Summary
Modelos in vitro de angiogênese coronariana podem ser utilizados para a descoberta dos mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana. Culturas in vitro explantam tecidos sinus venosos e endocárdios mostram crescimento robusto em resposta ao VEGF-A e apresentam um padrão semelhante de expressão COUP-TFII como in vivo.
Abstract
Aqui, descrevemos um ensaio de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana. Vasos coronários alimentam o músculo cardíaco e são de importância clínica. Defeitos nesses vasos representam graves riscos à saúde, como na aterosclerose, que podem levar a infartos do miocárdio e insuficiências cardíacas em pacientes. Consequentemente, a doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Apesar de sua importância clínica, relativamente pouco progresso foi feito sobre como regenerar artérias coronárias danificadas. No entanto, avanços recentes foram feitos na compreensão da origem celular e das vias de diferenciação do desenvolvimento de vasos coronários. O advento de ferramentas e tecnologias que permitem aos pesquisadores rotular fluorescentemente células progenitoras, seguir seu destino e visualizar progêias in vivo têm sido fundamentais na compreensão do desenvolvimento de vasos coronários. Estudos in vivo são valiosos, mas têm limitações em termos de velocidade, acessibilidade e flexibilidade no design experimental. Alternativamente, modelos in vitro precisos de angiogênese coronariana podem contornar essas limitações e permitir que os pesquisadores interroguem questões biológicas importantes com rapidez e flexibilidade. A falta de sistemas de modelo in vitro adequados pode ter dificultado o progresso na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento de vasos coronários. Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para cultivar vasos coronários a partir do sinus venosus (SV) e endocárdio (Endo), os dois tecidos progenitores dos quais muitos dos vasos coronários surgem. Também confirmamos que as culturas recapitulam com precisão alguns dos mecanismos in vivo conhecidos. Por exemplo, mostramos que os brotos angiogênicos na cultura a partir de SV para baixo regulam a expressão COUP-TFII semelhante ao observado in vivo. Além disso, mostramos que o VEGF-A, um conhecido fator angiogênico in vivo, estimula robustamente a angiogênese das culturas SV e Endo. Coletivamente, criamos um modelo preciso de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana.
Introduction
Vasos sanguíneos do coração são comumente chamados vasos coronários. Esses vasos são compostos por artérias, veias e capilares. Durante o desenvolvimento, primeiro são estabelecidos capilares altamente ramificados, que depois se remodelam em artérias coronárias e veias1,2,3,4,5. Estes capilares iniciais são construídos a partir de células progenitoras endoteliais encontradas nos tecidos proepicárdio, sinus venoso (SV) e endocárdio (Endo)1,6,7,8. SV é o órgão de entrada do coração embrionário e Endo é o revestimento interno do lúmen do coração. As células progenitoras endoteliais encontradas no SV e no Endo constroem a maioria da vasculatura coronária, enquanto o proepicárdio contribui para uma porção relativamente pequena dela2. O processo pelo qual a rede capilar de vasos coronários cresce no coração a partir de suas células precursoras pré-existentes é chamado angiogênese coronariana. A doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo e ainda falta um tratamento eficaz para esta doença. Compreender os mecanismos celulares e moleculares detalhados da angiogênese coronariana pode ser útil na concepção de terapias novas e eficazes para reparar e regenerar artérias coronárias danificadas.
Recentemente, uma onda de compreensão de como os vasos coronários se desenvolvem tem sido, em parte, alcançada através do desenvolvimento de novas ferramentas e tecnologias. Em particular, a rotulagem de linhagem in vivo e tecnologias avançadas de imagem têm sido muito úteis para descobrir a origem celular e as vias de diferenciação dos vasos coronários9,10,11,12. Apesar das vantagens dessas ferramentas in vivo, há limitações em termos de velocidade, flexibilidade e acessibilidade. Portanto, sistemas robustos de modeloin vitro podem complementar sistemas in vivo para elucidar os mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana de forma de alta duração.
Aqui, descrevemos um modelo in vitro de angiogênese coronariana. Desenvolvemos um sistema de cultura de explante in vitro para cultivar vasos coronários a partir de dois tecidos progenitores, SV e Endo. Com este modelo, mostramos que as culturas de tecido in vitro explantam brotam de vasos coronários quando estimuladas pelo meio de crescimento. Além disso, as culturas explantes crescem rapidamente em comparação com o controle quando estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), uma proteína angiogênica altamente potente. Além disso, verificou-se que os brotos angiogênicos da cultura SV sofrem desdiferenciação venosa (perda da expressão COUP-TFII), mecanismo semelhante à angiogênese SV in vivo1. Esses dados sugerem que o sistema de cultura in vitro explanta fielmente restabelece eventos angiogênicos que ocorrem in vivo. Coletivamente, modelos in vitro de angiogênese descritos aqui são ideais para sondar mecanismos celulares e moleculares de angiogênese coronariana de forma de alto nível e acessível.
