Summary
इसके साथ ही, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में डीएनए मिथाइलेशन के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। प्रक्रिया अध्ययन के लिए प्रासंगिकता की है कि जीन के मिथाइलेशन पैटर्न और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में कैंसरजनन के लिए योगदान कारकों के बीच संबंधों की जांच ।
Abstract
डीएनए मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक परिवर्तन है जो जैविक रूप से सार्थक है और कैंसर अनुसंधान का लगातार ध्यान केंद्रित करता है। जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) घातक की मिथाइलेशन स्थिति का सटीक विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक उपयोगी उपाय है। डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण के कई संभावित अनुवादात्मक उपयोगों को देखते हुए, चिकित्सकों और डीएनए मिथाइलेशन अध्ययनों के लिए नए दूसरों का अभ्यास करने के लिए कदम से कदम समझने में सक्षम होने की जरूरत है कि कैसे इन जीनोम व्यापक विश्लेषण किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, हम तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं जो जीनोम-व्यापी विश्लेषण के दौरान सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। स्पष्ट रूप से और संक्षिप्त लिखा है, इन तीन तरीकों अक्सर कमी है और एपिजेनेटिक अध्ययन के लिए उन नए करने के लिए ध्यान देने योग्य नहीं हैं । हमने जीआई द्रोह (गैस्ट्रिक कैंसर) के 48 नमूनों का उपयोग व्यावहारिक रूप से उजागर करने के लिए किया कि जीआई घातक के लिए जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण कैसे किया जा सकता है।
Introduction
एपिजेनेटिक्स डीएनए1के अनुक्रम में परिवर्तन किए बिना जीन कार्य में वंशानुगत परिवर्तनों को संदर्भित करता है । इस तरह के बदलाव डीएनए मिथाइलेशन के कारण हो सकते हैं, जिसमें डीएनए बेस पर मिथाइल ग्रुप क्रोमेटिन पैकिंग में बदलाव के जरिए जीन एक्सप्रेशन को बदल सकते हैं । कैंसर का विकास और प्रगति हो सकती है यदि इस प्रभाव के परिणामस्वरूप ट्यूमर दबाने वाले जीन की अभिव्यक्ति बदल जाती है2. उम्र बढ़ने और पुरानी सूजन कैंसर के कारण हैं और मनुष्यों में डीएनए मिथाइलेशन में परिवर्तन के मुख्य कारणहैं 3,4,5. नतीजतन, यह कैंसर निदान में एक बायोमार्कर के रूप में डीएनए मिथाइलेशन के उपयोग की अनुमति देता है, और उपचार और रोकथाम के लिए एक लक्ष्य के रूप में। जल्दी पता लगाने और कैंसर रोग का निदान करने के लिए, डीएनए मिथाइलेशन ट्यूमर, रक्त, मूत्र, और मल के नमूनों में मापा जा रहा है6,जबकि demethylating एजेंटों अब इस तरह के myelodysplastic सिंड्रोम7के रूप में ल्यूकेमिया के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है ।
जीनोम-वाइड डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण मानव जीनोम में एक व्यक्ति सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच का उपयोग जीनोम डीएनए8,9में 450,000 से अधिक सीपीजी साइटों की मिथाइलेशन स्थिति की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो कैंसर एपिजेनेटिक्स की खोज की अनुमति देता है (सामग्री की तालिकादेखें)। संपूर्ण जीनोम बिसल्फी अनुक्रमण (डब्ल्यूजीबीएस) प्रौद्योगिकियों ने एपिजेनेटिक्स10,11के क्षेत्र में हमारे दृष्टिकोण को बदल दिया है। हालांकि,10,11नमूनों की एक बड़ी संख्या के एपीजेनेटिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और प्रसंस्करण समय के संदर्भ में प्रौद्योगिकियों के लिए कुछ नुकसान हैं। इसलिए, मानव जीनोम में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच अधिक व्यवहार्य है। जीनोम-व्यापी मिथाइलेशन विश्लेषणों के लिए दृष्टिकोणों की उपलब्धता में पिछले कुछ वर्षों में सुधार हुआ है और हमें अपने ज्ञान का विस्तार करने की अनुमति देता है कि डीएनए मिथाइलेशन कैंसर के विकास और प्रगति12में कैसे योगदान देता है । माइक्रोएरे-प्लेटफ़ॉर्म दृष्टिकोणों में हाल की प्रगति हमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर13में एक उपन्यास एपिजेनेटिक हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए जीनोम-वाइड मिथाइलेशन विश्लेषण का औचित्य प्रदान करती है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इस बात का विस्तृत विवरण प्रदान करना है कि जीआई घातक में बायोमार्कर पहचान के लिए इस विधि का उपयोग कैसे किया जाता है।