Summary
Ici, nous présentons une méthode pour la culture ex vivo de longs os murins aux stades fœtal et nouveau-né, approprié pour analyser le développement osseux et le cartilage et l’homéostasie dans des conditions contrôlées tout en récapitulant le processus in vivo.
Abstract
Les os longs sont des structures complexes et dynamiques, qui résultent de l’ossification endochondrale via un intermédiaire de cartilage. L’accès limité à des os humains sains rend particulièrement utile l’utilisation de modèles de mammifères, tels que la souris et le rat, pour examiner différents aspects de la croissance osseuse et de l’homéostasie. En outre, le développement d’outils génétiques sophistiqués chez la souris permet des études plus complexes de la croissance osseuse longue et demande une expansion des techniques utilisées pour étudier la croissance osseuse. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la culture osseuse murin ex vivo, qui permet l’étude de l’os et du cartilage d’une manière étroitement contrôlée tout en récapitulant la plupart du processus in vivo. La méthode décrite permet la culture d’une gamme d’os, y compris le tibia, le fémur et les os métatarsiens, mais nous nous sommes concentrés principalement sur la culture tibiale ici. En outre, il peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques, telles que l’imagerie en direct Time-lapse ou le traitement médicamenteux.
Introduction
La croissance de l’organe doit être étroitement accordée pour prévenir l’apparition de troubles de la croissance, et implique la régulation de plusieurs types de cellules, voies moléculaires et Diaphonie entre les différentes parties du corps. Les techniques d’imagerie sont essentielles pour remédier aux changements survenant au fil du temps dans un embryon en croissance, dans des conditions normales, ainsi qu’après une perturbation est induite dans le système. Les embryons avec développement intra-utérin, comme les modèles de rongeurs largement utilisés, présentent un défi supplémentaire pour l’imagerie en direct et le traitement médicamenteux, qui peut être partiellement surmonté en utilisant des techniques de culture ex vivo. Pour récapituler avec succès les processus in vivo et obtenir des résultats significatifs, il devient crucial de trouver les bonnes conditions culturantes pour chaque organe ou tissu.
La plupart des os du squelette mammalien poussent à travers l’ossification endochondrale, où le cartilage embryonnaire (composé de cellules appelées chondrocytes) entraîne une croissance longitudinale et est graduellement remplacé par l’OS. Ce processus se déroule aux plaques de croissance, situées à la fin des longs os, où trois zones peuvent être distinguées: repos, proliférative et hypertrophique1,2. Tout d’abord, les chondrocytes ronds de progéniteur dans la zone de repos se transforme en chondrocytes en colonnes cycloaires dans la zone proliférative. Au cours de la prochaine étape de différenciation, ces chondrocytes deviennent hypertrophiques et commencent à sécréter le collagène de type X. Les chondrocytes hypertrophiques orchestrent les étapes suivantes de l’ossification: ils sécrètent des molécules de signalisation clés, telles que le facteur de croissance du tissu conjonctif, les protéines morphogénétiques des os et le hérisson indien, et dirigent la minéralisation de la matrice, recrutent les vaisseaux sanguins de la partie centrale de l’OS, et, sur l’apoptose, permettent aux ostéoblastes (cellules formant des os) d’envahir la matrice pour former le centre d’ossification primaire3,4. La matrice minéralisée facilite la pénétration des vaisseaux sanguins à travers lesquels les ostéoblastes migrent pour remplacer ce cartilage dégradé par une matrice osseuse5. La plupart des ostéoblastes envahissent la matrice du cartilage du périchondrium, une couche fibreuse qui enveloppe le cartilage6. Alternativement, une proportion de chondrocytes hypertrophiques sont capables de survivre et de se transdifférencier en ostéoblastes7,8,9. La longueur finale de l’OS est due à la croissance accumulée du cartilage transitoire, dont le taux de croissance dépend à son tour du nombre et de la taille des chondrocytes hypertrophiques, et de leur production matricielle10. En outre, il a été récemment montré que la durée de la dernière phase d’hypertrophie est corrélée avec la longueur finale de l’OS11. Par conséquent, une régulation serrée de la prolifération et de la différenciation de ces cellules est nécessaire pour assurer une taille osseuse appropriée.
