Summary
Här presenterar vi en metod för ex vivo-odling av långa murina ben på både foster och nyfödda stadier, lämplig för att analysera skelett-och brosk utveckling och homeostas under kontrollerade betingelser samtidigt som den återger in vivo-processen.
Abstract
Långa ben är komplexa och dynamiska strukturer, som uppstår från endochondral ossifiering via ett brosk mellanliggande. Den begränsade till gången till friska mänskliga ben gör särskilt värdefullt användningen av däggdjurs modeller, såsom mus och råtta, att undersöka olika aspekter av ben tillväxt och homeostas. Dessutom, utveckling av sofistikerade genetiska verktyg i möss tillåter mer komplexa studier av långa ben tillväxt och ber om en expansion av tekniker som används för att studera ben tillväxt. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för ex vivo murina ben kultur, som gör det möjligt att studera ben och brosk på ett väl kontrollerat sätt samtidigt som de flesta av in vivo-processen rekapitulera. Metoden beskrivs tillåter kulturen i en rad ben, inklusive Tibia, lårbenet, och metatarsala ben, men vi har fokuserat främst på Tibia kultur här. Dessutom kan den användas i kombination med andra tekniker, såsom Time-lapse Live Imaging eller läkemedels behandling.
Introduction
Organ tillväxt måste vara tätt trimmad för att förhindra uppkomsten av tillväxtstörning, och innebär reglering av flera cell typer, molekyl ära vägar och överhörning mellan olika delar av kroppen. Imaging tekniker är avgörande för att hantera de förändringar som sker över tiden i ett växande embryo, både under normala förhållanden, samt efter en störning framkallas i systemet. Embryon med intrauterin utveckling, såsom de allmänt använda gnagare modeller, presentera en ytterligare utmaning för Live Imaging och läkemedels behandling, som delvis kan övervinnas genom att använda ex vivo kultur tekniker. För att framgångs rikt återkapitulera in vivo-processerna och få meningsfulla resultat blir det avgörande att hitta rätt odlings förhållanden för varje organ eller vävnad.
De flesta benen i däggdjurs skelettet växer genom endochondral ossifiering, där embryonala brosk (som består av celler som kallas kondrocyter) driver longitudinell tillväxt och gradvis ersätts av ben. Denna process sker vid tillväxt plattorna, som ligger i slutet av de långa benen, där tre zoner kan särskiljas: vila, proliferativ, och hypertrofisk1,2. Först, den runda stamceller kondrocyter i vilo zonen över gång till cykling kolumner kondrocyter i proliferativa zonen. Under nästa steg av differentiering, dessa kondrocyter blir hypertrofiska och börja utsöndra typ X kollagen. Hypertrofiska kondrocyter iscensätter efterföljande steg av ossifiering: de utsöndrar viktiga signal molekyler, såsom bindväv tillväxtfaktor, ben morfogenetiska proteiner och indisk igelkott, och direkt mineraliseringen av matrisen, rekrytera blod kärlen till den centrala delen av benet, och, vid apoptos, tillåta osteoblaster (ben-bildande celler) att invadera matrisen för att bilda den primära ben bildning Center3,4. Den mineraliserade matrisen underlättar inträngning av blod kärl genom vilka osteoblaster migrerar för att ersätta detta försämrade brosk med en benmatrix5. De flesta osteoblaster invaderar brosk matrisen från perichondrium, ett fibrösa skikt som sveper in brosket6. Alternativt kan en andel av hypertrofiska kondrocyter överleva och transdifferentiera till osteoblaster7,8,9. Den slutliga längden på benet beror på den ackumulerade tillväxten av övergående brosk, vars tillväxt takten i sin tur beror på antalet och storleken på de hypertrofiska kondrocyter, och deras matris produktion10. Dessutom, det var nyligen visat att varaktigheten av den sista hypertrofi fas korrelerar med den sista längden av benet11. Därför, stram reglering av spridning och differentiering av dessa celler krävs för att säkerställa korrekt ben storlek.