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं का पालन संस्थानों की मानव अनुसंधान आचार समिति के नैतिक मानकों के अनुसार किया गया । इस अध्ययन को जंटेन्डो विश्वविद्यालय शिज़ुओका अस्पताल में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और पूर्वव्यापी डिजाइन के कारण लिखित सूचित सहमति को माफ कर दिया गया था ।
1. स्लाइड्स धोना
- अन दाग औपचारिक-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) वर्गों के 10 माइक्रोन तैयार करें।
- स्लाइड्स में देखें ग्लास स्लाइड होल्डर: टिश्यू कम से कम होने और ज्यादा स्लाइड्स की जरूरत होने तक करीब 3-5 सबसे बड़ी क्रॉस-सेक्शनल स्लाइड्स का इस्तेमाल करें।
- जाइलीन के साथ स्लाइड धारक भरें, और सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर सभी ऊतक जलमग्न है । 15 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
- 15 मिनट के बाद, एक पिपेट टिप के साथ आयोजित स्लाइड्स के साथ जाइलीन डाल दें ताकि स्लाइड बाहर गिर न जाएं।
- पहले की तरह ही स्तर पर अधिक जाइलीन में डालो। एक और 15 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें ।
- 15 मिनट के बाद, जाइलीन को फिर से बाहर निकालें।
- 100% इथेनॉल (EtOH) के साथ स्लाइड धारक भरें, और सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर सभी ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है। 3 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
- स्लाइड्स को ध्यान से पकड़े हुए एटोह से दूर रखें। अधिक EtOH के साथ एक ही स्तर पर फिर से भरना। 2 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
- फिर से एटोह बंद डालो और स्लाइड हटा दें। ध्यान से उन्हें सूखने के लिए एक साफ कागज तौलिया पर चेहरा जगह है। 10 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
2. स्लाइड्स को खुरचते हुए
- डाइथाइलपिंकार्बोनेट (डीईपीसी) के 650 एमएल के साथ पाचन/लाइसिस बफर तैयार करें- उपचारित पानी, एथिलेंडियामाइमेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) का 100 मिलीलीटर, 50 मिलीलीटर ट्रिस हाइड्रोक्लोराइड (ट्राइस-एचसीएल) 2 एम पीएच 8.8, और 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) (सामग्री की तालिकादेखें) का 200 मिलियन।
- पाचन के 80 माइक्रोन के साथ 1.5 एमएल सिंगल-यूज पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब भरें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- बफर में एक साफ पिपेट टिप रखो।
- उपयुक्त एच एंड ई दाग अनुभाग के अनुसार मैक्रोडिसेक्शन के लिए सबसे उपयुक्त ट्यूमर क्षेत्र के कैंसर ऊतकों की पहचान करें।
नोट: मैक्रोडिसेक्शन के लिए ट्यूमर क्षेत्र की पहचान अधिमानतः दो योग्य रोगविज्ञानियों द्वारा की जानी चाहिए। - चिह्नित एच एंड ई दाग अनुभाग के आधार पर मैक्रोडिसेक्ट कैंसर ऊतक।
- एक साफ रेजर ब्लेड लें और धीरे-धीरे स्लाइड से कैंसर के ऊतकों को परिमार्जन करें, इसे एक टुकड़े में रखने की कोशिश करें ताकि इसके साथ काम करना आसान हो।
- बफर युक्त एकल उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब से पिपेट टिप लें और स्क्रैप किए गए ऊतक को बफर शीशी (सामग्री की तालिकादेखें) में स्थानांतरित करने के लिए इसका उपयोग करें।
नोट: गीली टिप ऊतक को आकर्षित करना चाहिए, जो हस्तांतरण को आसान बनाता है।
- आगे की स्लाइड्स में देखें स्टेप 2.5 के साथ।
