Summary
Измененная деятельность нуклеаза была связана с различными человеческими условиями, лежащими в основе ее потенциала в качестве биомаркера. Модульная и простая в ней методология скрининга, представленная в настоящем документе, позволяет подбирать специфические нуклеиновые кислотные зонды для использования нуклеаза в качестве биомаркера заболевания.
Abstract
Nucleases являются класс ферментов, которые расщепляют нуклеиновые кислоты путем катализирования гидролиза фосфодидерных связей, которые связывают рибоза сахара. Nucleases отображают различные жизненно важные физиологические роли в прокариотических и эукариотических организмов, начиная от поддержания стабильности генома для обеспечения защиты от патогенных микроорганизмов. Измененная активность нуклеаза была связана с несколькими патологическими состояниями, включая бактериальные инфекции и рак. С этой целью деятельность по нуклеаде показала большой потенциал для использования в качестве конкретного биомаркера. Однако надежный и воспроизводимый метод скрининга, основанный на этой деятельности, остается весьма желательным.
В этой связи мы внедряем метод, позволяющий проводить скрининг на нуклеализную деятельность с использованием зондов нуклеиновой кислоты в качестве субстратов с разновидностью между патологическими и здоровыми состояниями. Этот метод предлагает возможность проектирования новых библиотек зонда, с увеличением специфичности, в итеративной манере. Таким образом, несколько раундов скрининга необходимы для уточнения конструкции зондов с расширенными функциями, пользуясь наличием химически модифицированных нуклеиновых кислот. Значительный потенциал предлагаемой технологии заключается в ее гибкости, высокой воспроизводимости и универсальности скрининга активности нуклеаза, связанной с заболеваниями. Ожидается, что эта технология позволит разработать перспективные диагностические инструменты с большим потенциалом в клинике.
Introduction
Nucleases являются класс ферментов, способных расщепления фосфодиестерных связей, которые образуют основную структуру нуклеиновой кислоты молекул. Огромное разнообразие нуклеаз делает их классификацию довольно трудно. Тем не менее, Есть некоторые общие критерии, используемые для описания нуклеазы, такие как предпочтения субстрата (дезоксибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК)), расщепление сайта (эндонуклезаили или exonucleases), или ионной зависимости металла, среди других1. Nucleases являются высоко сохранены каталитические ферменты, которые имеют основные роли в обоих, прокариотических и эукариотических организмов и были использованы, и продолжают использоваться, как инструменты редактирования генов2. Они также являются основополагающими действующими лицами в поддержании ДНК и репликации, помогая сохранить стабильность генома и участвуя в процессах проверки чтения3. В бактериях, например, нуклеазы были определены в качестве важных факторов вирулентности, способных способствовать выживаемости бактерий за счет снижения эффективности иммунной системы хозяина4,5,6,7 ,8. У млекопитающих, нуклеазы были предложены быть вовлечены в апоптоз9, митохондриальный биогенез и содержание10 и посредничество антибактериальных и противовирусных врожденных иммунных ответов11. Неудивительно, что изменения активности нуклеаза, будь то повышение или отсутствие, были вовлечены в широкий спектр заболеваний человека. Эти заболевания варьируются от широкого спектра раковых заболеваний12,13 до сердечной гипертрофии10 или аутоиммунных заболеваний14. Таким образом, нуклеазы стали интересными кандидатами в качестве биомаркеров для неоднородной группы человеческих условий. В самом деле, nucleases уже показали свой потенциал в качестве успешных диагностических инструментов для выявления инфекций, вызванных конкретными бактериальными агентами, такими как золотистый стафилококк или Escherichia coli15, 16. Во многих типах рака, выражение стафилококковой нуклеи домен-содержащих белков 1 (SND1) рибонуклеазы свидетельствует о плохой прогноз17. У больных раком поджелудочной железы, повышенный рибонуклеаI (RNase I) сыворотки были зарегистрированы18 и предлагается быть связаны с раковыми фенотипами клеток19. В ишемических условиях сердца, таких как инфаркт миокарда или нестабильный стенокардия pectoris, дезоксирибонуклея I (DNase I) уровни сыворотки были показаны, чтобы быть действительным диагностическим маркером20,21.