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Protocol
O uso de todos os animais neste protocolo seguiu as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso De Animais Institucionais da Ball State University (IACUC).
1. Estabelecer criadores de ratos e detectar plugues vaginais para gravidez espartífica
- Montar uma gaiola de criação de ratos com camundongos do tipo selvagem e camundongos fêmeas. Certifique-se de que a idade dos camundongos reprodutores é entre 6-8 semanas. Configure um par (1 macho e 1 fêmea) ou como trio (1 macho e 2 fêmea) para reprodução.
- Verifique se há um plugvaginal na manhã seguinte. Use uma sonda metálica angular para detectar um plugue profundo inserindo-o na abertura vaginal. Designe a manhã de um plugue vaginal positivo como embrionária dia 0.5 (e0.5).
NOTA: Um plugue vaginal pode ser superficial (que é facilmente visível, ver Figura 1) ou profundo (que não é facilmente visível). A presença de um plugue profundo bloqueará a inserção total da sonda, enquanto a ausência de um plugue permitirá a inserção total sem resistência. - Manter a gravidez cronometrada até que os embriões atinjam e11,5 nos quais serão colhidos. Para confirmar a gravidez antes da colheita dos embriões, registre o peso de camundongos fêmeas entre e7,5 e e11,5.
NOTA: O aumento diário do peso da mãe indicará uma gravidez bem sucedida, enquanto nenhuma mudança de peso indicará uma gravidez fracassada.
2. Colheita de embriões de camundongos gestantes
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: uma câmara de eutanásia CO2, 70% etanol, toalhas de papel, fórceps regulares, fórceps finos, 1x salino tampão de fosfato estéril (PBS), 10 cm placas de Petri estéril, recipiente com gelo, colher perfurada, estereomicroscópio dissecção.
- Coloque um rato e11.5 em uma câmara de eutanásia co2 limpa para sacrificá-lo. Feche a tampa da câmara para evitar que o rato escape.
- Depois que o mouse estiver preso na câmara de eutanásia, ligue o CO2. Certifique-se de regular a taxa de fluxo de CO2 por recomendações da IACUC (ou seja, deslocamento de 10-30% por minuto). Depois que o camundongo é completamente eutanizado, realize a luxação cervical para garantir a morte.
- Borrife o rato com 70% de etanol. Levante a pele sobre a barriga usando fórceps, faça uma pequena incisão usando uma tesoura e estenda a incisão lateralmente. Aumente a incisão anteriormente até o diafragma e exponha o chifre uterino contendo os embriões (Figura 2).
- Puxe a corda de embriões (chifre uterino + embriões) agarrando o útero e cortando-o livremente. Coloque a corda de embriões em 1x PBS estéril gelado.
- Disseque os embriões individuais do chifre do útero descascando o músculo uterino, saco de gema e amnion um por um(Figura 3A-F) um microscópio estereomicroscópio. Transfira os embriões limpos usando uma colher perfurada para uma placa de Petri contendo 1x PBS estéril no gelo. Certifique-se de manter os embriões frios.
3. Isolando corações de e11.5 Embriões
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: fórceps regulares, fórceps finos, 1x PBS estéril, 10 cm de placa de Petri estéril, placa de Petri estéril de 6 cm, recipiente com gelo, colher perfurada, estereomicroscópio de dissecção.
- Configure uma nova placa de Petri com gelo frio estéril 1x PBS um microscópio estereomicroscópio. Transfira um embrião do passo 2.5 para a placa de Petri para dissecar o coração.
- Remova a cabeça do embrião usando fórceps. Primeiro, aperte a cabeça entre os fórceps com uma mão e, em seguida, remova a cabeça raspando-a com a outra mão usando fórceps fechados(Figura 4A-C).
- Depois de remover a cabeça, oriente o embrião com seu lado ventral para cima, segurando o embrião com fórceps na barriga com uma mão(Figura 4D).
- Com a outra mão, abra a parede torácica do embrião fazendo primeiro uma pequena incisão no peito ligeiramente acima do diafragma usando fórceps finos. Em seguida, aumente a incisão com muito cuidado, inserindo fórceps fechados e rasgando a parede torácica abrindo os fórceps. Certifique-se de não empurrar muito fundo, o que pode danificar o coração. Com a ajuda dos fórceps, mantenha a parede torácica aberta para expor o coração e os pulmões na cavidade torácica(Figura 4E).
- Usando fórceps finos, mova suavemente o coração anteriormente (90°) e exponha a aorta/veia dorsal. Retire o coração/pulmões anteriormente capturando a aorta/veia dorsal na base do coração(Figura 4F-H).
NOTA: Seja gentil ao retirar o coração/pulmões para evitar o rasgo do SV, que está localizado no lado dorsal do coração. - Enxágüe o coração/pulmões com PBS frio 1x para remover as células sanguíneas.