- सभी ऊतकों के बाद एकल उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में है, टिप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न है और ट्यूब की दीवार के लिए अटक नहीं है ।
- शीशी में सबटाइसिन से संबंधित सेरीन प्रोटीज़ का 20 माइक्रोल जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे से झटका (सामग्री की तालिकादेखें)।
- शीशी को कम से कम 4 घंटे या रात भर के लिए 55 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखें। 2 घंटे के बाद थोड़ा भंवर सुनिश्चित करें।
3. बिसुलफिट उपचार
- नमूने के रूप में पचा ऊतक समाधान के 45 माइक्रोन का प्रयोग करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बिसुलफिट रूपांतरण किट में रिएजेंट्स का उपयोग करके बिसुल्फिट उपचार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- डीएनए नमूने में कमजोर पड़ने वाले बफर के 5 माइक्रोन जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- जबकि नमूने इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, डीएच 2 ओ के 750 माइक्रोन और210माइक्रोन डिलेवरी बफर को सीटी कन्वर्जन रिएजेंट (सामग्री की तालिकादेखें) की एक ट्यूब में जोड़कर बिसुल्फिट कन्वर्जन रिएजेंट तैयार करें। ट्यूबों को 10 मिनट के लिए भंवर से मिलाएं।
- 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक नमूने में तैयार सीटी रूपांतरण रिएजेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें और उलटा करके मिलाएं।
- 12 से 16 घंटे तक 50 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों को हटा दें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
- बाध्यकारी बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा प्रत्येक नमूना मिश्रण (सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक नमूने को स्पिन कॉलम में लोड करें और कॉलम को 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- 1 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने को पूरी गति (10,000 x ग्राम)पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- प्रत्येक कॉलम में वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और 1 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन करें, प्रवाह के माध्यम से त्यागें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- प्रत्येक कॉलम में 200 माइक्रोन ऑफ डेस्ल जोड़ें और कॉलम को 15 मिनट (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के बाद, कॉलम को 1 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- प्रत्येक कॉलम में 200 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें और 1 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- इस कदम को एक बार और दोहराएं।
- प्रत्येक कॉलम में डीएच2ओ के 46 माइक्रोन जोड़ें और प्रत्येक कॉलम को एक नए बाँझ 1.5 एमएल एकल-उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब (सामग्री की तालिकादेखें) में रखें। डीएनए को elute करने के लिए प्रत्येक ट्यूब को 2 मिनट के लिए स्पिन करें।
- प्रत्येक स्पिन कॉलम को एकल उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब से हटा दें और त्यागें (सामग्री की तालिकादेखें)। डीएनए अब विश्लेषण के लिए तैयार है ।
4. मानव जीनोम में सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के मूल्यांकन के लिए सरणी मंच
- निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार किए गए बाद के डेटा विश्लेषण (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ, वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन और डिटेक्शन इंस्ट्रूमेंट पर एफएफपीई क्यूसी परख का उपयोग करके डीएनए (गुणवत्ता जांच: क्यूसी) की गुणवत्ता का आकलन करें।