Было высказывано что глобальный план деятельности nuclease может быть по-разному в здоровых и положениях заболевания. В самом деле, последние доклады использовали различия в активности нуклеаза различать здоровые и раковые фенотипы22 или для выявления патогенных бактериальных инфекций в видов-специфических образом15,23. Эти выводы открыли новый путь для использования нуклеаз в качестве биомаркеров болезни. Поэтому существует необходимость в разработке комплексного метода скрининга, способного систематически выявлять связанные с заболеваниями различия в деятельности нуклеаза, которые могут иметь ключевое значение при разработке новых диагностических средств.
В этом виде мы вводим и описываем новый подход к скринингу in vitro(рисунок 1)для выявления чувствительных и специфических зондов, способных дискриминировать деятельность нуклеазы в здоровой и нездоровой, или деятельность, характерную для типа клеток или бактерий. Воспользовавшись модульностью нуклеиевых кислот, мы разработали начальную библиотеку утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, состоящих из всеобъемлющего набора различных последовательностей и химии, оба являющиеся важными параметрами для оформления библиотеки. Эти олигонуклеотидные зонды окружены флюорофором (флуоресцеин амидитом, FAM) и утоляжем (tide quencher 2, T'2) на 5' и 3' заканчивается соответственно (Таблица 1). С помощью этого флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET) на основе флюорометрического исследования для измерения кинетики ферментативной деградации, мы смогли определить кандидат зондов с потенциалом для дискриминации дифференциальных моделей нуклеаза деятельности связанных со здоровыми или болезнями. Мы разработали итеративный процесс, в котором создаются новые библиотеки на основе лучших зондов-кандидатов, что позволяет идентифицировать все более конкретные кандидаты зондов в последующих шагах скрининга. Кроме того, этот подход использует каталитический характер нуклеаз для повышения чувствительности. Это достигается за счет использования активируемого характера репортер зондов и способность nucleases постоянно обрабатывать молекулы субстрата, как представляющие ключевые преимущества по сравнению с альтернативными антителами или малых молекул на основе методов скрининга.
Этот подход предлагает весьма модульный, гибкий и простой в реализации инструмент скрининга для идентификации конкретных зондов нуклеиновой кислоты, способных различать здоровые и болезни, и отличную платформу для разработки новых диагностические инструменты, которые могут быть адаптированы для будущих клинических применений. Таким образом, этот подход был использован для выявления нуклеаза деятельности, полученных от Salmonella Typhimurium (здесь называют salmonella) для конкретной идентификации этой бактерии. В следующем протоколе мы сообщаем о методе проверки на бактериальную активность нуклеаза с помощью кинетической экспертизы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дизайн и подготовка библиотеки олигонуклеотида
- Дизайн библиотеки
- Основываясь на следующих критериях дизайн библиотеки утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов между 8 и 12-Mer долго, чтобы избежать вторичного формирования структуры, с одинаковой длиной для всех зондов.
- Включите по крайней мере одну ДНК и одну РАН случайную последовательность, содержащую комбинацию аденина (A), гуанина (G), цитозина (C) и тимина (T)/uracil (U)(ДНК и РНК-зондов в таблице 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности ДНК и РНК, описанные в таблице 1, были полезны в качестве первоначальных субстратов для классификации неизвестного типа нуклеаза, либо DNase, либо RNase. Эти две последовательности рекомендуется в качестве отправной точки для любого скрининга, так как они показали широкую возможность для обнаружения nuclease профилей деятельности в бактериях и образцах тканей. Если активность нуклеаза не наблюдается с этими последовательностями ДНК и РНК, требуется разработка дополнительных олигонуклеотидов. - Включите полинуклеотидные последовательности, состоящие из одного типа нуклеотида для определения зависимости последовательности для данной нуклеаза деятельности (ДНК-Поли А, ДНК-Поли Т, ДНК-Поли С, ДНК-Поли G, РНК-Поли А, РНК-Поли У, РНК-Поли С и РНК-Поли G в таблице 1).
- Использование той же последовательности нуклеотидных остатков, как первоначальные последовательности ДНК и РНК, включают последовательности, которые содержат нуклеозидные аналоги, укрывающие химические модификации на 2'-позиции сахара рибоза, такие как 2'-Fluoro и 2'-O-Methyl, как строгий шаг для повышения избирательности нуклеаз.
