Summary
Hier wird ein Verfahren zur reproduzierbaren und statistisch gültigen Bestimmung der Stärkegranulatgrößenverteilungen und zur Angabe der ermittelten Granulat-Lognormalgrößenverteilungen unter Verwendung einer Multiplikationsform mit zwei Parametern vorgestellt. Sie gilt für alle Granulatgrößenanalysen von gramgroßen Stärkeproben für die pflanzen- und lebensmittelwissenschaftliche Forschung.
Abstract
Stärke aus allen Pflanzenquellen besteht aus Granulaten in einer Reihe von Größen und Formen mit unterschiedlichen Vorkommensfrequenzen, d.h. mit einer Größe und einerFormverteilung. Stärkegranulatgrößendaten, die mit verschiedenen Arten von Partikelgrößentechniken ermittelt werden, sind aufgrund einer schlechten Reproduzierbarkeit oder mangelnder statistischer Signifikanz, die auf einige unüberwindliche systematische Fehler zurückzuführen ist, einschließlich der Empfindlichkeit gegenüber Granulatformen und der Begrenzung von Granulat-Probengrößen, häufig problematisch. Wir haben ein Verfahren für reproduzierbare und statistisch gültige Bestimmung enthoben, um die Größenverteilungen von Stärkegranulat mit der elektrischen Erfassungszonentechnik zu bestimmen und die ermittelten Lognormalgrößenverteilungen des Granulats unter Verwendung einer angenommenen Zwei-Parameter-Multiplikationsform mit verbesserter Genauigkeit und Vergleichbarkeit festzulegen. Sie ist auf alle Granulatgrößenanalysen von stärkegramgroßen Proben anwendbar und könnte daher Studien darüber erleichtern, wie Stärkegranulatgrößen durch die Stärkebiosynthesegeräte und -mechanismen geformt werden; und wie sie eigenschaftenund die Funktionalität von Stärke für Lebensmittel und industrielle Anwendungen beeinflussen. Repräsentative Ergebnisse werden aus Replizienanalysen der Granulatgrößenverteilungen von Süßkartoffelstärkeproben nach dem beschriebenen Verfahren präsentiert. Wir erörterten weiter einige wichtige technische Aspekte des Verfahrens, insbesondere die multiplikative Spezifikation von Granulat-Lognormalgrößenverteilungen und einige technische Mittel zur Überwindung häufiger Blendenverstopfungen durch Granulataggregate.
Introduction
Stärkegranulat ist die physikalische Struktur, in der zwei Hauptreserve-Homoglucan-Polymere in Pflanzenphotosynthese und Lagergeweben, die lineare oder spärlich verzweigte Amylose und das stark verzweigte Amylopectin, zusammen mit einigen nebensächlichen Komponenten, einschließlich Lipiden und Proteinen, geordnet verpackt sind. Stärkegranulate verschiedener Pflanzenarten weisen viele dreidimensionale (3D) Formen auf (rezensiert in Ref.1,2), einschließlich Kugeln, Ellipsoiden, Polyeder, Thrombozyten, Würfel, Quader und unregelmäßige Tubuli. Auch solche aus dem gleichen Gewebe oder verschiedenen Geweben der gleichen Pflanzenart könnten eine Reihe von Formen mit unterschiedlichen Vorkommenshäufigkeiten haben. Mit anderen Worten, Stärkegranulate einer Pflanzenart können eine charakteristische statistische Formverteilung haben, anstatt eine bestimmte Form. Die ungleichmäßigen und nicht-sphärischen Granulatformen erschweren die ordnungsgemäße Messung und Definition von Stärkegranulatgrößen. Darüber hinaus sind Stärkegranulate aus den gleichen Geweben einer Pflanzenart von einer Reihe von Größen mit unterschiedlichen Proportionen, d.h. mit einer charakteristischen Größenverteilung. Diese Größenverteilung erschwert die Analyse und Beschreibung von Stärkegranulatgrößen zusätzlich.