नोट: अनुशंसित 5.0 से कम ∆सीक्यू मूल्यों वाले नमूनों को आगे14संसाधित किया जाता है। - जीनोम में 450,000 सीपीजी साइटों की मिथाइलेशन स्थिति का आकलन करने के लिए डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच के साथ नमूनों का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें)। सरणी मंच के लिए उत्पाद सूचना पत्र, डेटा शीट और उत्पाद फाइलें15उपलब्ध हैं।
नोट: परख FFPE सामग्री14के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है । - एक β-मूल्य के रूप में एक सरणी मंच के लिए एक डेटा विश्लेषण उपकरण में उच्च और निम्न लोकस मिथाइलेशन की गणना करें, क्रमशः 0 से 1 तक की सीमा के साथ (सामग्री की तालिकादेखें)। β-मूल्य की गणना करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
- डीएनए मिथाइलेशन प्लेटफॉर्म के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी प्लेटफॉर्म पर आर सॉफ्टवेयर वातावरण (आर वी.वी.2.15.1) में उत्पन्न डेटा आयात करें और उन्हें मिथाइलेशन सरणी16, 17का विश्लेषण करने के लिए एक उपकरण का उपयोग करके संसाधित करें।
नोट: हीटमैप पर, जो डेटा विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके उत्पन्न होता है, कॉलम को अपर्यवेक्षित क्लस्टरिंग द्वारा ऑर्डर किया जाता है, जबकि पंक्तियों का क्रम ऊपर से नीचे तक अंतर मिथाइलेशन के लिए टी आंकड़ों के घटते महत्व पर आधारित होता है। - अपर्यवेक्षित क्लस्टरिंग में पहले अंतर का उपयोग करके हीटमैप को उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में विभाजित करें।
नोट: मात्रात्मक मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर (क्यूएमएसपी) के साथ सत्यापन के लिए, प्रमोटर क्षेत्र में सीपीजी द्वीपों के संबंध में एक बड़े β-मूल्य के आधार पर जीन का चयन करें, और क्यूएमएसपी के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन के लिए उनकी उपयुक्तता के कारण।
5. मात्रात्मक मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर (क्यूएमएसपी)
- प्रत्येक जीन विश्लेषण में प्रमोटर क्षेत्र के मिथाइलेशन का मूल्यांकन करने के लिए क्यूएमएसपी में फ्लोरेसेंस आधारित वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में चरण 3.3 से बिसुल्फिट-संशोधित डीएनए का उपयोग करें।
- 96-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके क्यूएमएसपी करें।
- 200 एनएम फॉरवर्ड प्राइमर, 200 एनएम रिवर्स प्राइमर और 80 एनएम जांच का उपयोग करके बिसुल्फिट-संशोधित डीएनए पर लक्ष्य जीन की प्रमोटर मिथाइलेशन स्थिति की जांच करें। 16.6 mm (एनएच4) 2एसओ4,67m Tris पीएच 8.8, के साथ मास्टर मिश्रण तैयार करें, 10 एमएमएम β-मर्केप्टोथेनॉल, 10 एनएम फ्लोरोसेइन, प्रत्येक डिऑक्सी न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट का ०.१६६ एमएम, और डीएनए पॉलीमरेज का ०.०४ यू/माइक्रोन (सामग्री की तालिकादेखें) । सभी परख के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 25 माइक्रोन है।
- क्यूएमएसपी की साइकिलिंग इस प्रकार करें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 55 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
नोट: लक्ष्य जीन बड़ा बीटा मूल्यों होने के मापदंड के आधार पर चुना जाना चाहिए, प्रमोटर क्षेत्र में CpG द्वीपों से संबंधित होने के नाते, और प्राइमर और qMSP के लिए जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त जा रहा है ।
- एक सकारात्मक मिथाइलेशन नियंत्रण (सामग्रीकी तालिका देखें) के रूप में सीपीजी मिथाइलेज (एमएसएसI) के साथ इलाज किए गए मानव जीनोमिक का उपयोग करें।
नोट: मिथाइलेशन के अंतिम मात्राकरण को सापेक्ष मिथाइलेशन मूल्य (आरएमवी) के रूप में परिभाषित किया गया है, और β-ऐक्टिन (एसीटीबी)18के लिए मतलब सीटी की तुलना में प्रत्येक मिथाइलेशन डिटेक्शन दोहराने के लिए 2-ΤΤCt के रूप में गणना की गई है। प्राइमर और जांच दृश्यों को तालिका 1में दिखाया गया है। 100 की एक सीटी का उपयोग अज्ञेय प्रतिकृति के लिए किया जाता है, जो शून्य के करीब 2-10सीटी का मूल्य देता है। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग किया जाता है: मतलब 2-Τ ΤCt (RMV) = (2-Τ,11 Ct_replicate_1 + 2-Τ,11 Ct_replicate_2 + 2-Τ,11 Ct_replicate_3)/318।