- Включите полностью модифицированные последовательности, полностью состоящие из аналогов нуклеозидов 2'-Fluoro или 2'-O-Methyl нуклеозидных аналогов (Все 2'-F и Все 2'-OMe, таблица 1)
- Включите химерные последовательности, состоящие из неизмененных натуральных пуринов и 2'-Флуоро пиримидино в нуклеозидных аналогах (RNA Pyr-2'F, таблица 1).
- Включите химерные последовательности, состоящие из неизмененных натуральных пуринов и аналогов нуклеозида 2'O-Methyl pyrimidine (RNA Pyr-2'OMe, таблица 1).
- Включите химерные последовательности, состоящие из неизмененных природных пиримидинов и 2'-Fluoro пуриновые нуклеозидные аналоги (RNA Pur-2'F, Таблица 1).
- Включите химерные последовательности, состоящие из неизмененных природных пиримидинов и 2'O-Метил пуринового нуклеозида аналогов (RNA Pur-2'OMe, Таблица 1).
- Включите по крайней мере одну ДНК и одну РАН случайную последовательность, содержащую комбинацию аденина (A), гуанина (G), цитозина (C) и тимина (T)/uracil (U)(ДНК и РНК-зондов в таблице 1).
- Основываясь на следующих критериях дизайн библиотеки утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов между 8 и 12-Mer долго, чтобы избежать вторичного формирования структуры, с одинаковой длиной для всех зондов.
- Подготовка и хранение олигонуклеотидного зонда
ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды синтезируются методом фосфорамидита. После синтеза олигонуклеотиды очищаются с помощью высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC), а масса измеряется массой спектрометрии.- Спин вниз лиофилизированных олигонуклеотидных зондов с помощью центрифуги и разбавить их в Tris-EDTA (TE) буфер для предотвращения деградации нуклеаза. Определите объем разбавления в соответствии с выходом каждого зонда, чтобы сделать складраствор с концентрацией 500 рмоль/ЗЛ.
- Храните лиофилизированные олигонуклеотиды при температуре 4 градуса Цельсия или комнатной температуре в течение короткого срока. Для длительного хранения (от месяцев до лет) храните лиофилизированные олигонуклеотиды при -20 градусов по Цельсию. При повторной приостановке лиофилизированных олигонуклеотидов в TE храните на складе растворы при -20 градусах цельсия или, желательно, при -80 градусов по Цельсию.
2. Бактериальная культура
- Возьмите один пористый стеклянный бисер из криогенного флакона хранения в стерильных условиях.
- Чтобы изолировать отдельные бактериальные колонии(Salmonella и E. coli),используйте метод квадранта24, полосируя/катаясь на бисе прямо на блюдо Петри, содержащее триптической соевой агар (TSA) среды, дополненной дефибринатными овцами Крови.
- Инкубировать культуру при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
3. Супернатанпрепарат препарат
- Перенесите одну колонию из твердых носителей на 50 мл триптической соевого бульона (TSB) и инкубировать при 37 градусах по Цельсию при 24 л.с. при 200 об/мин.
- Разбавить культуру (1:500) в TSB (суб-культура) и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 24 ч при 200 об/мин в тряся инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что после 24 ч инкубации бактериальные культуры находятся в стационарной фазе, достигая значений выше 109 CFU/mL. - После инкубационного периода, передача культур на ограниченные стерильные трубки и центрифуги на 4500 х г в течение 30 мин.
- Соберите супернатант и используйте его немедленно. Кроме того, храните супернационты при 4 градусах или -20 градусов по Цельсию.
4. Нуклиз едкие действия Ассаи
- Подготовка рабочих решений
- Подготовьте рабочий раствор мощностью 20 л для каждого зонда в нуклеаузных трубах мощностью 1,5 мл, разбавляя (1:10 соотношение) стоковый раствор (500 моль/Л) для конечной рабочей концентрации 50 пмоль/Л. Для этой цели, смесь 18 л фосфатного буферного солен (PBS), содержащего MgCl2 и CaCl2 с 2 злителя раствора запаса зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что в рабочем решении, олигонуклеотиды более уязвимы для деградации нуклеаны, поэтому, рекомендуется подготовить рабочие решения непосредственно перед созданием реакции. - Избегайте прямого контакта света во время подготовки и держать в темноте (завернутый в фольгу), при работе с флюорофорами.