- Repita as etapas 3.1-3.6 para remover o coração/pulmões dos embriões restantes. Certifique-se de manter o coração/pulmões isolados no gelo.
4. Isolando SVs e Ventrículos de e11.5 Corações de Rato Embrionários
- Coloque a placa de Petri com coração/pulmões do passo 3.7 um microscópio estereomicroscópio para isolar os SVs e ventrículos inteiros. Retire os lóbulos anexados dos pulmões um por um de suas raízes usando fórceps finos.
- Oriente o coração em seu lado dorsal e remova atria e o tecido adjacente que circunda o SV anteriormente sem rasgar o SV. Remova o atria esquerdo e direito do coração segurando-o em sua base e raspando-o usando fórceps finos(Figura 5B). Remova o tecido adjacente ao redor do SV usando uma técnica semelhante(Figura 5C).
NOTA: Tenha em mente que o átrio direito está ligado ao SV, por isso tenha cuidado para apenas remover o átrio. - Para isolar o SV, primeiro oriente o coração com seu lado dorsal voltado para cima (porque o SV está no lado dorsal) e mantenha o coração ainda nesta posição, segurando suavemente o coração em seus ventrículos com fórceps.
NOTA: O SV é um órgão de entrada de um coração embrionário que fica entre o árto no lado dorsal do coração. - Remova o SV tirando-o cuidadosamente do coração onde está preso ou segurando o SV na base do seu acessório com fórceps finos e raspando-o com fórceps fechados(Figura 5D,E).
- Transfira o SV isolado para uma nova placa de Petri de 6 cm com 1x PBS estéril e gelado no gelo usando uma pipeta de transferência estéril e rotule a placa de Petri como SV.
- Para isolar os ventrículos inteiros, remova o trato de saída (aorta e tronco pulmonar) do coração após a remoção do SV (Figura 5F,G).
- Transfira os ventrículos inteiros para uma nova placa de Petri de 6 cm contendo 1x PBS estéril no gelo usando uma pipeta de transferência estéril e rotule a placa de Petri como ventrículo. Mantenha o SV isolado e ventrículos no gelo.
- Repita as etapas 4.1-4.7 para isolar SVs e ventrículos dos corações restantes.
5. Configuração de placas de cultura de tecido com inserções e revestimento de matriz extracelular
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: solução de matriz extracelular comercial (ECM; por exemplo, Matrigel), 8,0 μM de polietileno tereftalato (PET), 24 placas de poço, 37 °C, incubadora de 5% CO2.
- Deixe a solução ECM descongelar no gelo. Mantenha a solução ECM no gelo para evitar solidificação.
- Coloque as pastilhas de cultura de membrana PET (tamanho dos poros = 8,0 μm, área de filtragem = 0,3 cm2, diâmetro do filtro = 6,5 mm) nos poços de cultura não tecidual tratados 24 placas de poço. Rotular as placas como SV ou ventrículos para os ensaios de angiogênese endocárdica ou endocárdica, respectivamente.
NOTA: Configure as pastilhas em placas separadas para o SV e os ventrículos quando realizar ambas as culturas simultaneamente. Certifique-se de configurar poços suficientes para todas as amostras experimentais e controles. - Depois que a solução ECM for descongelado, diluir imediatamente o ECM 1:2 no meio basal pré-refrigerado (ou seja, meio basal EBM-2, consulte Tabela de Materiais) para um volume suficiente (100 μL/inserir x número de inserções).
NOTA: Por exemplo, se houver seis pastilhas, então o volume total será de 100 μL x 6 = 600 μL. Adicione 200 μL de ECM em 400 μL de meio basal. - Cubra as pastilhas com 100 μL de ECM recém-diluído adicionando-o diretamente em cima da membrana. Incubar a placa a 37 °C por pelo menos 30 min para permitir que o ECM se solidifique.
NOTA: Isto deve ser realizado uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar para evitar contaminação.
6. SVs e Culturas de Ventrículos Inteiros
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: 70% de etanol, pipeta de transferência, estereótipo, fórceps, capa de cultura de tecido de fluxo laminar, kit de suplemento celular endotelial microvascular(Tabela de Materiais),meio basal, 1x PBS estéril. A Figura 6 mostra o fluxo de trabalho da cultura SV e ventrículo.
- Descongele o conteúdo do kit de suplemento suplementar no gelo. Prepare o meio completo adicionando todo o conteúdo do kit de suplemento em 500 mL de meio basal uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar certificada. Misture bem o meio e distribua em alíquotas de 50 mL.
- Esterilizar a base do microscópio estereomicroscópio e área de trabalho circundante com 70% de etanol.