Trots de betydande kunskaper som förvärv ATS under årens lopp på organisering och utveckling av tillväxt plattorna, är de flesta av dessa satser baserade på observation av fasta histologiska avsnitt. Vävnads snittning ger värdefull information om denna process, men kan köras med tekniska artefakter, så det kan inte alltid tillförlitligt användas för att uppskatta morfologiska eller storleks förändringar mellan olika stadier. Dessutom, som ben tillväxt är en dynamisk process, de statiska tvådimensionella (2D) bilder erbjuder en begränsad inblick i förflyttning av cellerna i tillväxt plattan, medan time-lapse Imaging på levande vävnad kan erbjuda värdefull information om beteendet hos chondrocyter i tillväxt plattan.
Alla dessa begränsningar kan potentiellt lösas med ex vivo ben kulturer. Medan ben kultur protokoll har utvecklats för en tid sedan, var de limiterat tillämpas på murina långa ben. De flesta av studierna använder chick Bones på grund av de tekniska fördelar som erbjuds av chick modell12,13. Organotypiska kulturer (luft/flytande gränssnitt) tillämpades på chick embryonala femurs, som upprätthölls i kulturen i 10 dagar14. Den sofistikerade genetiska verktyg som finns i musen gör denna modell mycket tilltalande att användas i ex vivo ben kultur. De studier som använde möss för att undersöka ben tillväxt fungerade mest med metatarsala ben15, troligen på grund av sin ringa storlek och större antal erhållits per embryo16. Även traditionellt anses långa ben, metatarsi ange åldras (kännetecknas av minskad proliferation och Involution av tillväxt plattan17) tidigare än andra långa ben in vivo, och därför deras kontinuerliga tillväxt ex vivo inte verkligen upprepa in vivo-processen. Vid tillämpningen av denna artikel, vi kommer att använda termen långa ben för ben från proximala och mellanliggande extremiteterna regioner. Flera tidigare studier används långa murina ben, såsom Tibia, i ex vivo kulturer och observerade en betydande ökning av brosk men liten ben bildning18. Vi använde också Tibia kulturer nyligen, främst för att studera chondrocyte Dynamics19. Andra studier används femurhuvuden från unga möss20 eller bara den distala delen av lårbenet för kultur21. Några nyare arbeten framgångs rikt kombinera ex vivo kultur full ben med time-lapse Imaging att förvärva tredimensionella (3D) filmer av kondrocyter i levande mus vävnad22,23. Författarna lyckades Observera tidigare obemärkt händelser i omplaceringen av chondrocyter till proliferativ zon23 i ett bra exempel på den potentiella tillämpningen av ben ex vivo kultur. Alternativet, d.v.s. analysera statiska bilder, kräver indirekta och komplexa tekniker. Detta exemplifierades av en färsk studie som utvärderar betydelsen av transversally-orienterade kloner för brosk tillväxt, där genetisk spårning med multicolor reporter mus stammar i kombination med matematisk modellering användes24. Därför kan ex vivo-kulturen hjälpa till att få insikt i dynamiska processer på ett snabbare och enklare sätt.
Här presenterar vi en metod för murina långa ben kultur, som kan kombineras med olika molekyl ära behandlingar och/eller med time-lapse Live Imaging. Detta protokoll anpassar de metoder som används i tidigare rapporter15,18,25, men tar upp några ytterligare frågor och fokuserar på långa ben såsom Tibia, snarare än metatarsala ben. Slutligen undersöker den potentialen att använda statistiskt kraftfulla Parade jämförelser genom odling av vänster och höger ben separat i närvaro av olika substanser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment bör utföras i enlighet med de lokala statliga och institutionella rikt linjerna för etisk hantering av försöks djur.
1. förberedelser inför dagen för ben kulturen
- Ställ in tidsinställda mus mattor för att få foster och valpar från embryonal dag 14,5 (e 14.5) och framåt.