- Подготовьте рабочий раствор мощностью 20 л для каждого зонда в нуклеаузных трубах мощностью 1,5 мл, разбавляя (1:10 соотношение) стоковый раствор (500 моль/Л) для конечной рабочей концентрации 50 пмоль/Л. Для этой цели, смесь 18 л фосфатного буферного солен (PBS), содержащего MgCl2 и CaCl2 с 2 злителя раствора запаса зонда.
- Реакция настроена
- Предварительно разогреть фторметр (например, цитирование 1) до 37 градусов по Цельсию.
- Подготовьте набор (одна трубка/зонд) из 1,5 мл нуклеаза бесплатно микроцентрифуговых труб для каждого образца (TSB, E. coli и Salmonella)и этикетки соответственно.
- Аккуратно добавьте 96 зЛ стерильных средств массовой информации tSB, супернатант сальмонеллы или супернатант E. coli (с шага 3.4.). Впоследствии, добавить 4 Л /трубки зонда рабочего решения соответственно. Выполните этот шаг при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 зондов были использованы для первого раунда скрининга и 6 зондов для второго раунда. - Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз, чтобы получить однородное решение. Избегайте введения пузырьков воздуха в образцы при смешивании.
- Загрузите 95 зл каждого раствора (зондик - супернатант или культурные носители) в отдельный колодец черного дна, не обработанную пластину 96 скважин. Свести к минимуму образование пузырьков в колодцах при загрузке, тщательно раздавсив кончик близко к стене колодца.
- Накройте тарелку крышкой. Визуально осматривать крышку и проверять на наличие маркировки пера или накопления частиц пыли, которые могут ввести артефакты измерения. Замените крышку на новую, если это так.
- Настройка измерения
- Откройте приобретение программного обеспечения (Gen5 3.05), нажав на значок ярлыка программного обеспечения(рисунок S1A).
- Выберите Read Now из окна диспетчера задач и выберите Новый...
- Нажмите на Установить Температуру в окне диалога под названием Процедура и выберите 37 градусов по Цельсию. Подтвердите и сохраните настройки, нажав OK (Рисунок S1C).
- Нажмите на кнопку «Пуск кинетика» в окне диалога под названием «Процедура». Затем в всплывающем диалоговом окне, озаглавленном Kinetic Step,выберите 2 ч в входной коробке Run Time и 2 мин в входной коробке Interval. Подтвердите и сохраните настройки, нажав OK (Рисунок S1D).
- Нажмите на Чтение в окне диалога под названием Процедура. Затем в всплывающем диалоговом окне, озаглавленном Read Method, выберите интенсивность флуоресценции в качестве метода обнаружения, Endpoint/Kinetic как тип чтения и фильтры как тип оптики. Подтвердите и сохраните настройки, нажав OK (Рисунок S1E).
- В всплывающем окне диалога под названием Read Step (Кинетическая)выберите зеленый цвет из набора фильтров. Подтвердите и сохраните настройки, нажав OK (Рисунок S2A).
- В окне диалога под названием Процедуравыберите крышку и нажмите на проверку, чтобы убедиться, что созданный протокол действителен. Это подтверждается всплывающее окно диалога(рисунок S2B).
- Выберите протокол в меню бар и выбрать процедуру (рисунок S2C).
- В окне диалога под названием Процедура, определить скважины должны быть измерены(рисунок S2D).
- Введите название эксперимента в поле ввода имени файла(рисунок S2E).
- Загрузите тарелку крышкой в считыватель пластины. Убедитесь, что пластина находится в нужной ориентации.
- Начните приобретение, нажав на новую кнопку чтения в панели инструментов(Рисунок S2F).
- Анализ данных
- Нажмите на одну из измеренных скважин в диалоговом окне под названием Плита 1 (рисунок S3A).
- Нажмите выберите скважины и включите все измеренные скважины в окно диалога выбора скважины. Подтвердите и сохраните настройки, нажав OK. (Рисунок S3B).
- Выберите данные в окне диалога под названием Плита 1, чтобы визуализировать результаты, сформулированные(рисунок S3C).
