Summary
Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.
Abstract
La formation de cellules souches et d'ancêtres hématopoïétiques fonctionnelles (HSPC) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (PsC) a été un objectif insaisissable pour les greffes autologues pour traiter les troubles hématologiques et malins. L'endothélium hémogénique (HE) est une plate-forme adaptée pour produire des HSPC fonctionnels par des facteurs de transcription ou pour induire des lymphocytes d'une manière robuste. Cependant, les méthodes actuelles pour en tirer des HE sont coûteuses ou variables dans le rendement. Dans ce protocole, nous avons établi une méthode rentable et précise pour en tirer l'état dans les 4 jours dans une condition définie sans conducteur et sans xéno. Le HE résultant a subi une transition endothéliale-à-hématopoietic et a produit CD34-CD45- progéniteurs hématopoïétiques clonogènes. La capacité potentielle de notre plate-forme pour la production de HSPC fonctionnels aura de vastes applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.
Introduction
Le développement de nouvelles thérapies pour les troubles hématologiques et immunologiques a été entravé par l'absence de plates-formes robustes pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments à haut débit avec des cellules souches hématopoïétiques autologues (HSC) dérivées de patients cellules souches pluripotentes (PsC). La percée de la technologie induite (i)PSC est prometteuse pour modéliser les maladies à partir des cellules des patients, mais l'établissement de HSC fonctionnels à partir des iPSC patients a été insaisissable. Afin de tirer des HSC des CSP humains, l'induction appropriée des programmes embryonnaires de modelage et de transcription est la clé1,2,3,4,5,6, 7,8. Les progrès récents dans le développement hématopoïétique ont démontré le rôle de l'endothélium hémogénique (HE) dans le développement de HSC9. HE peut être induit par les CSP et est favorable à l'intervention en aval tels que le transfert de gènes10,11,12,13. Utilisant HE comme plate-forme, la combinaison de 5 facteurs de transcription (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) a induit avec succès des HSC fonctionnels qui engraft à long terme et se différencient en plusieurs lignées14. Cependant, la génération variable et inefficace de HE des PSC a entravé la manipulation et l'analyse systématiques des cellules avec la production de plateau et l'induction à grande échelle des cellules hématopoïétiques pour l'usage clinique.
Ici, nous décrivons une méthode rentable et précise pour dériver HE en 4 jours avec une condition définie sans conducteur et xéno- Dans cette méthode, la formation de sphéroïdes et le réaplatissement spontané sur iMarix-511 assurent une densité cohérente des colonies de PSC, qui est cruciale pour l'induction efficace des cellules de HE.
Protocol
1. Réactifs
- Lignes cellulaires (PSC humains) : obtenir des cellules souches embryonnaires (ESC) ou des lignes iPSC 409B2 et 201B7(317-9)) et CBA11.
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Préparation du réactif
- Milieu de placage PSC : mélanger le support d'entretien PSC avec 10 M Y-27632 et le stocker à 4 oC.
- PsC Sphéroïde carrelage moyen: mélanger le milieu d'entretien PSC avec 625-1,250 ng/mL recombinant humain Laminin-511 E8 fragment (LM511-E8)(selon la lignée cellulaire) juste avant l'utilisation.
NOTE: LM511-E8 peut être mélangé dans les médias15. D'autres matrices telles que la laminin-511 pleine longueur doit être pré-enduit, et même fait ainsi, ils ne soutiennent pas les organoïdes mésodermales adhérés pendant le processus de différenciation. - Moyen de différenciation du jour 0 : mélange zif de base mésodermal avec 2 M CHIR99021, 80 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et 80 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF).
- Moyen de différenciation du jour 2 : mélanger le milieu basal hémogénique avec 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF et 100 ng/mL facteur de cellules souches (SCF).
- Préparer le tampon de phosphate salin (PBS) sans calcium ou magnésium (Voir tableau des matériaux).
- 1 mM d'acide éthylèneminetétraacetic (EDTA) tampon: ajouter 1 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL de PBS.
- EHT moyen: mélanger le milieu basal hématopoétique avec 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6 alpha receptor (IL-6/IL-6R), insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine, L-glutamine et pénicilline/Streptomycine/Amphotericin B.
- Tampon FACS : mélanger LE PBS avec 2 % de sérum de veau fœtal et 1 mM EDTA.
- Préparer le tampon de séparation magnétique (Voir tableau des matériaux).
- Préparer des médias à base de méthylcellulose (Voir tableau des matériaux).