Malgré les connaissances substantielles acquises au fil des ans sur l’organisation et le développement des plaques de croissance, la plupart de ces conclusions reposent sur l’observation de sections histologiques fixes. Le sectionnement tissulaire fournit des informations précieuses sur ce processus, mais peut être monté avec des artefacts techniques, de sorte qu’il ne peut pas être toujours utilisé de manière fiable pour estimer les changements morphologiques ou de taille entre les différentes étapes. En outre, comme la croissance osseuse est un processus dynamique, les images statiques en deux dimensions (2D) offrent un aperçu limité du mouvement des cellules dans la plaque de croissance, tandis que l’imagerie Time-lapse sur les tissus vivants pourrait offrir des informations précieuses sur le comportement de la chondrocytes dans la plaque de croissance.
Toutes ces limitations peuvent être potentiellement résolues à l’aide de cultures osseuses ex vivo. Alors que les protocoles de culture osseuse ont été développés il y a quelque temps, ils ont été appliqués de près aux os longs murins. La plupart des études utilisent Chick Bones en raison des avantages techniques offerts par le poussin modèle12,13. Des cultures organotypiques (interface air/liquide) ont été appliquées aux fémurs embryonnaires de poussins, qui ont été maintenus en culture pendant 10 jours14. Les outils génétiques sophistiqués disponibles dans la souris rendent ce modèle très attrayant pour être utilisé dans la culture osseuse ex vivo. Les études qui utilisaient des souris pour examiner la croissance osseuse travaillaient principalement avec des os métatarsiens15, probablement en raison de leur petite taille et de plus grands nombres obtenus par embryon16. Bien que traditionnellement considérés comme des os longs, les métatarsiens entrent dans la sénescence (caractérisée par une réduction de la prolifération et de l’involution de la plaque de croissance17) plus tôt que d’autres os longs in vivo, et par conséquent leur croissance continue ex vivo ne vraiment récapituler le processus in vivo. Aux fins du présent article, nous utiliserons le terme «os longs» pour les os des régions proximales et des membres intermédiaires. Plusieurs études antérieures utilisaient de longs os murins, comme le tibia, dans des cultures ex vivo et observaient une croissance substantielle du cartilage mais peu d’ossification18. Nous avons également utilisé les cultures tibiales récemment, principalement pour étudier la dynamique des chondrocytes19. D’autres études ont utilisé des têtes fémorales de jeunes souris20 ou seulement la partie distale du fémur pour la culture21. Quelques travaux plus récents combinent avec succès la culture ex vivo des os complets avec l’imagerie Time-lapse pour acquérir des films tridimensionnels (3d) de chondrocytes dans le tissu de souris vivant22,23. Les auteurs ont réussi à observer des événements précédemment inaperçus dans le réarrangement des chondrocytes à la zone proliférative23 dans un bon exemple de l’application potentielle de la culture osseuse ex vivo. L’alternative, c’est-à-dire l’analyse d’images statiques, nécessite des techniques indirectes et complexes. Cela a été illustré par une étude récente évaluant l’importance des clones à orientation transversale pour la croissance du cartilage, où le traçage génétique avec des souches de souris de reporter multicolore couplé avec la modélisation mathématique ont été utilisés24. Par conséquent, la culture ex vivo peut aider à mieux comprendre les processus dynamiques de manière plus rapide et plus directe.
Ici, nous présentons une méthode pour la culture des os longs murins, qui peut être combinée avec différents traitements moléculaires et/ou avec l’imagerie en direct Time-lapse. Ce protocole adapte les méthodes utilisées dans les rapports précédents15,18,25, mais aborde quelques problèmes supplémentaires et se concentre sur les os longs tels que le tibia, plutôt que les os métatarsiens. Enfin, il explore le potentiel d’utiliser des comparaisons appariées statistiquement puissantes en cultivant les os gauche et droit séparément en présence de différentes substances.
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Protocol
Toutes les expériences doivent être menées suivant les directives locales gouvernementales et institutionnelles de la manipulation éthique des animaux de laboratoire.