- Экспорт данных в спредлист, выбрав быстрый экспорт из контекстного меню(рисунок S3C).
- В спред-листе пометьте столбцы данных соответствующим образом для каждого образца и зонда.
- Создание кинетических графиков, используя линию со стилем маркеров, путем построения относительных флуоресценции (RFU) по сравнению со временем (x-оси: хронология реакции и y-оси: RFUs).
ПРИМЕЧАНИЕ: Описание создания графика применимо при использовании программ электронных таблиц (например, Excel). Тем не менее, любые другие программы могут быть использованы для создания графиков из необработанных данных, полученных, путем построения РФС по сравнению со временем. - Рассчитайте скорость ферментативной реакции для каждого измеренного интервала в соответствии со следующей формулой25: скорость
, где если РФС в максимальной временной точке времени и Ii является РФС в минимальном интервале времени, и Tf и Ti являются максимальными и минимальными временными точками интервала, соответственно. - Выберите скорость с наивысшим значением (Rmax)для каждой кривой. Если на образец приходится более одногоR max, выберите тот, который происходит в самой ранней точке времени измерения.
- Рассчитайте соотношение между Rmax и средним значением интервала времени, с которым происходит Rmax: коэффициент скорости
- Рассчитайте разницу в раз (FD) между коэффициентом скорости salmonella и E. coli для каждого зонда.
- Учитывайте значение разницы в развыше 3 как значительное.
- Рассмотрим значительные зонды с самыми высокими значениями разницы складов (FD) в качестве кандидатов зондов и в качестве основы для разработки библиотеки в следующем раунде отбора.
, где если РФС в максимальной временной точке времени и Ii является РФС в минимальном интервале времени, и Tf и Ti являются максимальными и минимальными временными точками интервала, соответственно.
5. Критерии отбора раундов скрининга(рисунок 1)
- Первый раунд скрининга
- Выполните анализ активности нуклеаза (как описано в разделе 4) с использованием ДНК, РНК и полинуклеотидов зондов.
- Оцените предпочтение химии ДНК или ХИМИи РНК, сравнив количество и производительность (значение FD) днк и зондов-кандидатов НА РНК.
- Выберите тип химии нуклеиновой кислоты, что делает наибольшее количество зондов-кандидатов, как показано на рисунке 1.
- Второй раунд скрининга
- Выполните анализ активности нуклеаза (как описано в разделе 4) с использованием полностью модифицированных зондов и химерных зондов, разработанных на основе субстрата нуклеиновой кислоты, выбранного в первом раунде отбора.
- Оцените предпочтение последовательностям, содержащим 2'-Fluoro и 2'-O-Methyl нуклеозидные аналоги, сравнивая результаты, полученные для 2'-Fluoro и 2'-O-Methyl модифицированных зондов-кандидатов.
- Выберите тип нуклеозидной аналоговой модификации, оказывая наибольшее количество зондов-кандидатов, как показано на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан рабочий поток этой методологии, которая делится на два раунда отбора. В первом раунде скрининга, мы использовали 5 ДНК зондов (ДНК, ДНК Поли A, ДНК Поли T, ДНК Поли C и ДНК Поли G), а также 5 РНК зондов (РНК, РНК Поли A, РНК Поли U РНК Поли C и РНК Поли G). Необработанные данные этого раунда скрининга можно найти в дополнительной таблице 1. Во втором раунде химически модифицированные зонды были синтезированы путем замены последовательности РНК химически модифицированными нуклеозидами (все 2'-Fluoro и All 2'-OMethyl) или сочетанием РНК и пуринов или пиримидинов, химически модифицированных (РНК Пир-2'F, РНК, РНК Пир-2'OMe, РНК Пур-2'F и РНК Pur-2'OMe). Необработанные данные этого раунда скрининга можно найти в дополнительной таблице 2. Подробное описание последовательностей можно найти в таблице 1. Результаты, полученные в результате первого скрининг-раунда, показаны на рисунке 2, где супернатанты культуры сальмонеллы сообщают о явном предпочтении РНК-зондов над зондами ДНК. В отличие от этого, E. coli и культурные средства массовой информации контроля показывают очень ограниченную способность к деградации РНК-зондов. Кроме того, мы рассчитали разницу в раз (FD) между коэффициентами скорости Salmonella и E.coli (Дополнительная таблица 3 и Дополнительная таблица 4) для того, чтобы определить наиболее эффективные зонды. Расчеты были выполнены, как описано в разделе протокола.