Die Stärkegranulatgrößen wurden mit verschiedenen Kategorien von Partikelgrößentechniken (in Ref.3) analysiert, einschließlich Mikroskopie, Sedimentation/serische Feldflussfraktionierung (Sd/StFFF), Laserbeugung und elektrischer Erfassungszone (ESZ). Diese Techniken eignen sich jedoch nicht gleichermaßen für die Bestimmung von Stärkegranulatgrößen in Gegenwart einer Granulatform und einer Größenverteilung. Die Mikroskopie, einschließlich Licht-, Konfokal- und Rasterelektronenmikroskopie, eignet sich hervorragend für die Studien der Morphologie4,5,6,7, Struktur8,9 und Entwicklung10,11 von Stärkegranulat, aber kaum geeignet, um ihre Größenverteilungen aufgrund einiger inhärenter Mängel zu definieren. Direkte Messungen von mikroskopischen Granulatbildern oder softwaregestützte Bildanalyse optischer Mikroskopiedaten (IAOM), die zur Bestimmung von Granulatgrößen von Stärke aus mehreren Arten verwendet wurden, einschließlich Mais12, Weizen13,14, Kartoffel15 und Gerste16, können nur 1D (in der Regel maximale Länge) oder 2D (Oberfläche) Größen von sehr begrenzten Mengen (Zehnbisen) von Granchulbildern messen. Die kleinen Granulat-Probenahmegrößen, die von Natur aus durch die Techniken eingeschränkt sind, könnten selten statistisch repräsentativ sein, wenn man die enormen Granulatzahlen pro Stärkeeinheit bedenkt (120 x 106 pro Gramm, unter der Annahme aller 10'm-Kugeln bei 1,5 g/cm3 Dichte) und daher zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen. Die Sd/StFFF-Technik kann eine hohe Geschwindigkeit und Auflösung und schmale Größenfraktionen von Stärkegranulat17aufweisen, wurde aber selten verwendet, wahrscheinlich weil ihre Genauigkeit durch Schäden, verschiedene Formen und Dichte von Stärkegranulat stark beeinträchtigt werden könnte. Die Laserbeugungstechnik ist die am weitesten verbreitete und wurde für Stärkegranulatgrößenanalysen für alle wichtigen Pflanzenarten3,14,16angewendet. Obwohl die Technik viele Vorteile hat, ist sie eigentlich nicht für die Bestimmung von Stärkegranulatgrößen in Gegenwart einer Granulatformverteilung geeignet. Die meisten gleichzeitigen Laserbeugungsinstrumente stützen sich auf die Mie-Lichtstreuungstheorie18 für einheitliche kugelförmige Partikel und die modifizierte Mie-Theorie18 für einige andere Formen der Homogenität. Die Technik ist daher von Natur aus sehr empfindlich gegenüber Partikelformen und nicht ganz geeignet, selbst für bestimmte Formen der Homogenität19, geschweige denn für Stärkegranulate mit unterschiedlichen Proportionen. Die ESZ-Technik misst die elektrische Feldstörung proportional zum Volumen des Teilchens, das durch eine Öffnung geht. Es bietet Granulatvolumengrößen, sowie die Anzahl und Volumenverteilung Informationen, etc., bei hohen Auflösungen. Da die ESZ-Technik unabhängig von allen optischen Eigenschaften von Partikeln wie Farbe, Form, Zusammensetzung oder Brechungsindex ist und die Ergebnisse sehr reproduzierbar sind, eignet sie sich besonders zur Bestimmung von Größenverteilungen von Stärkegranulaten mit einer Reihe von Formen.
Stärkegranulatgrößen wurden auch mit vielen Parametern definiert. Sie wurden oft vereinfacht durch durchschnittliche Durchmesser beschrieben, die in einigen Fällen das arithmetische Mittel der mikroskopisch gemessenen maximalen Längen von 2D-Bildern12,20oder Durchschnitte äquivalenter Kugeldurchmesser3waren. In anderen Fällen wurden die Granulatgrößenverteilungen unter Verwendung der Größenbereiche21,22, des mittleren Verteilungsvolumens oder des mittleren Durchmessers (Kugeläquivalent, gewichtet nach Zahl, Volumen oder Fläche) unter der Annahme einer Normalverteilung14,23,24,25,26angegeben. Diese Deskriptoren von Stärkegranulatgrößen aus verschiedenen Analysen sind sehr unterschiedlicher Natur und nicht streng vergleichbar. Es könnte sehr irreführend sein, wenn diese "Größen" von Stärkegranulaten verschiedener Arten oder sogar dieselben Gewebe derselben Art direkt verglichen würden. Darüber hinaus wurde der Streuparameter (oder Form-)Parameter der angenommenen Normalverteilungen, d. h. die Standardabweichung σ (oder grafische Standardabweichung σg), die die Breite der Verteilung (d. h. die Streuung der Größen) misst, in den meisten Studien ignoriert.
Um die oben genannten kritischen Probleme bei Derstärkegranulatgrößenanalysen zu lösen, haben wir ein Verfahren zur reproduzierbaren und statistisch gültigen Bestimmung von Granulatgrößenverteilungen von Stärkeproben mit der ESZ-Technik und zur korrekten Festlegung der ermittelten Granulatlognormalgrößenverteilungen unter Verwendung einer angenommenen Zweiparameter-Multiplikationsform27 mit verbesserter Genauigkeit und Vergleichbarkeit beschrieben. Zur Validierung und Demonstration führten wir anhand des Verfahrens Replizieren von Granulatgrößenanalysen von Süßkartoffelstärkeproben durch und spezifizierten die lognormalen Differenzvolumen-Prozentsatz-Volumen-Äquivalent-Kugeldurchmesserverteilungen mit ihren grafischen geometrischen Mitteln 
und multiplikativen Standardabweichungen s* in einer x/(multiplizieren und teilen) * Form.
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Protocol
1. Herstellung von Stärkeproben
- Bereiten Sie zwei (oder drei) Gramm-Replikations-Stärkeproben aus stärkeakkumulierenden Geweben verschiedener Pflanzenarten nach den etablierten Verfahren vor (z. B. Kartoffeln15, Süßkartoffeln28, Weizenkörner13,29und Maiskerne30usw.).
- Stärkeproben mit Aceton oder Toluin 3-4x gründlich waschen, um Granulataggregate zu minimieren und vollständig zu trocknen.
HINWEIS: Verwenden Sie Extraktionsverfahren, die mehr als 1 g Stärke pro Zubereitung ergeben. Ein oder zwei 0,5-g-Aliquots aus jedem der drei bzw. zwei Replizierungsextrakte werden für die Granulatgrößenanalyse eines Stärkeextrakts beprobt.