1. préparations avant la journée de la culture osseuse
- Configurez les accouplements de souris chronométrés pour obtenir des foetus et des chiots du jour embryonnaire 14,5 (E 14.5) et en avant.
Remarque: La culture des os longs peut être appliquée avec succès à différentes souches de souris; dans le présent protocole, on utilise des souris de type sauvage Swiss Webster surlignées. - Préparer le milieu de dissection (adapté de Houston et al.15): diluer le milieu α-minimum essentiel (α-MEM) ou le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (dmem) 1/13 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mg/ml de sérum albumine bovine (BSA) et stériliser le filtre par un filtre à seringue de 0,22 μM, 33 mm de diamètre. Stocker les aliquotes à-20 ° c.
- La veille de l’extraction des foetus, préparer le milieu de culture osseuse sans sérum composé de DMEM contenant 0,2% de BSA, 0,5 mM de L-glutamine, 40 U/mL de pénicilline/streptomycine, 0,05 mg/mL d’acide ascorbique et 1 mM de betaglycérophosphate. Filtrer stériliser par un filtre à seringue de 0,22 μM, 33 mm de diamètre et conserver à 4 ° c pendant 1 mois.
- Le jour de la culture et avant l’abattage de la souris, préparez des plaques de 24 puits et des plats de 60 mm avec un milieu de dissection et gardez-les froids. Préchauffer le milieu de culture osseuse dans un bain d’eau 37 ° c. Vaporisez 80% (v/v) d’éthanol sur les outils (pinces et petits ciseaux) à utiliser pour la manutention du fœtus. Transférer une lunette binoculaire vers une armoire de biosécurité de classe II.
2. culture du fœtus et du nouveau-né tibia et fémur
- Cull la souris enceinte à travers la dislocation cervicale au stade gestationnel désiré (allant de E 14.5 à E 18.5). Si les chiots nouveau-nés sont utilisés, les retirer de la mère un par un et l’abattage par décapitation.
- Placez la souris sur son dos et stériliser la région abdominale en pulvérisant 80% (v/v) d’éthanol sur sa surface.
- Coupez la peau et le muscle abdominal avec de petits ciseaux pour accéder aux cornes utérines.
- Extraire l’utérus de la cavité abdominale à l’aide de pinces et de petits ciseaux, en enlevant le mésoomètre et en coupant la base des cornes. Placer l’utérus dans une boîte de Petri de 60 mm avec un milieu de dissection glacé et garder le plat de culture sur la glace pendant toute la procédure.
- Transférer la boîte de Petri avec l’utérus à l’armoire de biosécurité et y travailler à partir de maintenant.
- Séparer les fœtus individuels avec des ciseaux en coupant entre les sacs.
- Transférer le sac individuel sous un stéréomicroscope de dissection dans un plat de 60 mm propre avec un milieu de dissection et les ouvrir avec des pinces pour séparer les foetus des placentas et les nettoyer des membranes.
Remarque: Travailler avec un embryon à la fois, tout en gardant le reste sur la glace. - Décapiter les fœtus et transférer le corps à un nouveau plat 60 mm propre avec une pipette stérile coupée de 1 mL.
- Enlevez la peau des fœtus ou des chiots avec une pince à épiler en commençant par l’arrière et en l’épluchant jusqu’aux orteils.
- Séparer les membres postérieurs du corps en coupant avec la pince à épiler près de la colonne vertébrale et les transférer à un plat propre avec le milieu de dissection de glace froide.
- Séparer le tibia du fémur avec des pincettes en les introduisant avec précaution entre le cartilage de surface du fémur distal et du tibia proximale.
- Enlevez les os de la hanche du fémur proximale et de l’os de calcanéum et du péroné du tibia.
- Enlevez délicatement les tissus mous du fémur et du tibia en les enlevant et en les tirant.
Remarque: Il est important d’enlever autant de tissus mous que possible, en prenant un soin particulier en enlevant le tissu qui relie les deux pôles de cartilage, mais en évitant d’endommager le cartilage, le périchondrium, et les os. - Placer les quatre OS (tibias gauche et droit et fémurs) dans le premier puits de la plaque de 24 puits avec une pipette stérile en plastique de 1 mL. Alternativement, pour comparer l’effet de différents traitements sur les membres gauche et droit, placer des membres contralatéraux dans différents puits.