Anmärkning: Kulturen av långa ben kan framgångs rikt tillämpas på olika mus stammar; i detta protokoll, utavlade schweiziska Webster vild-typ möss används. - Förbered dissektion medium (anpassad från Houston et al.15): späd α-minimum essentiellt medium (α-MEM) eller Dulbecco ' s modifierade Eagle ' s medium (dmem) 1/13 i fosfatbuffrad SALTLÖSNING (PBS) och 2 mg/ml bovint SERUMALBUMIN (BSA) och filtersterilisera genom ett sprutfilter med 33 mm diameter på 0,22 μm. Förvara Ali kvoter vid-20 ° c.
- Förbered den serum fria ben odlings mediet som består av DMEM-innehåll ande 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 U/mL penicillin/streptomycin, 0,05 mg/mL askor bin syra och 1 mM betaglycerophosphate dagen före extraktion av fetuses. Filtrera sterilisera genom ett 0,22 μm, 33 mm diameter sprutfilter och förvara vid 4 ° c i upp till 1 månad.
- På dagen för kulturen och innan musen avlivning, förbereda 24-well tallrikar och 60 mm rätter med dissektion medium och hålla dem iskallt. Värm upp ben odlings mediet i ett vatten bad på 37 ° c. Spraya 80% (v/v) etanol på verktygen (pincett och småsax) som ska användas för foster hantering. Överför ett binokulärt tillämpningsområde till ett biosäkerhets skåp i klass II.
2. kultur av fostret och nyfödda Tibia och lårbenet
- Utgallrade den gravida musen genom cervikal dislokationen på önskad graviditets längd skede (allt från E 14.5 till E 18,5). Om nyfödda ungar används, ta bort dem från mamman en efter en och avlivas genom hals borttagning.
- Placera musen på ryggen och sterilisera buken regionen genom att spraya 80% (v/v) etanol på sin yta.
- Skär huden och buk muskeln med små saxar för att få till gång till livmoder hornen.
- Extrahera livmodern från bukhålan med hjälp av pincett och små sax, ta bort mesometrium och skära basen av hornen. Placera livmodern i en 60 mm petriskål med iskall dissektion medium och hålla kulturen skålen på isen under hela proceduren.
- Överför petriskål med livmodern till biosäkerhets skåpet och arbeta där från och med nu.
- Separera enskilda Foster med sax genom att skära mellan säckar.
- Överför enskilda SAC under en dissektion stereo mikroskopet i en ren 60 mm skålen med dissektion medium och öppna dem med pincett att separera Foster från moderkakor och rengöra dem från membran.
Anmärkning: Arbeta med ett embryo i taget och håll resten på isen. - Hals huggning foster och överföra kroppen till en ren ny 60 mm skålen med en 1 ml skära steril pipett.
- Ta bort huden på foster eller valpar med pincett med början från ryggen och peeling ut till tårna.
- Separera bakbenen från kroppen genom att skära med pincetten nära ryggraden och överföra dem till en ren mat rätt med is-kallt dissektion medium.
- Separera sken benet från lårbenet med pincett genom att noggrant införa dem mellan ytan brosk av distala lårbenet och proximala sken benet.
- Ta bort höft benen från proximala lårbenet och calcaneus benet och vadbenet från sken benet.
- Ta försiktigt bort mjuk vävnad från lårbenet och sken benet genom att nippa och dra av den.
Anmärkning: Det är viktigt att ta bort så mycket mjuk vävnad som möjligt, med särskild omsorg för att ta bort vävnaden som förbinder de två brosk poler, men undvika att skada brosk, perichondrium, och benen. - Placera de fyra benen (vänster och höger skenben och femurs) i den första brunnen av 24-well plattan med en plast 1 ml steril pipett. Alternativt, att jämföra effekten av olika behandlingar på vänster och höger lemmar, placera kontralaterala lemmar i olika brunnar.