2. Elektrolyt-Vorbereitung
- 500 ml 50 g/L Lithiumchlorid in Methanol für vier Größenläufe für Replikationsstärkeproben vorbereiten (100 ml pro Lauf plus zusätzliche 100 ml). Vorzugsweise stellen Sie den Elektrolyt in großvolumigen Chargen, z.B. 4 bis 8 L gleichzeitig, her, um die Konzentrationsvariation zu minimieren.
- Kühlen Sie den Behälter auf Eis oder in einem 4 °C-Schrank, um die Auflösung des Lithiumchlorids zu beschleunigen.
3. Einrichten des Analysators
- Wählen Sie ein Blendenrohr mit einem Partikeldurchmesserbereich, der den bekannten (in der Literatur oder durch Versuchsläufe) Körnungsumfang von zu analysierenden Stärkeproben abdeckt, z. B. eine Blende von 100 m für Süßkartoffelstärken. Wählen Sie für Stärkeproben unbekannter Granulatgrößenbereiche eine geeignete Blende durch Versuchsläufe aus, wobei mehrere Blendenröhren mit überlappenden Partikeldurchmesserbereichen verwendet werden.
HINWEIS: Der Partikeldurchmesserbereich eines Blendenrohrs ist sein genauer Größenbereich zwischen 2 und 60 % und mit einem erweiterten Größenbereich von 80 % seines Öffnungsdurchmessers. Tabelle 1 listet die Eigenschaften von drei nützlichsten Blendenrohren für die Dimensionierung von Granulaten großer Pflanzenstärken auf. Wenn der Granulatgrößenbereich einer Stärkeprobe größer ist als der Größenbereich eines einzelnen Blendenrohrs, führen Sie eine Multi-Rohr-Überlappungsanalyse durch, bei der bis zu fünf Partikelgrößenverteilungen kombiniert werden, die mit Öffnungen unterschiedlicher Größe gemessen werden. Jede Öffnung ist durch ihren Durchmesser und ihre Teilenummer, die auf dem Rohr beschriftet ist, erkennbar. Der Durchmesser und die Seriennummer, die in einem Barcode auf dem Rohr enthalten sind, können mit dem Barcodeleser auf der Systemsteuerung des Analysators in die Analysatorsoftware eingescannt werden. - Wählen Sie einen 100 oder 200 ml analytischen Becher (über Küvetten) für die Bestimmung der Stärkegranulatgrößen, und richten Sie automatisches Rühren (unten) ein, um eine gute Granulatsuspension während der Messung aufrechtzuerhalten.
- Erstellen Sie eine Standard-Betriebsmethode (Standard Operating Method, SOM), um Ausführungseinstellungen anzugeben, und eine Einstellungsdatei zum Analysieren, Anzeigen und Drucken der Ergebnisse. Kombinieren Sie DIE SOM- und Preferences-Datei nach Bedarf in einem Standardoperatingverfahren (SOP).
ANMERKUNG: Verwenden Sie für nicht standardisierte Analysen SOM, um die Analysen auszuführen, und passen Sie die SOM-Einstellungen zwischen den Durchläufen durch das SOM-Fenster bearbeiten (siehe unten) nach Bedarf an. Analysieren, anzeigen und drucken Sie nach Abschluss der Ausführung die Ausführungsergebnisse, indem Sie die Einstellungen wie gewünscht ändern. Verwenden Sie für standardisierte Granulatgrößenanalysen ein SOP, um die Analysen auszuführen.- Starten Sie die Analyzer-Software. Klicken Sie auf der Hauptmanu auf SOP | SOM-Assistent erstellen oder SOM bearbeiten,oder klicken Sie im Statusbereich auf SOM bearbeiten. Verwenden Sie den Assistenten oder das SoM-Fenster Bearbeiten, um Einstellungen für ein SOM auszuwählen. Einstellungen, die typischerweise für die Größendimensionierung von Süßkartoffelstärkeproben verwendet werden, sind in Tabelle 2zusammengefasst.
- Speichern Sie das erstellte SOM in einer Datei im Fenster SOM Wizard-Zusammenfassung der Einstellungen oder im Fenster SoM bearbeiten.
- Klicken Sie auf das Hauptmanu auf SOP | Konfigurations-Assistenten oder Bearbeitungseinstellungenerstellen . Verwenden Sie den Assistenten oder die Registerkarten im Bearbeitungsfenster "Einstellungen", um die Voreinstellungseinstellungen wie die in Tabelle 3 oder anderen Einstellungen wie gewünscht auszuwählen.
- Speichern Sie die ausgewählten Einstellungen in einer Datei im Fenster Einstellungen erstellen-Zusammenfassung der Einstellungen oder im Fenster Einstellungen bearbeiten.
- Klicken Sie im Hauptmenü auf SOP | SOP-Assistent erstellen. Geben Sie im Anschluss an die Schritt-für-Schritt-Anleitung des Assistenten eine Beschreibung ein, wählen Sie die SOM- und Voreinstellungsdatei aus, um ein SOP zu erstellen und zuspeichern.