Remarque: Des précautions supplémentaires doivent être prises lorsque les os sont transférés dans les puits, car ils peuvent facilement s’en tenir à la pipette. - Procédez de la même façon avec autant de fœtus que nécessaire.
Remarque: Changez le plat avec le milieu de dissection dès qu’il devient trop obscurci, car il est important de voir clairement les os dissédés. -
Lorsque tous les os désirés sont transférés dans les puits, retirer le milieu de dissection avec une pipette en plastique de 1 mL stérile et prendre soin de ne pas aspirer les os.
- Selon le but de l’expérience, des images peuvent être prises des os avant de retirer le milieu de dissection, comme point de temps zéro de l’expérience. Prendre des photos avec un microscope attaché à un appareil photo numérique et annoter l’exposition et l’échelle utilisée. Pour assurer des mesures simples et fiables, prenez des photos avec un bon contraste pour distinguer la partie minéralisée.
- Ajouter 1 mL de milieu de culture à chaque puits. Si un traitement est prévu sur les os (Doxycycline, tamoxifène, facteurs de croissance, etc.), il doit être ajouté maintenant.
- Pour observer l’effet de l’inhibition de la croissance dans les conditions de culture, traiter le tibias gauche avec de l’acide rétinoïque (RA, 500 nM), tout en incubant le tibias droit avec un volume équivalent de véhicule (diméthyl sulfoxyde [DMSO], concentration finale 0,1%) comme un contrôle.
- Laisser les os croître pendant deux jours ou plus dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions de culture cellulaire standard (à 37 ° c dans un incubateur de 5% CO2 ).
- Pour évaluer la prolifération, ajouter la 5-éthynyl-2 '-désoxyuridine (EdU) ou la 5-bromo-2 '-désoxyuridine (BrdU) au milieu à une concentration finale de 10 μM 1 − 2H avant la fixation.
Remarque: La concentration en stock d’EdU est de 20 mM.
Attention: EdU et BrdU sont des analogues de la thymidine et peuvent être toxiques et mutagènes. - Décongeler 4% de paraformaldéhyde (PFA) et fixer les os par immersion en PFA dans des tubes individuels de 2 mL.
Attention: L’PFA est toxique et désigné comme cancérogène probable pour l’homme. Évitez de respirer la poudre et les vapeurs de paraformaldéhyde. EdU et BrdU sont des analogues de la thymidine et peuvent être toxiques et mutagènes. - Après une brève fixation de 10 min en PFA à la température ambiante, transférer les os au PBS pour l’acquisition d’images à la fin du temps. Replacez ensuite les os dans l’IFP pour une fixation de nuit à 4 ° c.
- Après la fixation des os peuvent être traitées pour les applications en aval souhaitées.
3. mesure et analyse de la pleine longueur de l’os et de la région minéralisée
- Utilisez un logiciel de retouche d’image pour mesurer la longueur des os, en tenant compte de l’échelle de l’image. Mesurez la longueur totale de l’os et de la région minéralisée. Commencez les mesures à partir des premières cellules sombres à une extrémité jusqu’à ce que les dernières à l’autre extrémité.
Remarque: La région minéralisée est caractérisée par la couleur plus foncée et se distingue facilement du cartilage. - Pour calculer le taux de croissance, défini comme l’augmentation moyenne de la longueur par jour, divisez la différence entre la longueur finale de l’os et celle initiale par le nombre de jours dans la culture.
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Representative Results
La culture osseuse peut être réalisée à partir de différentes étapes. Dans la figure 1a-D, on montre une comparaison entre le tibia cultivé et les fraîchement extraits à des stades équivalents. La première observation est que jusqu’à deux jours de culture, la taille obtenue est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé (figure 1a, B, D). Des périodes de culture plus longues conduisent à de plus grandes différences entre les os cultivés et le fraîchement extrait (figure 1c). En outre, comme mentionné dans le protocole, il est crucial d’enlever le tissu mou reliant les deux extrémités des os, comme autrement les os se plieront. La figure 1e montre un exemple de Tibia cultivé avec une ablation incomplète des tissus mous versus un Tibia sans tissu mou.