Anmärkning: Extra försiktighet bör iakttas när benen överförs till brunnarna, eftersom de lätt kan hålla sig till pipetten. - Fortsätt på samma sätt med så många foster som behövs.
Anmärkning: Ändra skålen med dissekera mediet så snart det blir för grumlad, eftersom det är viktigt att se klart dissekeras ben. -
När alla önskade ben överförs till brunnarna, ta bort dissektion mediet med en plast 1 mL steril pipett och var extra noga med att inte aspirera benen.
- Beroende på syftet med experimentet, kan bilder tas av benen innan du tar bort dissektion mediet, som tidpunkten noll av experimentet. Ta bilder med ett Mikroskop anslutet till en digitalkamera och anteckna exponeringen och skalan som används. För att säkerställa enkla och pålitliga mätningar, ta bilder med god kontrast för att särskilja den mineraliserade delen.
- Tillsätt 1 mL odlings substrat till varje brunn. Om någon behandling är avsedd på benen (doxycyklin, tamoxifen, tillväxtfaktorer, etc.), det bör läggas till nu.
- För att observera effekten av tillväxthämning i odlings förhållandena, behandla vänster skenben med retinoinsyra (ra, 500 nM), medan inkubation rätt skenben med en motsvarande volym av fordon (dimetylsulfoxid [DMSO], koncentration 0,1%) som en kontroll.
- Låt benen växa i två dagar eller mer i en cell kultur inkubator under standard cell odlings förhållanden (vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator).
- För att bedöma spridningen, tillsätt 5-etynyl-2 '-deoxyuridin (EdU) eller 5-Bromo-2 '-deoxyuridin (BrdU) till mediet vid en koncentration på 10 μM 1 − 2 h före fixering.
Anmärkning: Stam koncentrationen för EdU är 20 mM.
Var försiktig: EdU och BrdU är tymidinanaloger och kan vara giftiga och mutagena. - Tina 4% paraformaldehyd (PFA) och fixera benen genom nedsänkning i PFA i enskilda 2 mL-rör.
Var försiktig: PFA är giftigt och betecknas som en sannolik carcinogen hos människor. Undvik att andas paraformaldehyd pulver och ångor. EdU och BrdU är tymidinanaloger och kan vara giftiga och mutagena. - Efter en kort 10 min fixering i PFA vid rums temperatur, överföra ben till PBS för bild förvärv vid sista timepoint. Placera sedan benen tillbaka i PFA för natten fast ställande vid 4 ° c.
- Efter fixering ben kan bearbetas för önskade nedströms applikationer.
3. mätning och analys av hela ben längden och av den mineraliserade regionen
- Använd ett bild redigerings program för att mäta längden på benen, med hänsyn tagen till bildens skala. Mät både den totala längden på benet och det mineraliserade området. Starta mätningarna från de första mörka cellerna i ena änden till de sista i den andra änden.
Anmärkning: Den mineraliserade regionen kännetecknas av mörkare färg och är lätt skiljas från brosk. - För att beräkna tillväxt takten, definierad som den genomsnittliga ökningen av längd per dag, dividera skillnaden mellan den slutliga längden av benet och den första med antalet dagar i kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ben kulturen kan utföras med start från olika stadier. I figur 1a-Dvisas en jämförelse mellan den odlade sken benet och de nyextraherade vid likvärdiga stadier. Den första iakttagelsen är att upp till två dagar av kultur den storlek som uppnås är jämförbar med in vivo ben tillväxt för både brosk och mineraliserat ben (figur 1a, B, D). Längre odlings perioder leder till större skillnader mellan odlade ben och den nyutvunna (figur 1c). Dessutom, som nämnts i protokollet, det är viktigt att ta bort mjuk vävnad som förbinder båda ändarna av benen, som annars benen kommer att böja. Figur 1e visar ett exempel på en sken benet odlas med ofullständig avlägsnande av mjuk vävnad jämfört med en skenben utan mjuk vävnad.