4. Granulatgrößenanalysen der Stärkeproben
- Vorbereiten des Analyzers
- Schalten Sie den Analyzer ein, öffnen Sie die Software im Computer und überprüfen Sie den Ready-Status oben im Statusbereich nach der automatischen Verbindung mit dem Analyzer.
- Füllen Sie das Elektrolytglas mit Elektrolyt, leeren Sie das Abfallgefäß bei Bedarf.
- Installieren und sichern Sie das gewählte Blendenrohr nach der Anleitung im Benutzerhandbuch. Für ein unkalibriertes neues Blendenrohr kalibrieren Sie es gemäß der Schritt-für-Schritt-Anleitung unter Kalibrieren | Kalibrieren Sie die Blende im Hauptmenü. Überprüfen Sie für ein kalibriertes Blendenrohr die Kalibrierung gemäß der Schritt-für-Schritt-Anleitung des Change Aperture Tube Wizard unter der Ausführung oder Kalibrierung | Überprüfen Sie die Blendenkalibrierung im Hauptmenü.
- Entsperren Sie die Assay-Plattform, indem Sie den Lock-Release-Clip (auf der mittleren Vorderseite der linken Probenfachwand) drücken und die Plattform manuell nach unten senken. Legen Sie einen analytischen Becher mit 100 ml Elektrolyt auf die Plattform, bewegen Sie den Rührer in die Rührposition und heben Sie die Plattform manuell in die selbstsichernde obere Position, um das Blendenrohr und den Rührer in den Elektrolyten einzutauchen.
- Klicken Sie auf die Werkzeugleiste des unteren Instruments füllen, damit der Analysator das System automatisch mit dem Elektrolyt füllt, und klicken Sie auf Löschen, damit der Analysator das System automatisch spült.
- Laden Sie das SOM, indem Sie auf SOP | Laden eines SOM im Hauptmenüklicken, und verwenden Sie soM, um eine Analyse ohne Voreinstellungsdatei auszuführen. Alternativ können Sie ein SOP laden, indem Sie auf SOP | Laden Sie ein SOP in das Hauptmenü oder soP laden im Statusbereich, und verwenden Sie den SOP, um eine Analyse auszuführen.
- Wenn Sie ein SOP verwenden, klicken Sie im Hauptmenü auf SOP | SOM-Informationen oder "Einstellungen" , um die SOM- und Voreinstellungseinstellungen zu überprüfen. Klicken Sie auf Beispiel | Geben Sie Beispielinformationen im Hauptmenü oder Bearbeiten von Informationen im Statusbereich ein, um die Beispielinformationen für den Lauf einzugeben.
- Vorbereiten von Stärke-Methanol-Proben und Größensuspensionen
- Wiegen Sie zwei oder eine 0,5 g Probe aus jedem der zwei oder drei replizierten Stärkeextrakte.
- Fügen Sie jedes der 0,5 g Stärke-Aliquots zu 5 ml Methanol in einem 50 ml konischen Zentrifugenrohr hinzu und verteilen Sie das Stärkegranulat mit mehreren Impulsen mit niedriger Intensität (12–24 W/cm2) von einem Ultraschallprozessor.
- Mit einer Einweg-Transferpipette einen kleinen Tropfen der Stärke-Methanol-Suspension (0,2 ml) auf die 100 ml 50 g/L LiCl-Methanolelektrolyt unter ständigem Rühren im Becher auftragen. Schließen Sie die Probenfachtür.
- Ausführen eines Größenlaufs
- Klicken Sie in der unteren Instrumentensymbolleiste auf Vorschau, um eine Vorschauausführung zu starten. Stellen Sie im Statusbereich sicher, dass der dynamisch angezeigte Konzentrationsbalken grün ist und einen nominalen Konzentrationsbereich von 5 bis 8 % für die Suspension anzeigt.
- Klicken Sie auf der unteren Symbolleiste auf Stopp, um die Vorschauausführung zu beenden. Verdünnen Sie bei Bedarf die Stärke-Elektrolyt-Aufhängung, indem Sie ein Aliquot der Suspension durch den Elektrolyten ersetzen, und wiederholen Sie dann einen Vorschaulauf.
ANMERKUNG: Der nominale Konzentrationsbereich der Suspension von 5 % bis 8 % ist für den Abschluss eines Durchlaufs ohne Stillstand aufgrund einer Blendenverstopfung durch aggregiertes Granulat von entscheidender Bedeutung. Passen Sie bei Bedarf die Tropfen-Probengröße und/oder die Konzentration der Stärke-Methanol-Suspension an, um eine neue Stärke-Elektrolyt-Suspension mit der Nennkonzentration im optimalen Bereich herzustellen. - Klicken Sie nach der Überprüfung auf Start in der unteren Symbolleiste, um die Ausführung zu starten. Der Analyzer schließt den Lauf automatisch ab, sobald die Gesamtanzahl der Körnchen in der Größe, die zusammen mit der Laufzeit im Statusbereich in einem Lauf angezeigt wird, die festgelegte Gesamtanzahl (125.000 oder 250.000) durch den Steuerungsmodus des SOM erreicht. Abhängig von der Suspensionskonzentration (innerhalb von 5-8% Bereich oder niedriger) dauert ein einzelner Lauf 2 bis 5 min oder mehr.