- Obter as placas de cultura de tecido a partir do passo 5.4. Com o auxílio de uma pipeta de transferência, transfira cuidadosamente as explantas do passo 4.7 em cima da membrana de inserção. um microscópio estereomicroscópio e com o auxílio de fórceps limpos, posicione as plantas no centro das pastilhas para garantir que não fiquem presas no canto das pastilhas ou presas às paredes laterais.
- Depois que as explantas forem colocadas e centradas nas pastilhas, remova cuidadosamente qualquer PBS extra das pastilhas e feche as tampas das placas.
- uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar, adicione 100 μL do meio completo pré-aquecido em cima das pastilhas e 200 μL nos poços para cultivar as explantas na interface ar-líquido de tal forma que a superfície basal da inserção esteja em contato com o meio , mas a superfície superior está exposta ao ar.
NOTA: Certifique-se de ajustar o volume para obter uma interface ar-líquido se utilizar diferentes inserções de tamanho/placas de poço. - Adicione 300 μL de PBS nos poços não utilizados das 24 placas de poço e cubra com a tampa. Incubar a placa em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2, e cultivar as culturas por 5 dias.
- Nos dias seguintes, observe rotineiramente as culturas um microscópio de luz invertida para avaliar o estado das culturas explantes. Certifique-se de que as explantas exibem batida contraída e que todas as explantas estão presas à parte inferior da membrana embutida com ECM. Tome nota de qualquer explante flutuante.
NOTA: A contração periódica das explantas indica que elas estão vivas. Explantas flutuantes devem ser omitidas da análise. - Depois de avaliar o status da cultura, coloque a placa de cultura de volta na incubadora e continue a cultivar a cultura por até 5 dias.
7. Tratamento de Culturas com VEGF-A (Controle Positivo)
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: capa de cultura de tecido de fluxo laminar, 1x PBS, meio basal + 1% de soro bovino fetal (FBS), meio basal + VEGF-A, pipetas e pontas de pipeta.
- Prepare o meio basal + 1% FBS e o meio basal + VEGF-A.
- Para preparar o meio basal + 1% FBS, primeiro determine o número de poços de controle necessários. Por exemplo, se houver três poços de controle, então 300 μL/poço x 3 = 900 μL é o volume total necessário. Adicione 9 μL de FBS em 891 μL de meio basal para fazer o meio basal + 1% FBS.
- Para preparar o meio basal + VEGF-A, primeiro determine o número total de poços que necessitam do meio VEGF-A. Se houver três poços, então 300 μL/poço x 3 = 900 μL é o volume total e 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Adicione 150 ng de VEGF-A em 900 μL de meio basal para fazer o meio basal + VEGF-A.
NOTA: Monte esta solução em um volume maior do que o calculado para assegurar um número suficiente de alíquotas menores para cada experimento.
- No dia 2, retire a mídia de ambas as câmaras (as pastilhas e os poços). Lave culturas com 300 μL de 1x PBS adicionando 100 μL às pastilhas e 200 μL nos poços. Gire firmemente as placas algumas vezes e remova o PBS.
- Adicione 300 μL de meio basal + 1% FBS (100 μL na inserção e 200 μL nos poços) para matar de fome as culturas por 24 horas.
- No dia 3, após a fome, adicione 300 μL de meio basal + 1% FBS (100 μL na inserção e 200 μL nos poços) nos poços de controle e meio basal + VEGF-A (50 ng/well) nos poços de tratamento, respectivamente.
- Após o tratamento, continue a cultivar as culturas na incubadora.
8. Fixação e Imunocoloração
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: 4% de paraformaldeído (PFA), 1x PBS, anticorpos primários e secundários, um shaker, 0,5% surfactante nonionico em PBS (PBT).
- No sexto dia de cultivo, remova as culturas médias e de lavagem com 1x PBS à temperatura ambiente (RT).
- Corrija as culturas adicionando 200 μL de solução PFA de 4% nos poços e 100 μL nas pastilhas. Fixar culturas em 4 °C por 20 min enquanto balança.
- Após 20 min de fixação, remova pfa das culturas em uma capa de fumaça e lave as culturas com 1x PBS adicionando 200 μL nos poços e 100 μL nas pastilhas.
- Repita as lavadas 3x, 10 min cada, enquanto balança. Em seguida, proceder à realização de imunocoloração.
NOTA: Todas as etapas de lavagem são realizadas em uma bancada no RT.
- Diluir anticorpos primários (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) na solução de bloqueio (5% de soro de burro, 0,5% PBT). Adicione 300 μL de solução de anticorpos primários (200 μL nos poços inferiores e 100 μL nas pastilhas). Incubar culturas em anticorpos primários durante a noite a 4 °C enquanto balança.
NOTA: Anti-VE-Cadherin é usado para rotular a membrana celular endotelial e anti-ERG 1/2/3 é usado para rotular o núcleo celular endotelial, a fim de visualizar os brotos angiogênicos de células endoteliais. - No dia seguinte, lave e balance as placas de cultura 10x em 0,5% de PBT, mudando PBT a cada 10 min.