Därefter var skenben odlade i 2 dagar och deras längd mättes. Som framgår av figur 2A, B, kan mätningen av den totala längden och av den mineraliserade delen utföras med ett bild analys program. Som visats av de Luca et al.26, har behandling med ra en stark effekt på tillväxten av skenben redan efter 2 dagars behandling och ett liknande resultat observerades i våra kulturer (figur 2b-D). Viktigt är att experimentet utfördes med hjälp av Parade ben, med rätt ben som kontroll och vänster behandlas med RA (figur 2A, B, E), som hjälper till att övervinna den naturliga variationen i ben storlek mellan olika prover. Således är den odlings metod som beskrivs lämplig för att bedöma effekten av olika föreningar på ben tillväxt.
Därefter bedömdes tillväxt takten för skelettet efter kultur. Ben extraherades, mättes och odlade på E 15,5, 16,5 eller P1, och fastställdes och mättes igen två dagar senare. Både den totala ökningen av längd och längden på den mineraliserade delen mättes (figur 3c). Ett exempel på e 15,5 Tibia och lårbenet före kultur (figur 3a) och vid punkten av experimentet (figur 3b) visas. Som kan observeras från grafen och tabellen (figur 3c, D), det finns en konsekvent ökning av den totala längden på sken benet, vilket motsvarar en ungefärlig ökning med 9 − 29% från den ursprungliga längden. Detta är en mindre ökning än den som observerades in vivo; den största skillnaden är sannolikt på grund av den nivå av proximala brosk, större än distala och mindre tillgängliga för näringsämnen. Faktum är att EdU märkning visade färre positiva celler i denna region efter kultur jämfört med nyligen extraherade ben av motsvarande stadium (figur 4a, C). EdU-inkorporeringen i den distala sken benet var likartad i de odlade och nyextraherade benen (figur 4b, D) det distala brosket bidrar med ungefär en tredjedel till den totala tillväxten av sken benet in vivo i detta steg27. jämförbar med den tillväxt takt som observerats i kulturen, så vi föreslår att analysen ska fokuseras på denna del av benet. Dessutom bedömde vi mineraliseringen av odlade ben, och observera nästan ingen ökning av längden på denna region. Skillnaden kan bero på frånvaron av fartyg och osteoblaster invasion i ex vivo-kulturen. Detta tyder på att studier av brosk tillväxt kan förlänga i flera dagar, medan om regionen av intresse är den ossifierade delen av benet, bör perioden av kultur vara kortare. Denna observation bekräftades genom att hålla sken benet i kulturen under en längre period (upp till 6 dagar). Som framgår av figur 5, ökar den totala längden av skelett elementet avsevärt, medan nästan ingen ökning av den mineraliserade regionen observeras (figur 5c).
Sammantaget tyder dessa resultat på att kulturen av långa ben kan användas för att analysera effekten av olika faktorer på den totala ben tillväxt och särskilt för att bedöma brosk dynamik. Även väletablerade metatarsala kulturer kan också användas med dessa ändamål, vi anser att båda typerna av kulturer kompletterar varandra, med tanke på de inneboende skillnaderna mellan metatarsalben och resten av långa ben.