Ensuite, les tibias ont été cultivés pendant 2 jours et leur longueur a été mesurée. Comme on peut le voir dans la figure 2a, B, la mesure de la longueur totale et de la partie minéralisée peut être réalisée avec un logiciel d’analyse d’image. Comme le montre de Luca et coll.26, le traitement par RA a un fort effet sur la croissance du tibias déjà après 2 jours de traitement et un résultat similaire a été observé dans nos cultures (figure 2b-D). Fait important, l’expérience a été réalisée à l’aide d’os appariés, avec l’OS droit comme contrôle et la gauche traitée avec RA (figure 2a, B, E), ce qui aide à surmonter la variabilité naturelle de la taille osseuse entre les différents spécimens. Ainsi, la méthode culturante décrite est appropriée pour évaluer l’effet de différents composés sur la croissance osseuse.
Ensuite, le taux de croissance des os après la culture a été évalué. Les os ont été extraits, mesurés et cultivés à E 15.5, 16,5 ou P1, et fixés et mesurés à nouveau deux jours plus tard. L’augmentation totale de la longueur et la longueur de la partie minéralisée ont été mesurées (figure 3C). Un exemple de E 15.5 tibia et fémur avant la culture (figure 3A) et au point final de l’expérience (figure 3b) sont montrés. Comme on peut le constater à partir du graphique et du tableau (figure 3C, D), il y a une augmentation constante de la longueur totale du tibia, ce qui correspond à une augmentation approximative de 9 − 29% par rapport à la longueur initiale. C’est moins d’augmentation que celle observée in vivo; la principale différence est probablement due au niveau du cartilage proximale, plus grand que le distal et moins accessible aux nutriments. En effet, l’étiquetage EdU a montré moins de cellules positives dans cette région après la culture que les os fraîchement extraits d’un stade équivalent (figure 4a, C). L’incorporation d’EdU dans le tibia distal était similaire dans les os cultivés et fraîchement extraits (figure 4b, D) le cartilage distal contribue approximativement un tiers à la croissance totale du tibia in vivo à ce stade27, comparable au taux de croissance observé dans la culture, nous proposons donc que l’analyse doit être centrée sur cette partie de l’OS. En outre, nous avons évalué la minéralisation des os cultivés, et observons presque aucune augmentation de la longueur de cette région. La différence pourrait être due à l’absence d’invasion de vaisseaux et d’ostéoblastes dans la culture ex vivo. Cela suggère que les études de la croissance du cartilage peuvent s’étendre pendant plusieurs jours, tandis que si la région d’intérêt est la partie ossifiée de l’OS, la période de la culture devrait être plus courte. Cette observation a été confirmée en gardant le tibia dans la culture pour une période plus longue (jusqu’à 6 jours). Comme on peut le voir dans la figure 5, la longueur totale de l’élément squelettique augmente sensiblement, alors que presque aucune augmentation de la région minéralisée n’est observée (Figure 5C).
Globalement, ces résultats suggèrent que la culture des os longs peut être utilisée pour analyser l’effet de différents facteurs sur la croissance osseuse globale et en particulier pour évaluer la dynamique du cartilage. Alors que les cultures métatarsiennes bien établies peuvent également être utilisées à ces fins, nous soumettons que les deux types de cultures se complètent mutuellement, compte tenu des différences intrinsèques entre les métatarsiens et le reste des os longs.