HINWEIS: Wenn der Analysator automatisch eine Blendenblockade pro Blockierungserkennungseinstellungen des SOM erkennt, bricht er den Lauf ab, bündig, um die Blende zu entsperren und eine neue Ausführung zu starten. Diese Blockierungsaktion wird so eingestellt, dass sie maximal viermal wiederholt wird, bevor der Analyzer den Ausführungsvorgang abbricht. Dieses Problem der Blockierung kann durch verwendung von zwei technischen Methoden gelöst werden, wie in Tabelle 2 und in der Diskussion ausführlich beschrieben. - Führen Sie bei Bedarf einen technischen Wiederholungslauf (siehe Tabelle 2 und im Gespräch beschrieben) mit derselben Stärke-Elektrolyt-Aufhängung durch, indem Sie einfach auf Start oder Repeat auf der unteren Symbolleiste klicken.
- Nach Abschluss eines Lauf- oder Wiederholungslaufs das Becherglas entleeren, mit Methanol abspülen und für den nächsten Lauf mit 100 ml frischer Elektrolytlösung nachfüllen.
- Wenn während eines Durchlaufs ein Benachrichtigungsdialogfeld für erweiterte Größenbereich angezeigt wird, wenn die Anzahl der Granulate größer als 60 m 0,1 % der Gesamtanzahl (pro SOM-Einstellung) überschreitet, klicken Sie auf Ausführen von 60 % bis 80 %, um einen erweiterten dynamischen Größenbereich bis 80 % des Blendendurchmessers auszuführen.
HINWEIS: Die Einstellung Erweiterte Größe steuert Aktionen für Granulate, die größer als 60 % des Blendendurchmessers (in diesem Fall 100 m) sind. Die Einstellung im SOM gibt die Aufnahme von Stärkegranulaten von mehr als 60 m an, wenn ihre Anzahl über 0,1 % der Gesamtanzahl erreicht. Der Abschluss des Laufs wird nach wie vor von der Gesamtanzahl gesteuert und kann etwas weniger Zeit in Anspruch nehmen als sonst, ohne dass das größere Granulat mit einem Gesamtwert von weniger als 0,1 % (vermutlich statisch unbedeutend) der Gesamtanzahl berücksichtigt wird.
- Analysieren der Ausführungsergebnisse
- Wenn ein SOM zur Steuerung der Durchläufe verwendet wurde, wählen Sie Einstellungen wie gewünscht für die Anzeige, den Druck und die statistische Analyse der Ergebnisse mithilfe des Assistenten zum Erstellen von Einstellungen oder der Bearbeitungseinstellungen unter dem SOP im Hauptmenü aus.
- Überlagerungen resultiert aus mehreren Durchläufen in einem einzelnen Diagramm zum Vergleich.
- Klicken Sie auf der Hauptsymbolleiste auf "Overlay" oder auf | Overlay im Hauptmenü, um auf das Overlay-Fenster zuzugreifen. Navigieren Sie zu und wählen Sie mehrere gewünschte Ergebnisdateien im Feld Dateien aus, klicken Sie auf Hinzufügen, um sie in das Feld Ausgewählte Dateien zu verschieben, und klicken Sie auf OK, um die ausgewählten Ergebnisse in einem einzelnen Diagramm zu überlagern.
- Um eine Datei zu einem geöffneten Overlay hinzuzufügen, klicken Sie auf RunFile | Öffnen Sie für Overlay im Menü Ausführen, um auf das Overlay-Fenster zuzugreifen, zur gewünschten Datei zu navigieren und auf hinzufügen zu klicken.
- Durchschnittliche Ergebnisse aus Replikationsanalysen (2 Extrakte x 2 Stärkeproben oder 3 Extrakte x 1 Stärkeprobenahme) und Anzeigen oder Drucken der durchschnittlichen Granulatgrößenverteilung und -statistiken in einer Liste oder einem Diagramm.
- Klicken Sie im Hauptmenü auf Datei | FileTool | Durchschnitt, um das Fenster Durchschnitt zu öffnen. Navigieren Sie zu und wählen Sie mehrere gewünschte Ergebnisdateien im Feld Dateien aus, klicken Sie auf Hinzufügen, um sie in das Feld Ausgewählte Dateien zu verschieben, und klicken Sie auf OK, um die ausgewählten Ergebnisse zu durchschnittlich zu machen und den Durchschnitt in einem einzelnen Diagramm anzuzeigen.
- Um eine zusätzliche Ergebnisdatei in eine durchschnittliche Verteilung einzuschließen, klicken Sie im Menü Ausführen auf RunFile | Öffnen und Zum Durchschnitt hinzufügen, um das Fenster Zum Durchschnitt hinzufügen zu öffnen, zu navigieren und die Datei hinzuzufügen. Der neue Durchschnitt wird im Diagramm im Fenster Ausführen (Ergebnis) oder in der Auflistung angezeigt.
5. Angabe der durchschnittlichen Verteilung
- Klicken Sie im Fenster Run-Menu, in dem die Durchschnittsverteilung angezeigt wird, auf | berechnen Durchschnittliche Statistiken im Ausführungsmenü, um das Zusammenfassungsfenster für Statistiken zu öffnen, in dem die durchschnittlichen Statistiken in Zeilen angezeigt werden, und die Diagrammstatistiken für die durchschnittliche Verteilung in den Spalten.