Representative Results
प्रशिक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ 48 रोगियों की विशेषताएं इस प्रकार हैं(तालिका 2):रोगियों की औसत आयु 74 वर्ष (52-89 वर्ष) थी, और पलटन में 38 पुरुष (79.2%), और 10 महिलाएं (20.8%) शामिल थीं। 35 मरीज थे (72.9%) प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर के साथ और 13 रोगियों में (27.1%) अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर के साथ (प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर: पेट में एक गैर-मेटास्टेटिक द्रोह की पहली घटना; अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर: अवशेष पेट में कैंसर जो डिस्टल गैस्ट्रेक्टॉमी के बाद 5 साल से अधिक विकसित हुआ, मूल पुनर्सेक्शन19के कारण की परवाह किए बिना)। 23 मरीज थे (47.9%) लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और 25 रोगियों के साथ (52.1%) बिना। सबसे पहले, सभी ४८ नमूनों (प्रशिक्षण पलटन) outliers(चित्रा 1A)की पहचान के लिए लोड किए गए थे । दो नमूनों चोटियों कि दो मानक दूसरों से विस्थापित विचलन से अधिक थे दिया, और इन नमूनों को हटा दिया गया(चित्रा 1B)। इसलिए डीएनए प्रमोटर हाइपरमेथाइलेशन द्वारा 46 नमूनों को क्लस्टर किया गया। परिणामी हीटमैप को उच्च और निम्न मिथाइलेशन(चित्रा 2)के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया गया था। यह हीटमैप अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट (टीएसएस) के 1,500 बीपी के भीतर शीर्ष 50 जांच के दृश्य की अनुमति देता है। उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूह एक आक्रामक घातक फेनोटाइप से संबंधित चिकित्सकीय कारकों में भिन्न थे। यही है, कैंसर के प्रकार (प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर: पीजीसी) (पी = 0.01, बाधाओं अनुपात = 9.09 (1.67-50.00)) और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस की उपस्थिति (सकारात्मक) (पी = 0.03, बाधाओं अनुपात = 6.82 (1.16-40.08)) महत्वपूर्ण स्वतंत्र भविष्य कहनेवाला कारकों के रूप में उभरा जब चिकित्सकीय कारकों बहुविग्रहिक विश्लेषण(तालिका 3)में covariates के रूप में इस्तेमाल किया गया. अंत में, हमने माइक्रोएरे विश्लेषण में उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में प्रशिक्षण पलटन को संहिताबद्ध करने के लिए EPB41L3 जीन20,21 (टेबल 1में दिखाए गए प्राइमर और प्रोब सीक्वेंस) की पहचान की। क्यूएमएसपी का उपयोग करके, परीक्षण पलटन (126 नमूनों) में EPB41L3 के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामों को मान्य किया गया था। परीक्षण पलटन में रोगियों की विशेषताओं को तालिका 4में दिखाया गया है। पीजीसी ऊतकों में EPB41L3 के RMVs एकवायण विश्लेषण (पी = 0.01)(चित्रा 3A)में अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर (आरजीसी) में उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। इसी तरह, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस वाले नमूनों में आरएमवी लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (पी = 0.03)(चित्र 3बी)के बिना उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। इस तरह, डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण हमें जीआई घातक रोगियों में कुछ नैदानिक स्थिति की विशेषता के लिए विशिष्ट जीन की पहचान करने में मदद कर सकता है।