- Diluir os anticorpos secundários (burro anti-rato Alexa Fluor 488 e burro anti-coelho Alexa Fluor 555) na solução de bloqueio. Adicione 300 μL do anticorpo secundário como no passo 8.2 e incuba rastas as culturas durante a noite a 4 °C enquanto balança. No dia seguinte, lave os anticorpos secundários 10x em PBT, mudando PBT a cada 10 min.
NOTA: Lave um mínimo de 10x, mas mais lavelas são melhores. Depois que as lavadas são completas, as culturas podem ser armazenadas com 1x PBS até que sejam montadas em slides.
9. Culturas de montagem em slides, imagens e análises
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: pinças finas, lâminas, meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenillindole (DAPI), tampas e microscópio confocal. Após a coloração de anticorpos secundários, monte as culturas em slides para imagens usando as seguintes etapas.
- Retire a membrana cuidadosamente da inserção usando fórceps finos e transfira-a para as lâminas colocando o lado da membrana para baixo e colocando as culturas explantem para cima. Coloque as amostras de réplica nos mesmos slides e rotule os slides como controle ou VEGF-A. Adicione algumas gotas de meio de montagem com DAPI diretamente na membrana e cubra os slides com deslizamentos de cobertura.
NOTA: Certifique-se de evitar bolhas de ar enquanto coloca as tampas. - Feche as bordas dos slides com esmalte claro e deixe secar.
NOTA: Os slides podem ser armazenados em -20 °C para armazenamento a longo prazo. - Slides de imagem usando um microscópio confocal.
- Realizar análises para medir o comprimento do crescimento angiogênico. Quantifique o comprimento de crescimento angiogênico medindo a distância das células endoteliais (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) estendidas do limite interno das células ERG 1/2/3+ nas culturas do ventrículo e do centro das explantas SV nas culturas SV.
- Para realizar a quantificação usando FIJI/ImageJ, primeiro baixe o software FIJI.
- Abrir arquivos de imagem em FIJI: vá para File | Aberto | Pasta | Nome do arquivo | Abra.
- Vá analisar | Definir medidas | Selecione Perímetro.
- Selecione a ferramenta Linha reta na janela principal.
- Desenhe uma linha através do comprimento de um broto, conforme sugerido na etapa 9.4.
- Vá analisar | Medida.
NOTA: As medidas de comprimento são exibidas na nova janela. - Realize quantificação em imagens que representam pelo menos três campos de exibição selecionados aleatoriamente. Média das medidas de comprimento de broto e reportá-las como média ± desvio padrão.
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Representative Results
Uma das características mais marcantes da angiogênese sv in vivo é que ela segue um caminho específico e envolve eventos de desdiferenciação celular e rediferenciação que ocorrem em tempos etinitários e posições1. À medida que as células SV iniciais crescem no ventrículo cardíaco, elas param de produzir marcadores venosos como o COUP-TFII(Figura 7). Posteriormente, brotos coronários tomam dois caminhos de migração, seja sobre a superfície do coração ou nas profundezas do miocárdio. Os vasos superficiais eventualmente se tornam veias enquanto os vasos invasores tornam-se artérias e capilares1,6,7. Essa distinção é preservada à medida que o coração cresce e a vasculatura coronária se expande.
Para facilitar a descoberta dos fundamentos moleculares do desenvolvimento coronário, criamos um modelo in vitro de broto de SV que pode ser utilizado para experimentos de perda de função e ganho de função. O tecido SV dos corações embrionários do rato é dissecado, colocado sobre o topo do ECM diluído (que está comercialmente disponível, ver Tabela de Materiais),e mantido na interface ar-líquido no meio de crescimento celular endotelial. O miocárdio SV continua a bater durante todo o período cultural. Após 2 dias na cultura, as células epicárdicas que reparam o tecido saem do explante e migram para a matriz. Após 5 dias, as células endoteliais SV brotam e migram para o tecido epicárdico(Figura 8A,pontas de flechas negras). Coletivamente, esse processo recapitula aspectos angiogênicos do desenvolvimento coronário.
Brotos sv cultivados também sofrem desdiferenciação venosa. Como no coração embrionário, a expressão COUP-TFII é reduzida à medida que os vasos migram para longe do SV (Figura 8B, em comparação com a Figura 7). Vasos de controle como artérias e veias de saco de gema ou umbilicais podem produzir vasos brotos. No entanto, eles são menos numerosos e menores em comprimento e não alteram sua identidade arterial ou venosa (não mostrada). Assim, a reprogramação venosa é específica para o broto de SV e não uma característica geral da angiogênese ou uma resposta aos componentes do ECM. Esses dados também indicam que os tipos de células contidos no próprio SV são necessários e suficientes para induzir a desdiferenciação.