2. Formation de colonie de LA CFP
- Cultivez les hSC à 70 - 80% d'afluence sur une plaque de 6 puits à 6 puits enduite de 0,5 g de cm-2 LM511-E8 dans mTeSR1 dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2.
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Dissociation de la CFP (Jour -4)
- Aspirer le milieu et laver les cellules avec DU PBS deux fois. Rincer les cellules avec une solution de dissociation. Incuber à 37 oC pendant 15 min (les cellules ne se desseriront pas pendant ce temps).
- Suspendre les cellules dans le milieu d'entretien PSC, transférer la suspension dans un tube de taille appropriée et centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et suspendre les cellules dans le milieu de placage PSC.
- Plaquer la suspension PSC à une densité de 48 000 à 70 000 cellules cm-2 (selon la lignée cellulaire) sur un récipient en plastique microfabriqué et incuber toute la nuit dans l'incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2.
NOTE: Nous recommandons 100 L puits-1 de suspension cellulaire dans un récipient en plastique micro-fabriqué de 96 puits. Vous ensemencez généralement 20 000 cellules bien-1 dans une assiette de 96 puits pour produire environ 100 sphéroïdes. -
Carrelage des sphéroïdes de la CFP sur LM511-E8 (Jour -3)
- Recueillir les sphéroïdes PSC dans un tube conique de 15 ml en pipetage doucement à l'aide de micropipetter P1000 et laisser les sphéroïdes se tenir debout à température ambiante pendant 2 min pour précipiter par gravité. Aspirer le supernatant.
- Suspendre dans le milieu de placage sphéroïde, distribuer la suspension dans une plaque de culture non enduite de 6 puits à une densité de 4-sphéroïdes cm-2 et la culture dans l'incubateur de 37 oC avec 5% de CO2 pendant trois jours.
3. Induction hémogénique (Jour 0)
- Aspirer le milieu, ajouter le milieu de différenciation Day0 et la culture dans l'incubateur de 37 oC avec 5 % D2 et 5 % de CO2 (incubateur hypoxique).
- Après deux jours de culture dans le milieu de différenciation Day0, aspirez le milieu, puis ajoutez le milieu de différenciation Day2 et la culture dans l'incubateur hypoxique.
4. Isolement de l'endothélium hémogénique (Jour 4)
- Deux jours plus tard, aspirez le milieu et lavez les cellules avec DU PBS deux fois. Rincer les cellules avec une solution de dissociation. Incuber dans l'incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Suspendre délicatement les cellules dans 1 mM EDTA pour se dissocier au niveau unicellulaire, transférer la suspension dans un tube conique de 50 ml et centrifuge les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et suspendre la pastille cellulaire avec 300 L de séparation magnétique tampon.
- Ajouter 100 l de CD34et de pipet s'il y a délicatement. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Jusqu'à 20 millions de cellules par 100 lC34 de ll peuvent être utilisées.
- Filtrer la suspension à l'intermédiaire d'une passoire à cellules de 40 m.
- Séparez les cellules CD34à l'aide d'un séparateur magnétique.
5. Induction de la transition endothéliale-hématopoétique (EHT)
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Enrobage de fibronectin
- Préparer le volume requis de 5 g/mL de fibrenectin-enduit solution en diluant 1 mg/mL de fibronectine dans PBS.
- Distribuer 0,5 ml de la solution de revêtement dans chaque puits d'une plaque de culture de 24 puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifugeles les cellules CD34 triées à 200 x g pendant 3 min. Resuspendre le granule cellulaire dans 1 mL de milieu EHT.
- Déterminer la densité cellulaire viable avec le compteur cellulaire. Ajuster la densité cellulaire à 200 000 cellules mL-1 en ajoutant le milieu EHT.
- Aspirez et jetez la solution de revêtement du puits enduit de fibronectin. Distribuer 0,5 mL de suspension cellulaire CD34dans chaque puits enduit de fibronectine.
- Incuber dans l'incubateur hypoxique pendant une semaine.
6. Analyse de cytométrie de flux des cellules hématopoïétiques
- Collection de cellules flottantes : Transférer le milieu de culture à un tube conique de 15 ml. Centrifugelement le milieu à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant.
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Collecte de cellules adhérentes
- Laver les cellules avec 0,5 mL de PBS deux fois.
- Rincer les cellules avec une solution dissociante et aspirer le liquide excédentaire.
- Incuber la plaque dans l'incubateur de 37 oC pendant 5 min.
- Resuspendre les cellules en 1 mL de tampon FACS.