- Verwenden Sie den grafischen geometrischen Mittelwert (
) und S.D. (s*) in der Spalte Graphstatistik, um die durchschnittliche Verteilung in der Form x/ s* anzugeben. Berechnen Sie die CV-Messvariationen zwischen den gemittelten Replikationsverteilungen, indem Sie den Mittelwert (μ, das gleiche wie die durchschnittliche Verteilung) der geometrischen Mittelwerte der gemittelten Verteilungen mit dem durchschnittlichen S.D. (σ) dividieren, der in der durchschnittlichen Statistikzeile aufgeführt ist.
ANMERKUNG: Die durchschnittliche S.D. (für μ), die Variationen zwischen den Mittelwerten der Replikationsverteilungen bewertet, unterscheidet sich von der grafischen geometrischen S.D. (für ) zur Messung der Streuung der durchschnittlichen Verteilung.
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Representative Results
Um das Verfahren zu validieren und die Reproduzierbarkeit der ermittelten Granulatgrößenverteilung zu demonstrieren, haben wir Replizieren von Süßkartoffelstärkeproben durchgeführt. Wir haben Replizieren (S1 und S2) Stärkeproben aus Feldkartoffeln einer Zuchtlinie SC1149-19 in einem ähnlichen Entwicklungsalter mit einem zuvor beschriebenen Verfahren28vorbereitet. Aus jedem Stärkeextrakt wurden zwei 0,5 g Aliquots (a und b) entnommen, in 5 ml Methanol suspendiert und mit mehreren Impulsen von Niedrigenergie-Ultraschall beschallt, um Aggregate aufzubrechen. Jedes der beiden Paar Stärke-Methanol-Suspensionen wurde zu einer Stärke-Elektrolyt-Suspension, die dann zweimal (technische Wiederholungsläufe) mit dem oben beschriebenen SOM für eine Gesamtanzahl von jeweils 125.000 Granulaten bemessen wurde, abgesampelt. Wenn die Gesamtanzahl für jeden einzelnen Größenlauf mehr als 65.000 und 125.000 USD erreicht, ändert sich die grafische geometrische S.D. (s*) und der geometrische Mittelwert ( ) der angezeigten differenziellen Volumengrößenverteilung nicht mehr wesentlich. Jedes Paar der Wiederholungsläufe mit einer Stärke-Methanol-Suspension wurde nach Abschluss für eine Gesamtgrößenanzahl von 250.000 zusammengeführt.
Abbildung 1 zeigt differenzielle Volumen-Prozentsatz-Volumen-Äquivalent-Kugeldurchmesser-Verteilungen (S1a, S1b, S2a und S2b) für die vier Replizieren von Größenanalysen der Süßkartoffelstärkeproben und deren durchschnittliche Verteilung. Der Lebenslauf für den Durchschnitt der geometrischen Mittel der vier Replikationsverteilungen betrug 3,75 %, was eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit der Größenergebnisse zeigt. Jede der vier Replikationsverteilungen wurde aus einer sehr großen Stichprobengröße von 250.000 Granulaten ermittelt, die weit über die minimalen Anzahlen (65.000 und 125.000) hinausging, über denen sich die grafische geometrische S.D. (s*) und der geometrische Mittelwert ( ) der angezeigten differenziellen Volumengrößenverteilung in einem einzigen Größenlauf nicht mehr wesentlich ändern. Daher waren die ermittelten Replizien-Volumengrößenverteilungen alle statistisch gültig. Für eine bessere Genauigkeit und Vergleichbarkeit (siehe unten) der Spezifikation der ermittelten lognormalen Granulatgrößenverteilungen wurden alle diese Verteilungen unter Verwendung ihrer grafischen geometrischen Mittel ( ) und S.D. (s*) in einer x/ (multiplizieren und teilen) s* Form, wie im Diagramm aufgeführt, angegeben. Bitte beachten Sie, dass die Granulatgrößenverteilung der Süßkartoffelstärke streng wie zuvorbeschrieben 28angepasst wurde.
Abbildung 1: Lognormale Differenzvolumen-Prozentsatz-Volumen-Äquivalent-Kugelgrößenverteilungen aus replizierenden Größenanalysen von Süßkartoffelstärkeproben. Das Stichprobenschema für die vier Replikationsgrößenanalysen wurde im Ergebnis detailliert beschrieben. Die vier Verteilungen (S1a, S1b, S2a und S2b) aus Replikationsanalysen und ihr Durchschnitt wurden mit der x / (Multiplikation und Teilung) s* -Form überlagert und spezifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 zeigt die durchschnittlichen (oder mittleren) kumulativen (<) Anzahl- und Volumen-Prozentsatz-Größenverteilungen der vier replikationn Größenanalysen, bei denen es sich um Transformationsansichten der durchschnittlichen differenzierten Volumen-Prozentsatz-Größenverteilung handelte. Der Vergleich zwischen der kumulativen Anzahl und dem Volumenprozentsatz der Stärkegranulate zeigte, dass Granulate mit kleineren Volumenäquivalent-Kugeldurchmessern viel größere Prozentsätze der Gesamtanzahl ausmachten als das Gesamtvolumen. So entfielen z. B. 48,53 % der Gesamtanzahl auf die Anzahl der Granulate mit einem Volumenäquivalentdurchmesser kleiner oder gleich 9,976 m, aber nur 5,854 % des Gesamtvolumens.