Figur 1: exempel på kultiverad sken benet under olika tids perioder. (a-D) Jämförelse mellan nyextraherad sken benet (övre) och sken benet som extraherades med E 14,5 (botten) och odlade i 2 dagar (a), som extraherades med e 15,5 och odlade i 2 dagar (B), extraherades vid e 16.5 och odlade i 4 dagar (C) och nyligen utvunnits vid postnatal dag 2 (P2) och extraherades vid dag 1 efter födseln (P1) och odlade under 1 dag (D). Observera att medan brosk tillväxt är ganska fysiologisk efter olika odlings perioder, den ossifierade delen visar en tillväxt fördröjning efter kultur tid längre än 2 dagar jämfört med den nyligen extraherade benet vid motsvarande stadium. Skalbar = 1 mm. (e) Tibia odlade i 2 dagar med början e 15,5; Observera att den ofullständiga avlägsnande av mjuk vävnad mellan de två ändarna av benen leder till böjning av benet. Scale bar = 600 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mätning av ben längden vid behandling med retinoinsyra (ra). (a-B) Tibias utvinns vid E 15,5 och odlas i 2 dagar med 0,1% DMSO (a) och ra (B). Notera skillnaden i både total längd och den mineraliserade delen. Skalbar = 1 mm. (c-D) förändringar i total längd (c) eller den mineraliserade delen (D) av sken benet under en period av 6 dagar i kontroll situationen och i närvaro av ra. Resultaten visas som medelvärde ± standard avvikelse (SD). jämförelsen görs genom dubbelriktad analys av var Ian sen (ANOVA) med typen av behandling som variabel (p -värden visas i grafen). (E) jämförelse av längden på Parade ben odlade i 2 dagar med antingen DMSO (höger sken benet) eller ra (vänster sken benet); varje punkt representerar en av de 3 biologiska replikaten per tillstånd. Parat tvåstjärtad Students t-test användes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av total tillväxt och mineralisering av sken benet efter 48 timmar ex vivo-kultur. (A) e 15,5 skenben och lårben från vänster (övre) och höger (botten) extremiteterna före odling. (B) samma skenben och lårben följs upp efter 2-dagars kultur. Skalbar = 600 μm. (C) diagram som representerar tillväxt takten för skenben odlade i olika utvecklingsstadier. Både den totala tillväxten och tillväxten av den mineraliserade delen bedömdes. Dtabell som visar den initiala och slutliga längden på hela benet och den mineraliserade delen före odling på e 15,5 och efter 2 dagar i kulturen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Skrymmande tillväxt plattor visar inte mycket proliferation i kulturen. (a-B) EdU färgning för proximala (a) och distala (B) Tibia tillväxt plattor odlade från e 15,5 i 2 dagar. (C-D) EdU-färgning för proximala (C) och distala (D) tibiala tillväxt plåtar som nyligen extraherats vid e 17,5. Notera skillnaden i antalet EdU (+) celler i proximala sken benet. Data inkluderar 6 odlade par lemmar och 3 nyligen extraherade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: längre perioder av sken benet kultur visar betydande brosk tillväxt men lite mineralisering. Nyextraherad sken benet vid E 15,5 (t = 0) (a) och efter 6 dagar i kultur (B). Notera skillnaderna mellan brosk tillväxt och tillväxten av den mineraliserade delen. Scale bar = 1 mm (c) graf som visar förändringar i den totala längden och den mineraliserade regionen under en period av 6 dagar. n = 5 odlade Tibias; SD vid varje tidpunkt punkt är följande: t = 0, full längd = 0,0777, mineraliserade = 0,0213; t = 3 d, full längd = 0,1495, mineraliserade = 0,056; t = 6 d, full längd = 0,1193, mineraliserade = 0,0521. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bone ex vivo-kulturmetoder har använts under en tid för att bedöma ben tillväxtens biologi28, men har sällan tillämpats på murina långa ben. Med utvecklingen av avbildnings tekniker, erbjuder ex vivo ben kultur ett attraktivt sätt att studera ben tillväxt i real tid i en miljö som liknar in vivo-förhållandena. I det här scenariot är det viktigt att definiera de villkor under vilka tillväxten av långa ben är jämförbar med deras tillväxt in vivo.
I den här studien beskriver vi ett enkelt och prisvärt protokoll för lång ben kultur, som tar itu med begränsningarna och möjliga tillämpningar. Det mest kritiska steget i denna metod är isolering av benen, som måste förbli intakt och med som mindre mjuk vävnad mellan ändarna av benet som möjligt. Lämnar mjuk vävnad mellan ändarna av benen kommer att förhindra normal tillväxt av benet och framkalla böjning, vilket exemplifieras i figur 1e. Mjuk vävnad i ändarna av benen kan lämnas, eftersom det så småningom kommer att försvinna. Ett annat steg som kräver extra vård är överföringen av benen till odlings plattan, eftersom de lätt kan hålla sig till plastpipetten. En möjlig lösning är att Pipettera upp och ner dissektion medium som innehåller blod och vävnad bitar, eftersom det skapar en beläggning som hjälper till att utesluta benen från att hålla sig till pipetten.