चित्रा 1: 48 नमूनों (प्रशिक्षण पलटन) में बीटा मूल्य। सभी 48 नमूने (प्रशिक्षण पलटन) लोड किए गए थे और आउटलर्स की जांच की गई थी(ए)। दो नमूनों में चोटियां थीं जो आउटलर्स थीं, और इन्हें हटा दिया गया था(बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: परिणामी हीटमैप। शेष 46 नमूनों को डीएनए प्रमोटर हाइपरमेथाइलेशन द्वारा संकुल किया गया था। हीटमैप को उच्च और निम्न मिथाइलेशन समूहों में विभाजित किया गया था। यह हीटमैप अंतर मिथाइलेशन विश्लेषण में ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट (टीएसएस) के 1,500 बीपी के भीतर शीर्ष 50 जांच के दृश्य की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर (पीजीसी) बनाम अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर (आरजीसी) में EPB41L3 के लिए सापेक्ष मिथाइलेशन मूल्य (आरएमवी) और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस के साथ और बिना मामलों में। परीक्षण पलटन (126 नमूनों) में EPB41L3 के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण के परिणामों को क्यूएमएसपी का उपयोग करके मान्य किया गया था। (क)एक्यूविलेट विश्लेषण में, पीजीसी ऊतकों में EPB41L3 के आरएमवी आरजीसी (पी = 0.01) की तुलना में काफी अधिक थे। (ख)इसी तरह, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस वाले नमूनों में आरएमवी लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (पी = 0.03) के बिना उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| जीन | फॉरवर्ड 5 '- 3' | रिवर्स 5 '- 3' | जांच |
| बी-ऐक्टिन | टैग GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG टीटी | एएसी एसीए सीएए टीएए सीएएए सीएए एटीटी सीएसी | \ 56-FAM\ TGT GGG GTG \ ZEN \ GTG ATG GAG GAG GTT टैग \ 3IABkFQ \ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | एटीए एएए एटीसी सीसीजी एसीजी एसीसी जीए | एएए टीटीसी GAA एएए सीसीजी सीजीसी जीएसी जीसीसी गाया एसीसी ए |
तालिका 1: प्राइमर और जांच दृश्यों।
| क्लीनिकोपैथिक कारक | चर | |
| उम्र | 74 (52 - 89) * | |
| लिंग | पुरुष/महिला | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| प्रकार | पीजीसी/आरजीसी | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| लिम्फ नोड मेटास्टेसिस | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर, आरजीसी: अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर | ||
| * औसत (न्यूनतम-अधिकतम) | ||
तालिका 2: प्रशिक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ 48 रोगियों में विशेषताएं।
| पी-वैल्यू | बाधाओं अनुपात | 95% आत्मविश्वास अंतराल | |
| प्रकार (पीजीसी) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| पीजीसी: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर | |||
तालिका 3: उच्च मिथाइलेशन समूह (क्लस्टर बी) के लिए भविष्य कहनेवाला कारक।
| क्लीनिकोपैथिक कारक | चर | |
| उम्र | 71 (33 - 86) * | |
| लिंग | पुरुष/महिला | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| प्रकार | पीजीसी/आरजीसी | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| लिम्फ नोड मेटास्टेसिस | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: प्राथमिक गैस्ट्रिक कैंसर, आरजीसी: अवशेष गैस्ट्रिक कैंसर | ||
| * औसत (न्यूनतम-अधिकतम) | ||
तालिका 4: परीक्षण पलटन में गैस्ट्रिक कैंसर के साथ १२६ रोगियों में विशेषताओं।
Discussion
डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण से सटीक परिणाम प्राप्त करने में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं । पहला प्रतिनिधि एच एंड ई दाग वर्गों के आधार पर अधिमानतः दो योग्य रोगविज्ञानियों द्वारा ट्यूमर क्षेत्र का मैक्रोडिसेक्शन है। गलत मैक्रोडिसेक्शन आसन्न गैर-कैंसर ऊतकों के साथ संदूषण का कारण बन सकता है, जो अविश्वसनीय परिणाम पैदा करता है; इस प्रकार, सावधान मैक्रोडिसेक्शन की आवश्यकता है। दूसरा डीएनए गुणवत्ता का आकलन है (गुणवत्ता की जांच: QC) । क्यूसी (∆सीक्यू और 5.0) को विफल करने वाले नमूने खराब गुणवत्ता वाले आंकड़े दे सकते हैं। इसलिए, ∆Cq और gt; 5.0 वाले नमूनों को हटाया जाना चाहिए और अन्य का उपयोग किया जाना चाहिए। तीसरा चरण β-मूल्य