Figure 1: exemple de Tibia cultivé pour différentes périodes de temps. (A-D) Comparaison entre le tibia fraîchement extrait (en haut) et le tibia extrait à E 14.5 (en bas) et cultivé pendant 2 jours (A), extrait à e 15.5 et cultivé pendant 2 jours (B), extrait à e 16.5 et cultivé pendant 4 jours (C) et fraîchement extrait à jour postnatal 2 (P2) et extrait au jour 1 (P1) postnatal et cultivé pendant 1 jour (D). Notez que, bien que la croissance du cartilage reste tout à fait physiologique après différentes périodes culturantes, la partie ossifiée montre un retard de croissance après le temps de culture plus de 2 jours par rapport à l’OS fraîchement extrait à l’étape correspondante. Barre d’échelle = 1 mm. (e) Tibia cultivé pendant 2 jours à partir de e 15.5; Notez que l’enlèvement incomplet du tissu mou entre les deux extrémités des os conduit à la flexion de l’OS. Barre d’échelle = 600 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: mesure de la longueur des os sur le traitement de l’acide rétinoïque (RA). (A-B) Tibias extrait à E 15.5 et cultivé pendant 2 jours avec 0,1% DMSO (A) et RA (B). Notez la différence entre la longueur totale et la partie minéralisée. Barre d’échelle = 1 mm. (c-d) variation de la longueur totale (c) ou de la partie minéralisée (d) du tibia sur une période de 6 jours en situation de contrôle et en présence de RA. Les résultats sont indiqués comme moyenne ± écart type (SD); comparaison se fait par analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec le type de traitement comme variable (les valeursp sont affichées dans le graphique). (E) Comparaison de la longueur des os appariés cultivés pendant 2 jours avec le DMSO (tibia droit) ou le RA (tibia gauche); chaque point représente l’un des 3 réplicats biologiques par condition. Le test tdes étudiants à deux queues appariés a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Comparaison de la croissance totale et de la minéralisation du tibia après 48 heures de culture ex vivo. A) e 15.5 tibias et fémurs des membres gauche (haut) et droit (inférieur) avant la culture. (B) les mêmes tibias et fémurs suivis après 2 jours de culture. Barre d’échelle = 600 μm. (C) graphique représentant le taux de croissance des tibias cultivés à différents stades de développement. La croissance totale et la croissance de la partie minéralisée ont été évaluées. (D) tableau montrant la longueur initiale et finale de l’OS entier et la partie minéralisée avant la culture à l’e 15.5 et après 2 jours d’élevage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Les plaques de croissance volumineuses ne montrent pas beaucoup de prolifération dans la culture. (A-B) Coloration EdU pour les plaques de croissance proximale (A) et distale (B) tibiale cultivées à partir de e 15.5 pendant 2 jours. (C-D) Coloration EdU pour les plaques de croissance proximale (C) et distale (D) tibiale fraîchement extraites à e 17.5. Notez la différence dans le nombre de cellules EdU (+) dans le tibia proximale. Les données comprennent 6 paires de branches cultivées et 3 fraîchement extraites. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: des périodes plus longues de culture du tibia montrent une croissance substantielle du cartilage mais peu de minéralisation. Tibia fraîchement extrait à E 15.5 (t = 0) (A) et après 6 jours de culture (B). Notez les différences entre la croissance du cartilage et la croissance de la partie minéralisée. Barre d’échelle = 1 mm (C) graphique montrant les variations de la longueur totale et de la région minéralisée sur une période de 6 jours. n = 5 tibias cultivés; La SD à chaque point de temps est la suivante: t = 0, pleine longueur = 0,0777, minéralisée = 0,0213; t = 3 d, pleine longueur = 0,1495, minéralisé = 0,056; t = 6 d, pleine longueur = 0,1193, minéralisé = 0,0521. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les méthodes de culture osseuse ex vivo ont été utilisées pendant un certain temps pour évaluer la biologie de la croissance osseuse28, mais ont été rarement appliquées à des os longs murins. Avec le développement de techniques d’imagerie, la culture osseuse ex vivo offre un moyen attrayant d’étudier la croissance osseuse en temps réel dans un cadre ressemblant étroitement aux conditions in vivo. Dans ce scénario, il est important de définir les conditions dans lesquelles la croissance des os longs est comparable à leur croissance in vivo.
Dans la présente étude, nous décrivons un protocole simple et abordable pour la longue culture osseuse, en abordant les limitations et les applications possibles. L’étape la plus critique de cette méthode est l’isolement des os, qui doivent rester intacts et avec moins de tissu mou entre les extrémités de l’OS que possible. Laisser les tissus mous entre les extrémités des os empêchera la croissance normale de l’os et induisent la flexion, comme l’illustre la figure 1e. Les tissus mous aux extrémités des os peuvent être laissés, car il finira par disparaître. Une autre étape qui nécessite un soin supplémentaire est le transfert des os à la plaque culturante, car ils peuvent facilement coller à la pipette en plastique. Une solution possible est le pipetage du milieu de dissection contenant du sang et des morceaux de tissu, car il crée un revêtement qui aide à empêcher les os de coller à la pipette.