När de har extraherats uppnår skelettet jämförbar storlek med motsvarande in vivo-stadium när det odlas i upp till 48 h. bortsett från att mäta längden på benet, kan tillväxten (genomsnittlig ökning av längd per dag) uppskattas lätt under dessa förhållanden. Denna metod för beräkning av tillväxt takten är dock inte giltig under längre odlings perioder, där andra metoder, såsom calcein märkning29, bör användas. Behandling med retinoinsyra, som främjar tidig chondrocyte differentiering, leder till en betydande minskning av tillväxten av skelettet, vilket tyder på att denna tid för odling är tillräckligt för att observera den effekt som olika ämnen kan ha på ben Tillväxt. Viktigt, jämförelsen gjordes också på Parade ben från samma prov, så att vänster sken benet fick RA behandling och den högra var kontrollen. Detta är en fördel med ben kulturen modellen, eftersom det gör att utföra Parade jämförelser, som är statistiskt mer kraftfull.
Culturing för längre tid visar betydande tillväxt av brosk delen, men en fördröjning i tillväxten av den mineraliserade en, och det är viktigt att överväga detta resultat när du väljer tillämpning av tekniken. Liknande resultat observerades i chick lårben odlade i upp till 10 dagar som visar en utvidgad epiphyseal region och en reducerad diafysära femurfrakturer ben krage14, samt i mus sken benet odlade i 6 dagar18. Dessutom är det viktigt att nämna att i brosk regionen tillväxten är inte heller homogena: den skrymmande distala regionen av lårbenet och proximala regionen av sken benet inte får näringsämnen effektivt genom enkel diffusion och kan inte växa ordentligt. I detta sammanhang bör studierna inriktas på de motsatta växande plattorna, som uppskattades bidra till en tredjedel av den totala tillväxten27, liknande den observerade tillväxten i kulturen. Fördröjningen i tillväxten av odlade ben beskrevs också för metatarsala kulturer15.
En viktig faktor för denna typ av kultur är frånvaron av tillväxt av den ossifierade delen av benet. Det är väl etablerat att osteoblaster invadera brosk matris från periostet tillsammans med blod kärl3,4 och denna process är uppenbarligen störs när ben är isolerad. Detta kan förklara frånvaron av ben bildning under odlings förhållanden. Hypertrofisk chondrocyte transdifferentiering visades också som en viktig källa till osteoblaster7,8,9, men om denna process också kräver delvis förekomst av blod kärl, som det verkar göra under fraktur läkning30, eller vissa andra vävnader som inte finns i ex vivo-kulturer, behöver undersökas ytterligare. Dessutom är det väl beskrivs vikten av den mekaniska belastningen i forma ben tillväxt31,32, som påverkar långa ben och metatarsala ben annorlunda, men är frånvarande i en ex vivo odling setup. Den beskrivna odlings metoden lämpar sig dock för mätning av chondrocyte-dynamiken och förändringar i longitudinell tillväxt och kan därför användas för vissa tillämpningar.
Sammantaget ger det beskrivna protokollet en enkel och billig metod för att odla långa ben från olika stadier, som kan kombineras med ytterligare tekniker för att ta itu med viktiga cellulära och molekyl ära mekanismer, såsom Live time-lapse Imaging13 , 23 eller läkemedels behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Alexandra Joyner för hennes stöd när detta protokoll upprättades, Edwina mcglinn och Yi-Cheng Chang för att dela retinoinsyra syra. Den australiska Regenerative medicin Institute stöds av bidrag från delstats regeringen i Victoria och den australiska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