Эти результаты свидетельствуют о наличии RNase типа деятельности, полученной от сальмонеллы. Основываясь на определении РНК в качестве предпочтительного типа нуклеиновой кислоты для сальмонеллы нуклеазы, мы разработали новую библиотеку с использованием химически модифицированных нуклеотидов, которые будут использоваться во втором раунде скрининга, направленного на повышение специфичности Зонды. На рисунке 3 показаны кинетические профили зондов, содержащих химически модифицированные нуклеотиды. Интересно, что РНК Пир-2'OMe и РНК Pur-2'OMe показывают наиболее эффективное кинетическое поведение по сравнению с РНК Пир-2'F и РНК Pur-2'F, соответственно.
Эти результаты свидетельствуют о том, что Salmonella имеет важную активность RNase, которые могут быть использованы для выбора зондов, способных специально признать эту бактерию. Кроме того, мы заметили, что 2'-OMe химически модифицированных нуклеозидов больше подходят для типа РНК выделяется сальмонеллы. Имея это в виду, протокол, описанный в этом вкладе, предлагает возможность изучения использования нуклеаза деятельности в качестве биомаркера.
Рисунок 1: Культуры бактерий и рабочий процесс процесса скрининга. Подготовка бактерий культур и супернатантов (слева). Описание рабочего процесса для двух раундов скрининга. Первый скрининг: Предпочтение ДНК или РНК оценивается с помощью 10 зондов. Второй скрининг: На основе предпочтений нуклеиновой кислоты, дополнительные зонды, содержащие химически модифицированные нуклеотиды оцениваются для определения наиболее эффективных субстратов для данной деятельности нуклеаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Первый кинетический раунд скрининга. Кинетические профили сальмонеллы, кишечной палочки и культурных носителей (TSB) с использованием ДНК и РНК-зондов. Деятельность Nuclease представлена относительными флуоресценцией (РФС). Графики являются репрезентативными, по крайней мере, для 3 индивидуально выполненных экспериментов. Различные образцы помечены как указано в легенде графика. Значения разницы в свито (FD) были рассчитаны с использованием коэффициентов скорости сальмонеллы и кишечной палочки для каждого зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Второй кинетический раунд скрининга. Кинетические профили сальмонеллы, кишечной палочки и культурных носителей (TSB) с использованием химически модифицированных зондов. Деятельность Nuclease представлена относительными флуоресценцией (РФС). Графики являются репрезентативными, по крайней мере, для 3 индивидуально выполненных экспериментов. Различные образцы помечены как указано в легенде графика. Значения разницы в свито (FD) были рассчитаны с использованием коэффициентов скорости salmonella и E.coli для каждого зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Последовательности зонда нуклеиновой кислоты. Список всех нуклеиновой кислоты зондов, используемых в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Настройка измерения. Кнопки кликов и диалоговые окна, описывающие пошаговый процесс, выполняемый в программном обеспечении приобретения для настройки различных параметров измерения. (A) Значок рабочего стола. (B) Окно диалога менеджера задач. (C) Процедура и температура Настройка диалоговые окна. (D) Процедура и кинетический шаг диалоговые окна. (E) Процедура и читать метод диалоговые окна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 2: Настройка измерения. Кнопки кликов и диалоговые окна, описывающие пошаговый процесс, выполняемый в программном обеспечении приобретения для настройки различных параметров измерения. (A)Процедура и прочитайте шаг (кинетическое) окна диалогов. (B) Процедура диалогового окна (C) "Протокол" меню бар. (D) Ну выбор диалога окна. (E) Вхоточная коробка с именем файла. (F) Выполнить новый значок используется для начала приобретения в программном обеспечении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 3: Анализ данных. Кнопки кликов и диалоговые окна, описывающие пошаговый процесс, выполняемый в программном обеспечении для приобретения для экспорта приобретенных данных в спред-лист для дальнейшего анализа. (A) Окно диалога матрицы плиты. (B) Плита и хорошо выбор диалоговые окна. (C) Окно диалога плиты и меню контекста быстрого экспорта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 4: Третий скрининговый раунд (оптимизация предпочтений последовательности). Описание различных этапов, связанных с дополнительным раундом скрининга, направленным на оценку вариаций последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 5: Четвертый скрининговый раунд (раунд оценки специфичности). Описание различных шагов, участвующих в дополнительном раунде скрининга, направленного на повышение специфичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 6: Пятый скрининговый раунд (оптимизация параметра реакции). Описание различных шагов, связанных с дополнительным раундом скрининга, направленным на снижение нецелевой перекрестной реактивности путем модуляции деятельности nuclease. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная таблица 1: Необработанные данные первого раунда скрининга. Для каждого зонда (помеченного красным цветом, сверху), время приобретения и значения сырой флуоресценции были зарегистрированы для TSB, E. coli и Salmonella,а также расчетное значение скорости для каждого интервала. Расчеты были проведены, как описано в разделе методов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2: Необработанные данные по второму раунду скрининга. Для каждого зонда (помеченного красным цветом, сверху), время приобретения и значения сырой флуоресценции были зарегистрированы для TSB, E. coli и Salmonella,а также расчетное значение скорости для каждого интервала. Расчеты были проведены, как описано в разделе методов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 3: Анализ данных для первого раунда отбора. Для каждого зонда (помеченного красным цветом, сверху) были получены следующие значения для TSB, E. coli и Salmonella:максимальные значения скорости, минимальные и максимальные интервалы времени, коэффициент ставки, значения разницы в раз между сальмонеллой и E. coli над TSB и значения разницы складывания между Salmonella и E. coli (выделено желтым цветом). Расчеты были проведены, как описано в разделе методов, а формулы расчета и пошаговые расчеты отображаются в таблице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 4: Анализ данных для второго раунда скрининга. Для каждого зонда (помеченного красным цветом, сверху) были получены следующие значения для TSB, E. coli и Salmonella:максимальные значения скорости, минимальные и максимальные интервалы времени, коэффициент ставки, значения разницы в раз между сальмонеллой и E. coli над TSB и значения разницы складывания между Salmonella и E. coli (выделено желтым цветом). Расчеты были проведены, как описано в разделе методов, а формулы расчета и пошаговые расчеты отображаются в таблице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изменения активности нуклеаны были связаны с широким спектром фенотипов заболеваний, в ключая различные виды рака и бактериальных инфекций. Эти изменения предлагается быть возбудителем состояния14, в то время как в других случаях они являются следствием пагубного физиологического события20 или патогенного агента16,26. Неудивительно, что попытки использовать нуклеазы и нуклеаза деятельности в качестве диагностического биомаркера были описаны15,22,23,26, со значительнымобещанием. Соответственно, представляется целесообразным создание надежного и воспроизводимого подхода к скринингу для систематической оценки деятельности нуклеаза при заболеваниях и выявления конкретных и чувствительных репортеров. Для решения этой необходимости мы разработали надежную, модульную и простую в реализации скрининговую платформу, основанную на анализе флуоресценции, которая позволяет обнаружить новые биомаркеры болезни и выявить чувствительные и специфические зонды нуклеиновой кислоты в параллельно, с помощью каталитического действия нуклеазы.
Мощные инструменты скрининга, такие как малые молекулы высокой пропускной способностью скрининга (HTS)27, систематической эволюции лигандов экспоненциального обогащения (SELEX)28 или фаг дисплей29 были ранее сообщалось, которые позволяют идентификация молекул распознавания высокого сродства (например, малых молекул, аптамеров или связывающих пептидов). Для сравнения, представленный здесь подход к скринингу позволяет подбирать зонды, которые могут идентифицировать известную и неизвестную деятельность нуклеаза. Кроме того, этот подход совместим с моделями скрининга in vitro, ex vivo и in vivo. Кроме того, реактивный характер нуклеи дает явное преимущество перед вышеупомянутыми подходами, в том, что взаимодействие зонда-нуклеаза не является статичным, а динамичным процессом. Это означает, что деятельность nucleases становится внутренней модуль усиления сигнала для репортерзондов, так как несколько репортер зондов может взаимодействовать с одной нуклеазы.