Abbildung 2: Durchschnittliche kumulative (<) Anzahl- und Volumen-Prozent-Größenverteilungen von Stärkegranulat aus den vier Replizieren von Größenanalysen von Süßkartoffelstärkeproben. Bei den beiden Verteilungen handelt es sich um Transformationsansichten der durchschnittlichen Größenverteilung in Abbildung 1. Das Diagramm vergleicht die kumulative (<) Zahl (linke Y-Achse) mit Volumen (rechte Y-Achse) Prozentsätze von Stärkegranulaten mit Volumenäquivalent-Kugelgrößen kleiner oder gleich bestimmten Größenbehältern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Blendendurchmesser (m) | Partikeldurchmesserbereich (m) | Partikelvolumenbereich (m3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0,524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1,44 - 92,0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4,19 - 268 x 103 |
Tabelle 1: Drei nützlichste Blendenröhren zur Größenverkleinerung von Stärkegranulaten von Pflanzenarten.
| SOM-Einstellungen | Auswahl | |
| Beschreibung | SOM-Beschreibung | Größenstärke Granulat |
| SOM-Autor | - | |
| Beispielbeschreibung | Süßkartoffel-Stärkeproben | |
| Elektrolyt | 50 g L-1 Lithiumchlorid | |
| Dispergiermittel | Nein | |
| Blende | 100 m | |
| Steuerungsmodus | Steuerungsmodus | Gesamtanzahl [250.000] oder [125.000] |
| Abfalltank | Wenn 80% voll sind | |
| Ausführungseinstellungen | Beispielinformationen eingeben | Ja |
| Anzahl der Durchläufe | 1 (oder 2, für Wiederholungsläufe) | |
| Spülöffnungsrohr vor dem Lauf | Ja | |
| Spülöffnungsrohr nach dem Lauf | Ja | |
| Datei speichern | Ja, einschließlich Pulsdaten | |
| Exportdaten | Ja | |
| Bericht drucken | Ja | |
| Vergleichen mit Beispielspezifikationen | Nein | |
| ansehen | Größe | |
| Rührereinstellungen | Probebecher | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Rührer verwenden | Ja | |
| Geschwindigkeit | [15], CW (Uhrzeigersinn) | |
| Rührerposition | Automatisch | |
| Schwellenwert, Strom und Gewinn | Größenschwelle | 2 m |
| Blendenstrom | 1600 mA | |
| Preamp-Gewinn | 2 | |
| Erweiterter Größenbereich b | Bei Zählung [> 0,1%] der Gesamtanzahl | |
| Puls-zu-Größe-Einstellungen | Größenbehälter | 400 |
| Größenbereich | 2 bis 60 m | |
| Bin-Abstand | Log-Durchmesser | |
| Koinzidenzkorrektur | Ja | |
| Pulsbearbeitung | Nein | |
| Konzentration | Probenbetrag | 0,2 ml |
| Dichte | - | |
| Vorverdünnungsfaktor verwenden | - | |
| Analytisches Volumen | - | |
| Elektrolytvolumen | 100 ml | |
| Verwendung des Verdünnungsfaktors | Nein | |
| Blockade | Blockierungserkennung | Automatisch (ab Start des Laufs) |
| Standardblockerkennung: bei Zählrate <20 %, Aperturrate >40% oder Konzentrationsspitze >40%. | ||
| Blockadeaktion | Abbrechen, Entsperren und Neustarten,Bis zu [4] mal | |
| Symbol anzeigen | Ja | |
| Blockierungsmonitor | Zählrate | |
| a: Wenn wiederholte Sondierung und Neustart nicht den Größeren-Anzahl-Lauf abgeschlossen haben konnten, führen Sie zwei Wiederholungsläufe mit einer geringeren Gesamtanzahl von jeweils 125.000 aus derselben Stärke-Elektrolyt-Suspension aus, und führen Sie die Ergebnisse der Wiederholungsläufe zusammen, indem Sie [MergeRuns] unter [FileTools] von [Datei] im Hauptmenüverwenden. Alternativ können Sie die Stärke-Elektrolyt-Suspension durch eine neue mit einer niedrigeren Nennkonzentration (2-5%) ersetzen. Bei der Vorbereitung einer neuen Tropfen-Probe-Stärke-Elektrolyt-Suspension, Puls-Sonicat die Stärke-Methanol-Suspension wieder zu brechen mehr Aggregate. | ||
| b: Der erweiterte Größenbereich steuert Aktionen für Granulate, die größer als 60 % des Blendendurchmessers sind (in diesem SOM 100 m). Die Einstellung gibt die Aufnahme von Stärkegranulaten von mehr als 60 m an, wenn ihre Anzahl größer als 0,1 % der Gesamtanzahl ist. | ||
Tabelle 2: Typische SOM-Einstellungen zur Steuerung von Größenläufen für Süßkartoffelstärkeproben.