Sabe-se que o fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) é um potente indutor da angiogênese7,13,14,15,16,17,18. Estudos anteriores mostraram que o miocárdio VEGF-A estimula a angiogênese endocárdica para crescer vasos coronários7. Além disso, as células endoteliais coronárias têm sido demonstradas para expressar o receptor VEGF-A, e os vasos coronários derivados de SV no miocárdio podem crescer em resposta ao VEGF-A in vivo2. Para mostrar que nosso modelo in vitro de angiogênese coronariana responde fielmente ao VEGF-A, estimulamos culturas SV e Endo com VEGF-A. Como esperado, nossos resultados mostraram que tanto o SV quanto o Endo são altamente responsivos ao VEGF-A. Culturas estimuladas com VEGF-A mostram aumento do crescimento de brotos angiogênicos tanto em densidade quanto em comprimento(Figura 9A,C). As culturas SV estimuladas pelo VEGF-A mostram um aumento de quase 3 vezes no comprimento do broto em comparação com o controle(Figura 9B). Esses resultados sugerem que brotos endoteliais de SV e Endo respondem a sinais semelhantes que são conhecidos in vivo.
Juntos, nossos dados sugerem que essas culturas explantes in vitro compartilham eventos celulares e moleculares semelhantes que ocorrem durante o desenvolvimento coronário in vivo, incluindo desdiferenciação venosa e crescimento robusto em resposta à estimulação VEGF-A. Portanto, nossos dados sugerem que esses modelos de cultura explante são úteis para estudar angiogênese coronariana in vitro.
Figura 1: Identificação do plugue vaginal. (A)Um plugue vaginal (mancha branca). (B) Visão ampliada da região encaixotada, incluindo o plugue vaginal (indicado por seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Acessando a corda embrionária no útero de um rato gestante. Um rato gestante eutanizado é posicionado com sua superfície ventral para cima e pulverizado com 70% de etanol para pele molhada para dissecção. A pele é puxada para cima na região pélvica usando fórceps e uma pequena incisão é feita. A incisão é estendida lateralmente. Uma incisão adicional é feita anteriormente até o diafragma. No útero, uma seqüência de embriões é visível (indicado por pontas de flecha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dissecção e remoção de embriões do útero. (A) Imagem mostrando o útero contendo uma seqüência de embriões. A membrana no lado dorsal do embrião (oposto ao lado onde a placenta está localizada) é descascada. (B) O embrião no saco de gema torna-se visível depois de descascar a membrana do útero. (C,D) O embrião ligado à placenta com o cordão umbilical é visível depois de descascar o saco de gema. Amnion é descascado se ainda estiver presente. (E) Imagem mostrando um embrião ligado à placenta pelo cordão umbilical. (F) Imagem mostrando a retirada do embrião da placenta puxando o cordão umbilical (Umb. Cordão) usando fórceps. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Remoção do coração/pulmão arrancado dos embriões. (A,B) A cabeça é removida do embrião capturando-a no pescoço e raspando-a. (C) Imagem mostrando a remoção da cabeça do corpo. (D)O posicionamento correto do embrião para dissecção cardíaca. O embrião é posicionado com o lado ventral para ter fácil acesso à cavidade torácica para a remoção do coração. Uma vez que o embrião é posicionado como mostrado em D, a cavidade torácica é aberta com fórceps. (E) Imagem mostrando a cavidade torácica aberta com o coração exposto em seu lado ventral. (F) Para remover o coração sem danificar o SV, o coração é virado anteriormente, e a aorta dorsal torna-se visível. (G) Imagem mostrando a posição na base do coração/pulmões onde a aorta/veia dorsal é capturada com fórceps e a arrancada coração/pulmão é retirada anteriormente. (H) A imagem mostra o coração/pulmões e11,5 arrancados do embrião. V. coração = coração ventral; d. coração = coração dorsal; d. aorta = aorta dorsal; LA = átrio esquerdo; RA = átrio direito; LV = ventrículo esquerdo; RV = ventrículo direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Isolando SV e ventrículos de corações embrionários. (A) Imagem mostrando a visão dorsal do coração/pulmões isolados arrancada do embrião e11.5. A localização do SV no coração é indicada. (B) Imagem do coração após a remoção dos botões pulmonares. (C)Atria e tecidos adjacentes ao redor do SV são removidos, revelando a aorta. A localização do SV está rotulada. (D) Imagem mostrando a remoção do SV. Usando fórceps, o SV é agarrado em sua base e é raspado do coração. (E) SV removido do coração é mostrado junto com o tecido restante do coração. O tronco aorta e pulmonar (PT), chamado coletivamente de trato de saída (OFT), tornam-se visíveis no coração após a retirada do SV. O SV será usado para cultura in vitro, conforme descrito na Figura 6 (painel esquerdo). (F) A posição do OFT a ser dissecada é marcada por uma linha branca tracejada. (G) Aorta/PT (trato de saída) é