Как и в любом другом методе скрининга, генерация и управление начальной библиотекой имеет важное значение. Характер зондов нуклеиновой кислоты обеспечивает большую гибкость в проектировании и создании библиотеки и позволяет вводить различную степень сложности в зависимости от применения скрининга. Сложность библиотеки может быть введена на различных уровнях, включая мотивы последовательности, нуклеотидной химии, фосфатной химии позвоночника и длины олигонуклеотида. Модулирование сложности библиотеки позволяет идентифицировать зонды не только для их способности успешно идентифицировать активность нуклеаза, связанную с болезнью, но и для свойств, совместимых с последующими приложениями in vivo. Кроме того, базовая библиотека нуклеиновой кислоты предлагает ряд преимуществ по сравнению с антителами или пептидные аналоги. С одной стороны, производство антител, как известно, громоздким, требующих животных или сложных систем эукариотической культуры, которые увеличивают стоимость и вводят вариативность партии30,31. Кроме того, высокий молекулярный вес и иммуногенность ограничивают их применение28,32. С другой стороны, генерация биологических пептидных библиотек обычно требует вирусных или бактериальных систем экспрессии29,30,увеличивая сложность процесса скрининга. Химические пептидные библиотеки избежать этой проблемы, за счет использования запутанных бис основе систем или несколько раундов дорогостоящего синтеза пептида33. Все эти проблемы обходят с помощью библиотеки нуклеиновой кислоты. После создания начальной библиотеки методы скрининга становятся быстрыми и понятными. Описанный в настоящем моменте метод служит платформой для дополнительных раундов скрининга, таких как оптимизация последовательности(Дополнительная диаграмма 4),оценка специфичности(Дополнительная диаграмма 5) или оптимизация модуляторных элементов nuclease деятельности, такие как металлические кофакторы (обычно divalent катионов) и chelators, которые очень полезны для повышения специфики выбранных зондов(Дополнительный рисунок 6).
Кинетический флюорометрический анализ, используемый в данном исследовании, может быть оптимизирован как для бактериальных, так и для клеточных культур, при этом скрининг проводится в удобных для пользователя микротитерных пластинах. В случае клеточных анализов, этот протокол совместим как с, подвеска и монослой культур, которые, после оптимизации, могут быть использованы в соответствии с потребностями in vitro модели изучается. Мы определили несколько важных шагов, которые требуют оптимизации до скрининга. К ним относятся количество клеток или бактериальной плотности для проверки, концентрация зонда, флюорометр детектор усиления настройки или реализации встроенных методов коррекции фона. Одним из ограничений этой технологии является необходимость изменения нуклеаза деятельности, связанной с патологическим состоянием интересов. Без этой функции подход к отбору зондов-кандидатов невозможен. Другим ограничением является самоуточение способности гуанинов, когда они находятся в непосредственной близости от фторофора. Эта характеристика должна быть рассмотрена при проектировании библиотеки.
Ферментативный характер измеренной реакции заставляет учитывать время загрузки пластин. Минимизация времени загрузки позволит уменьшить различия в фоновых условиях между различными экспериментальными условиями. Существует несколько вариантов для преодоления этой проблемы, таких как замедление ферментатической реакции во время погрузки с помощью ледяных реагентов или автоматизированные системы погрузки, хотя последний значительно увеличивает затраты, но и пропускную стоимость. Кроме того, кинетические измерения являются большим улучшением по сравнению со статическими измерениями, обеспечивая полное и более реалистичное представление о динамике каталитической активности нуклеан.
Таким образом, наш протокол предлагает универсальный, надежный и воспроизводимый метод скрининга для идентификации чувствительных и специфических нуклеиновой кислоты зондов для обнаружения нуклеаза деятельности, связанной с болезнью, которая преодолевает основные препятствия альтернативные методы скрининга. Мы ожидаем, что эта технология скрининга позволит разработать новые диагностические инструменты во множестве условий, с легкой переводом в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Луису И. Эрнандес (Университет Линчепинга) за ее тщательный пересмотр рукописи и ценные советы. Эта работа была поддержана Фондом Кнута и Алисы Валленберг и Шведским правительством по стратегическим исследованиям в области материаловедения по перспективным функциональным материалам в Университете Линчепинга (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A.
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J.
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