Une fois extraites, les os atteignent une taille comparable à la phase in vivo correspondante lorsqu’ils sont cultivés jusqu’à 48 h. en dehors de la mesure de la longueur de l’OS, le taux de croissance (augmentation moyenne de la longueur par jour) peut être estimé facilement dans ces conditions. Toutefois, cette approche pour le calcul du taux de croissance n’est pas valide sur des périodes de culture plus longues, où d’autres méthodes, telles que l’étiquetage de la calcéine29, doivent être utilisées. Le traitement par l’acide rétinoïque, qui favorise la différenciation prématurée des chondrocytes, conduit à une réduction substantielle de la croissance des os, suggérant que cette fois pour la culture est suffisant pour observer l’effet que différentes substances pourraient avoir sur les os croissance. Fait important, la comparaison a également été faite sur les os appariés du même spécimen, de sorte que le tibia gauche a reçu le traitement RA et le droit était le contrôle. Il s’agit d’un avantage du modèle de culture osseuse, car il permet d’effectuer des comparaisons appariées, qui sont statistiquement plus puissantes.
Culturing pour plus de temps montre une croissance significative de la partie du cartilage, mais un retard dans la croissance de la minéralisée, et il est important de considérer ce résultat lors du choix de l’application de la technique. Des résultats similaires ont été observés chez des fémurs de poussins cultivés jusqu’à 10 jours qui montrent une région d’épiphysaire élargie et un col d’os diaphysaires réduit14, ainsi que dans le tibia de souris cultivé pendant 6 jours18. En outre, il est important de mentionner que dans la région du cartilage, la croissance n’est pas non plus homogène: la région distale encombrante du fémur et la région proximale du tibia ne reçoivent pas les nutriments efficacement par simple diffusion et ne peuvent pas croître correctement. Dans ce contexte, les études devraient se concentrer sur les plaques de croissance opposées, qui ont été estimées à contribuer à un tiers de la croissance totale27, semblable à la croissance observée dans la culture. Le retard dans la croissance des os cultivés a également été décrit pour les cultures métatarsiennes15.
Une considération importante de ce type de culture est l’absence de croissance de la partie ossifiée de l’OS. Il est bien établi que les ostéoblastes envahissent la matrice du cartilage du périoste en même temps que les vaisseaux sanguins3,4 et ce processus est évidemment perturbé lorsque l’OS est isolé. Cela pourrait expliquer l’absence d’ossification dans les conditions de culture. La transdifférenciation des chondrocytes hypertrophiques a également été montrée comme une source importante d’ostéoblastes7,8,9, mais si ce processus exige également en partie la présence de vaisseaux sanguins, comme il semble le faire pendant la guérison des fractures30, ou d’autres tissus non présents dans les cultures ex vivo, nécessite une enquête plus approfondie. En outre, il est bien décrit l’importance de la charge mécanique dans la formation de la croissance osseuse31,32, qui influe sur les os longs et les os métatarsiens différemment, mais est absent dans une installation de culturation ex vivo. Néanmoins, la méthode de culturage décrite est appropriée pour mesurer la dynamique des chondrocytes et les changements dans la croissance longitudinale et, par conséquent, peut être utilisé pour certaines applications.
Dans l’ensemble, le protocole décrit fournit une méthode simple et bon marché pour la culture des os longs à partir de différentes étapes, qui peuvent être couplées avec des techniques supplémentaires pour traiter les mécanismes cellulaires et moléculaires clés, tels que l’imagerie Time-lapse en direct13 , 23 ou un traitement médicamenteux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous aimerions remercier Alexandra Joyner pour son soutien lorsque ce protocole a été établi, Edwina McGlinn et Yi-Cheng Chang pour le partage de l’acide rétinoïque. L’Institut australien de médecine régénérative est appuyé par des subventions du gouvernement de l’état de Victoria et du gouvernement australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
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