- Mélanger les cellules flottantes et les cellules adhérentes.
- Centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant. Resuspendre dans 50 'L de tampon FACS. Incuber les cellules avec des anticorps anti-CD34 et anti-CD45 pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec PBS deux fois et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant et resuspendre dans 0,5 mL de tampon FACS avec 0,5 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole.
- Mesurer l'expression CD34 et CD45 par cytomètre de flux.
7. Unité de formation de colonies (CFU) L'échec des cellules hématopoïétiques
- Collection de cellules hématopoïétiques : Transférer le milieu de la culture à un tube conique de 15 ml. Rincer délicatement le puits deux fois avec PBS.
- Centrifugeles les cellules à 200 x g pendant 3 min. Aspirer le supernatant. Resuspendre en 1 mL de milieu EHT. Déterminer le numéro de cellule avec le compteur cellulaire.
- Ajoutez un volume de suspension équivalent de 10 000 cellules à 3 ml de support à base de méthylcellulose complété par des antibiotiques et mélangez bien 5 fois avec une seringue de 16 G ou 18 G.
- Distribuer toute la suspension des médias à base de méthylcellulose dans chaque puits d'une assiette de 6 puits.
- Incuber dans l'incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant deux semaines tout en restant humide. Ne pas déranger le plat. Les colonies sont sensibles au mouvement.
- Après deux semaines, compter les colonies au microscope.
Representative Results
Un schéma de formation des colonies de la CFP est représenté dans la figure 1A. Les sphéroïdes de PSC sont formés sur un récipient en plastique micro-fabriqué pendant une journée. En conséquence, 20 000 cellules 409B2 pourraient être manipulées par 96 puits de récipient en plastique microfabriqué, bien que d'autres lignées cellulaires puissent nécessiter une densité plus élevée (30 000 à 40 000 cellules par 96 puits de récipient en plastique microfabriqué). Ces sphères sont spontanément aplaties à une culture presque bidimensionnelle lorsqu'elles sont plaquées sur un plat de culture en présence de LM511-E8.
Un schéma d'induction hémogénique est illustré dans la figure 1B. Lorsque les colonies de LAC atteignent un diamètre de 750 m, le milieu est modifié de façon séquentielle pour induire des organoïdes mésodermiques. Les colonies de LAC deviendront progressivement une structure latérale ensoleillée vers le haut pendant la différenciation aux organoïdes mésodermiques par changement moyen séquentiel jusqu'au jour 4. Le jour 4, les endothées hémogènes sont spécifiés à partir d'organoïdes mésodermales par tri magnétique et ensuite plaqués sur la fibronectine dans le milieu EHT. 5 à 10 millions de CD34etCD45- on attend des cellules des sphéroïdes contenant 1 million de PSC (figure1C).
On observe que les cellules changent morphologiquement des cellules endothéliales aux cellules hématopoïétiques (Vidéo supplémentaire 1). Une image de phase-contraste représentative des cellules d'ancêtre hématopoïétique s'il est stimulation par le cocktail hématopoïétique le jour 7 dans la figure 2A. Des colonies de cellules hématopoïétiques sont apparues dans la culture.
Une parcelle de cytométrie de débit représentative est montrée dans la figure 2B. Toute la culture est stimulée par un cocktail hématopoïétique et le jour 7 est analysée pour l'expression de CD34 et CD45 par cytométrie de flux. Les cellules progénitrices hématopoïétiques expriment CD34 et CD45.