removido dos ventrículos por dissecção na posição indicada no painel F. Os ventrículos restantes sem o OFT são usados para culturas de ventrículo, conforme mostrado na Figura 6 (painel direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Esquema mostrando o fluxo de trabalho da cultura SV e ventrículo. Esquerda: Procedimento para cultura SV. Primeiro, o SV é removido de corações e11,5 e colocado em uma inserção de cultura. A inserção contém membrana porosa na parte inferior (8 μm poro) e é revestida com fator de crescimento reduzido ECM. As pastilhas são colocadas nos poços de uma placa de 24 poços. O meio é adicionado tanto na câmara inferior quanto na câmara superior sem cobrir a explanta. A cultura é cultivada por 5 dias. Após 5 dias, a membrana é removida da pastilha e montada nas lâminas para imagens e análises. Certo: Procedimento para cultura ventrícula. Ventrículos sem o SV, atria e OFT são removidos dos corações e11,5 e são cultivados como descrito acima para o SV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: A expressão COUP-TFII é perdida nos brotos SV in vivo. (A) Visão dorsal de e11,5 corações. Imagem confocal do marcador endotelial (vermelho) que rotula o sinus venosus (SV), brotos coronários (cs, linha pontilhada) e endocárdio (endo) forrando o lúmen do coração. (B) O fabricante venoso COUP-TFII (verde), um fator de transcrição venosa (trx), expresso no SV, é progressivamente perdido à medida que os brotos saem do SV e crescem sobre o ventrículo. Certo: Maior ampliação do broto coronário mostrado na região encaixotada do painel A. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Modelos in vitro de identidade venosa e reprogramação. (A)Imagem brightfield de tecido SV cultivado. Brotos vasculares (pontas de flecha) crescem a partir da explanta original (linha pontilhada preta) sobre o substrato eCM. (B) Imunofluorescência de culturas SV rotuladas com anticorpos que marcam a superfície celular endotelial (VE-Cadherin), núcleos de células endoteliais (ERG 1/2/3) e núcleos venosos e epicárdicos (COUP-TFII). Os núcleos são positivos tanto para ERG 1/2/3 quanto PARA COUP-TFII no SV, mas ERG 1/2/3 apenas em brotos migrando sobre o ECM. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: SV e endocárdio respondem ao VEGF-A in vitro. (A) Imagem confocal do controle de 5 dias de idade e cultura de explante SV tratada VEGF-A. As células endoteliais são imunosmaçadas com VE-cadherin (verde), núcleos de células endoteliais manchados com anticorpos ERG 1/2/3 (vermelho) e núcleos celulares com DAPI (azul). (B) O crescimento angiogênico das células endoteliais é quantificado medindo o comprimento da extensão de broto (a distância migrada por células endoteliais ERG 1/2/3+ da explanta, indicada por linhas sólidas brancas nos painéis inferiores de (A). (C) Imagem confocal de uma cultura de 5 dias de idade de um controle e ventrículos tratados VEGF-A. As células endoteliais são imunosmculadas com ve-cadherin (verde) e núcleos de células endoteliais são manchadas com anticorpos ERG 1/2/3 (azul). Os dots são medidas individuais e as barras de erro são médias ± Barra de escala SD = 200 μm(A,C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Algumas das etapas mais críticas para o crescimento com sucesso de vasos coronários dos tecidos progenitores SV e Endo são: 1) Identificar e isolar corretamente o tecido SV para a cultura SV; 2) utilizar ventrículos de embriões entre as idades de e11-11,5 para cultura endo precisa; 3) manter as condições estéreis durante todo o período de dissecção e manter os tecidos frios o tempo todo; e 4) manter as explantas presas à membrana revestida de ECM para evitar que o tecido flutuasse no meio.
Primeiro, o isolamento do tecido SV pode ser desafiador. É importante perceber que o SV está no lado dorsal do coração entre a atria esquerda e a direita escondida dentro dos lóbulos pulmonares. Portanto, é difícil separar e isolar. Em vez disso, todo o coração/pulmão deve ser extraído primeiro. O SV é então isolado da arrancada removendo cuidadosamente os lóbulos pulmonares e limpando os tecidos adjacentes com a ajuda de fórceps finos. Além disso, deve-se ter muito cuidado ao limpar os tecidos adjacentes para não perder o SV.
Em segundo lugar, para uma angiogênese endocárdica precisa, é importante cultivar ventrículos de embriões não mais antigos que e11,5. Em e12,5 e embriões mais velhos, as coronárias do SV crescem em uma proporção significativa dos ventrículos. Portanto, os vasos coronários que crescem a partir de ventrículos mais velhos podem ser constituídos pelos vasos coronários derivados de SV e Endo1,2,10,19,20. Por essa razão, para avaliar com precisão o crescimento do vaso coronário do Endo, é fundamental para a cultura dos ventrículos (menos SV e do trato de saída) a partir de embriões e11,520. Além disso, o SV é relativamente maior e é mais fácil de isolar em e11.5.
