в том, что он позволяет эффективно едимовать гибриды поверхностных пещер, которые могут быть использованы для генетической карты фенотипических различий между поверхностными рыбами и пещерными рыбами с помощью анализа tL (количественных локсов черты. В совокупности получение жизнеспособной яйты в дневное время для ЭКО является мощным методом, который будет полезен для различных будущих исследований в различных областях биологических наук.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Филиппа Ногеру и Кимберли Блэнд за поддержку в видеопродукции. Авторы также хотели бы отметить всю команду водных видов спорта Института Stowers для животноводства. Эта работа была поддержана институциональным финансированием DPB и NR. NR была поддержана Фондом Эдварда Маллинкродата и JDRF. РП была поддержана грантом от Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