Un essai de l'UFC a montré la génération de colonies de granulocytes/macrophages à partir des cellules progénitrices hématopoïétiques CD34et CD45 (figure2C). Le nombre estimatif de colonies est de 38 Ufc-G/M pour 10 000 cellules (figure 2D)
Figure 1 : Schéma des colonies de la CFP carrelantes et de la différenciation hématopoïétique subséquente par l'intermédiaire d'endothées hémogènes. (A) Processus schématique de formation des colonies de la CFP. Les CSP sont maintenus sur une plaque de 6 puits recouverte de LM511-E8 dans un milieu d'entretien DE la CFP. Le jour -4, les cellules sont détachées et dissociées au niveau unicellulaire à l'aide d'une solution dissociante, ensuite plaquées sur un récipient en plastique microfabriqué dans un milieu d'entretien PSC avec Y-27632 et cultivées pendant la nuit pour former des sphéroïdes. Le jour -3, les sphéroïdes sont plaqués dans le milieu d'entretien PSC avec LM511-E8 et cultivés pendant trois jours. Au jour 0, les sphéroïdes sont spontanément aplatis à une culture presque bidimensionnelle. Barres d'échelle de 200 m. (B) Le jour 0, le médium est remplacé par un milieu de différenciation Day0 et cultivé dans l'incubateur hypoxique. Le jour 2 de la différenciation, le support est remplacé par le milieu de différenciation Day2. Le jour 4 de l'enrichissement en audothélium hémogénique, les cellules CD34 sont triées magnétiquement et cultivées sur une plaque de 12 puits recouverte de fibronectine dans un milieu EHT pendant 6 jours. (C) Parcelle de flowcytométrie représentative de CD45 et CD34 expression des cellules du jour 4 triées par CD34. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse des biens hématopoïétiques. (A) Image de contraste de phase représentative des cellules progénitrices hématopoïétiques après stimulation avec le cocktail hématopoïétique le jour 7. Échelle bar à 200 m. (B) Parcelle de cytométrie de flux représentatif de CD45 et CD34 expression de la culture entière lors de la stimulation avec cocktail hématopoïétique le jour 7. (C) Image de contraste de phase représentative d'une colonie de granulocyte/macrophage générée à partir des cellules hématopoïétiques de progéniteur de jour 11. Barre d'échelle de 500 m. (D) Nombre d'UsC pour 10 000 cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo supplémentaire 1: EHT video. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Notre méthode d'induction définie sans mangeoire et sans xéno offre une plate-forme précise et rentable pour induire les cellules HE d'une manière évolutive. La formation fidèle de l'endothélium hémogénique dans les protocoles conventionnels10,11,12,13,14 ont été entravées par le manque de contrôle précis de la densité et de la taille des colonies de la CFP, qui affecte l'efficacité de la différenciation dirigée morphogène/cytokine. Nous avions éprouvé l'incohérence de l'induction hémogénique d'endothélium dans chaque lot indépendant des protocoles conventionnels. Le nouveau protocole permet une réglementation stricte de la densité et de la taille des colonies de la CFP, ce qui surmonte l'incohérence de l'induction hémogénique de l'endothélium.
Nous avons exploité la formation uniforme de sphéroïdes et plus tard transmis une condition définie sans mangeoire et xéno pour former HE dans un total de 4 jours. Nous avons confirmé en utilisant trois lignées cellulaires indépendantes que la formation de sphéroïdes assure la formation cohérente des cellules HE. En conséquence représentative, les lignées cellulaires 409B2 ont donné 12,7%-23.6% CD34- efficacité cellulaire basée sur trois expériences indépendantes. Le facteur critique pour carrelage sphéroïdes PSC est LM511-E8. Nous ne recommandons pas de substituer ceci avec d'autres matrices, telles que matrigel ou les produits de laminin pleine longueur dans nos expériences. Nous avons éprouvé que les organoïdes mésodermal ont été facilement détachés de Matrigel et perdus pendant le processus de différenciation. Et ni Matrigel ni la laminin pleine longueur n'ancrent les cellules sans pré-enduit.
La limite potentielle de ce protocole est que nous dépendons du support de maintenance de la CFP pour maintenir les CFP. Nous avons testé d'autres médias tels que StemFit, mais nous avons compromis l'induction hémogénique. Vraisemblablement les cellules étaient résistantes à la sortie de l'état pluripotent dans notre protocole d'induction de temps court (4 jours). Si l'on maintient les CFP dans d'autres médias, nous recommandons d'adapter les cellules dans le milieu de maintenance PSC et d'effectuer quelques passages avant la différenciation. Cette plate-forme permettra la manipulation et l'analyse systématiques des cellules, ainsi que la production sur le marché et l'induction à grande échelle de cellules hématopoïétiques à des fins cliniques potentielles. Un objectif à long terme de ce système est de modéliser les maladies d'immunodéficience dans les modèles de souris humanisées pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables et effectuer des dépistages de médicaments.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Alina Li et Seiko Benno pour leur assistance technique. Nous tenons également à remercier Mme Harumi Watanabe d'avoir fourni une assistance administrative et le Dr Peter Karagiannis d'avoir édité le document. Ce travail a été soutenu par le Centre de base pour la recherche cellulaire iPS du Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine de l'Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) [M.K.S.], le Programme pour la recherche sur les maladies insolubles Utilisant. Cellules iPS spécifiques à la maladie de l'AMED (17935423) [M.K.S.] et du programme Center for Innovation de l'Agence japonaise des sciences et de la technologie (JST) [R.O. et M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
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