Terceiro, porque o protocolo envolve uma quantidade substancial de trabalho fora da capa de cultura de tecidos, é fundamental manter um ambiente de trabalho estéril. É importante esterilizar as ferramentas de dissecção (fórceps, tesouras, etc.) e as placas de cultura tecidual e evitar o contato com áreas não estéreis o tempo todo. É importante pulverizar a área de trabalho e o escopo de dissecção com 70% de etanol. Para evitar contaminação, é importante realizar o procedimento de dissecção rapidamente e minimizar o trabalho fora da capa de cultura tecidual.
Em quarto lugar, para obter culturas saudáveis de explante, é importante que as explantas permaneçam presas à base da membrana o tempo todo. As explantas flutuantes no meio devem ser evitadas para cultivar com sucesso as culturas explantes. Para evitar flutuar, é fundamental manter uma interface ar-líquido onde a superfície basal da inserção esteja em contato com o meio, mas a superfície superior está exposta ao ar. Tal interface é obtida quando a explanta é suficientemente coberta pelo meio, mas não está totalmente submersa. É importante monitorar o volume do meio diariamente, pois o volume pode ser perdido para a evaporação. Para evitar isso, a placa de cultura pode ser umidificada adicionando PBS nos poços não utilizados das placas de cultura.
Culturas de explante semelhantes de SV e Endo são descritas em outros lugares20. Nesses métodos, as explantas foram cultivadas diretamente nos poços das placas de cultura de tecidos, o que limita a imagem confocal de alta resolução. As imagens capturadas neste cenário são relativamente pobres em qualidade em comparação com o método aqui proposto, limitando análises microscópicas detalhadas. Para contornar isso, utilizamos inserções de cultura das quais as membranas contendo a cultura podem ser descascadas e montadas nas lâminas de vidro para imagens. Isso permite imagens confocais de alta resolução onde detalhes celulares como padrões de expressão e morfologia podem ser vistos. Além disso, a cultura diretamente nas placas requer um protocolo de coloração separado para DAPI ou outra coloração de marcador pan-nuclear. Este protocolo não requer etapas de coloração separadas porque os slides podem ser montados com meio de montagem contendo DAPI. Além disso, a montagem em slides permite o armazenamento a longo prazo sem desbotamento fluorescente, enquanto as culturas armazenadas em poços com meio líquido resultarão em desbotamento rápido e não são passíveis de armazenamento e imagem a longo prazo.
Os modelos de cultura in vitro descritos aqui são ideais para interrogar mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana de forma de alto nível e acessível. Este sistema in vitro pode ser usado para testar drogas potenciais ou alvos moleculares para avaliar seu efeito na angiogênese coronariana. Além disso, este sistema também pode ser usado para estudar o ganho de função e perda de função de vários genes para sua função autônoma na angiogênese coronariana. Observamos que brotos coronários de SV seguiram a migração epicárdica em nossas culturas in vitro, sugerindo uma importante interação entre células endoteliais coronárias e células epicárdicas. É sabido que o epicárdio é uma rica fonte de fatores de crescimento para angiogênese coronariana a partir do SV. Por exemplo, fatores de crescimento derivados do epicárdio, como vegf-C e ELABELA, foram previamente mostrados para regular a angiogênese coronariana derivada de SV2,19. Podemos usar este sistema de cultura SV para investigar a interação entre as células endoteliais coronarianas e identificar novas vias moleculares derivadas do epicárdio da angiogênese coronariana. Além disso, nossos dados in vivo sugerem que a hipóxia miocárdica pode estar envolvida na angiogênese endocárdica19. Nosso sistema de cultura in vitro oferece um excelente modelo para estudar o papel da hipóxia na angiogênese endocárdica, incubando as culturas em condições hipóxica ou normoxica. Estes são experimentos difíceis de realizar in vivo porque requer que um rato grávido seja colocado em uma câmara hipóxica controlada. A partir de nossa própria experiência, é muito desafiador obter resultados consistentes e confiáveis a partir de experimentos in vivo. Em resumo, nosso modelo in vitro de angiogênese coronariana fornece um sistema confiável para interrogar uma ampla gama de questões relacionadas à biologia celular e molecular da angiogênese coronariana.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos membros do laboratório Sharma por fornecer um ambiente de pesquisa de apoio. Gostamos de agradecer especialmente a Diane (Dee) R. Hoffman que mantém e cuida da nossa colônia de ratos. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. Philip J. Smaldino e Carolyn Vann por revisarem completamente o manuscrito e fornecerem comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos do Ball State University Provost Office and Department of Biology to B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant funds to B.S, e NIH (RO1-HL128503) e the New York Stem Cell Foundation fundos para K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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