की गणना है, जो ऐरे प्लेटफॉर्म सॉफ्टवेयर के लिए एक डेटा विश्लेषण उपकरण द्वारा मेथिलेटेड सिग्नल/कुल (मिथाइलेटेड + अनमेथाइलेटेड) सिग्नल17के रूप में निर्धारित किया जाता है। β-मूल्य 0-1 (या 0%-100%) से होता है, जो जैविक रूप से17की व्याख्या करना सरल है। इस मूल्य के साथ मुख्य समस्या इसकी खराब सांख्यिकीय गुण है, क्योंकि इसकी उच्च विषमता का तात्पर्य है कि मिथाइलेशन रेंज चरम सीमा (β = 0 या β = 1) पर नमूनों में भिन्नता17को अत्यधिक कम कर दी गई है। इसके अलावा, खराब नमूना गुणवत्ता के कारण, β-मान प्रजनन योग्य बिफेसिक चोटियों22नहीं दिखा सकते हैं, और ऐसी चोटियों के बिना नमूनों को आगे के अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, बड़े बीटा मूल्यों होने, प्रमोटर क्षेत्र में सीपीजी द्वीपों से संबंधित होने और क्यूएमएसपी के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त होने के मापदंड के आधार पर लक्ष्य जीन चुना जाना चाहिए ।
मानव जीनोम में सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का मूल्यांकन माइक्रोएरी-आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके किया जाता है जिसमें विशिष्ट जीनोमिक लोकी का सर्वेक्षण करने के लिए जांच की एक निश्चित संख्या होती है। यह एपिगेनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (ईडब्ल्यूएएस) में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, इसकी कम लागत, डीएनए की छोटी मात्रा और स्पष्ट रूप से कम नमूना प्रसंस्करण समय के कारण, जो कई नैदानिक नमूनों23के उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण की अनुमति देता है। हालांकि, एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए एक सरणी मंच एपिले आनुवंशिक रूप से परिवर्तित लोकी के लिए जांच की संख्या और विशिष्टता से सीमित है, जो कुछ जीनोमिक क्षेत्रों की खोज को रोकता है। डब्ल्यूजीबीएस को आम तौर पर जीनोमिक कवरेज10 , 11के व्यापक स्पेक्ट्रम के कारण सोने के मानक विधि के रूप मेंदेखा जाताहै । हालांकि, इस विधि में10 , 11नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए पर्याप्त लागत और अपेक्षाकृत लंबी प्रसंस्करण समयहै। इस प्रकार, यह हमेशा संभव नहीं है। इसकी तुलना में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच लागत और जीनोमिक कवरेज के मामले में उपयोग के लिए उचित है। हाल ही में, नवीनतम उन्नत मनका चिप्स24का उपयोग करने के लिए तैयार हो गया है । ये परख हमें लगभग दोगुनी मापी गई सीपीजी साइटों का विश्लेषण करने में मदद कर सकती हैं, जो बड़े नमूना आबादी के लिए आदर्श जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (जीडब्ल्यूएएस) प्राप्त कर सकती हैं।
संक्षेप में, मानव जीनोम में एक व्यक्तिगत सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन के जटिल मूल्यांकन के लिए सरणी मंच के साथ डीएनए मिथाइलेशन जीनोम-वाइड विश्लेषण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में एपिजेनेटिक बायोमार्कर पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। WGBS के साथ तुलना में, यह विधि लागत प्रभावी है और नमूना प्रसंस्करण समय कम कर देता है । इसलिए, सीपीजी लोकस में डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए इस विधि का व्यापक रूप से एपिजेनेटिक बायोमार्कर अनुसंधान में उपयोग किए जाने की संभावना है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम विशेष रूप से सर्जरी विभाग के सभी सदस्यों के लिए आभारी हैं, सिडनी Kimmel व्यापक कैंसर केंद्र जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में उपयोगी चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए । हम क्रिस्टेन रोजर्स को बिसुल्फिट उपचार और क्यूएमएसपी के लिए प्रक्रियाओं पर उदार तकनीकी मार्गदर्शन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
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