| Voreinstellungseinstellungen | Auswahl | |
| Gedruckte Berichte | Beispielinformationen | Beispiel, Ausführungsnummer, Größenabschnitte, Gesamtzahlen |
| Größendiagramme | Differenzvolumen %, Log X-Achse, Glatt nach Gruppen von sieben | |
| Größenstatistik | Volumen, Volumen % | |
| Durchschnittliche Statistiken | Gesamtbetrag, Mittelwert, S.D. | |
| Überlagerungsstatistiken | Gesamtbetrag, Mittelwert, S.D. | |
| Liste | Spalten: Lagerplatznummer, Lagerplatzdurchmesser (Mitte), Diff. Zahl, Diff. Zahl %, Diff. Volumen %. | |
| Bin-Gruppierung: Bin-Gruppe Größe 7, Alle Lagerplätze, Sum Bins in Gruppe. | ||
| Statistiken | Typ | Geometrischea |
| Bereich | Alle | |
| Zu druckende Ergebnisse | Bereich, Gesamtbetrag, Mittelwert, S.D., 95% Konfidenzgrenzen | |
| Ergebnisse auf Graph | Bereich: Alle, Gesamtbetrag, Mittelwert, S.D. | |
| Mittelung und Trend | Durchschnittliche Gewichtungb | Volumen % |
| Verteilungc | Differenzielle | |
| Grenzen | 2 S.D. | |
| Pulsmittelung | Verwenden von Impulsen in Größenbereich konvertieren | |
| Exportieren | Datenelemente | Beispielinformationen, Statistiken, Durchschnittsstatistik, Größenliste |
| Exporterweiterung | .xls | |
| Zahlenformat | 123456.78 | |
| Datenformat | Tab getrennt | |
| Exportordner | Aktueller Ordner | |
| Seiteneinrichtung | Benutzerdefinierter Titel einschließen, Diagramme mit Bildschirmfarbe einschließen Datum drucken | |
| Diagrammgröße: | Halbe Seite | |
| Graph-Option | Anzeigen: | Bildschirm- und Farbdrucker |
| Linienfarbe | (Standard) | |
| Linienstil | (Standard) | |
| Legende | Oben rechts | |
| Größe | (Standard) | |
| Graph-Stil | Schritt | |
| Limit-Stil | Kurve | |
| Schriftarten und Farben | Standardschriftarten und Standardfarben oder wie gewünscht. | |
| Optionen anzeigen | Standardansicht | Größe, Graph |
| Achse Größe X | Durchmesser | |
| Messen | Partikel | |
| Liter-Symbol | L (mL, l, fL) | |
| Multisizer-Pulsdaten | Grafik höchstens 5010 Impulse, Liste höchstens 5010 Impulse | |
| Volumeneinheiten | nr.3 | |
| Zahlen | 123456.78 | |
| a: Die hier angegebenen geometrischen Mittelwerte und S.D.-Statistiken sind grafische Statistiken, die den Maßstab und die Form der ermittelten differenziellen Volumen-Prozentsatz-Äquivalent-Sphärengrößenverteilung definieren. Sie werden verwendet, um die lognormale Verteilung in der X-̅* x/ s*-Form anzugeben. | ||
| b: Die durchschnittliche Gewichtung bezieht sich darauf, wie Ergebnisse aus mehreren Durchläufen durch verschiedene Gewichtungsoptionen gemittelt werden. Ändern Sie diese Einstellungen im Ausführungsmenü für verschiedene Mittelungs- und Ansichtsoptionen. | ||
| c: Wählen Sie [Berechnen], um [ Durchschnittsstatistik] im [Menü ausführen] zu öffnen, um die durchschnittlichen Statistiken in Zeilen anzuzeigen, die Graphenstatistiken für die durchschnittliche Verteilung in der Spalte "Mittelwert". | ||
Tabelle 3: Typische Präferenzeinstellungen für Ansicht, Analyse und Druck von Ergebnissen aus Größenläufen für Süßkartoffelstärkeproben.
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Discussion
Das beschriebene Verfahren hat einige kritische Probleme bei mehreren bestehenden Methoden für Stärkegranulatgrößenanalysen gelöst. einschließlich ungeeigneter 1D- oder 2D-Größe von 3D-Granulaten, Verzerrung von Größenmessungen durch nicht einheitliche Granulatformen, schlechte Reproduzierbarkeit und zweifelhafte statistische Gültigkeit aufgrund begrenzter Granulat-Probengrößen, ungenauer oder unsachgemäßer Spezifikation (insbesondere der Verwendung der durchschnittlichen Größe) von Granulatgrößen in Gegenwart sowohl von Granulatform als auch bei Nicht-Normalgrößenverteilungen. Es verwendet die ESZ-Technik, die 3D-Größen (Volumen) von Stärkegranulat misst und nicht auf Granulatformen reagiert. Der Entwurf, die durchschnittliche Granulatgrößenverteilung aus Replikationsanalysen mit einer sehr großen Granulat-Probengröße (4 x 250.000) abzuleiten, macht das Ergebnis nicht nur statistisch valid und reproduzierbarer, sondern verringert auch technisch Messverzerrungen durch aggregierte und beschädigte Granulate, um die Größengenauigkeit zu verbessern (siehe unten). Wie aus den repräsentativen Ergebnissen hervorgeht, ist der Lebenslauf für den Durchschnitt der mit dem Verfahren ermittelten geometrischen Mittel der Replikationsverteilung in der Regel kleiner als 5 %, was auf eine zufriedenstellende Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hindeutet. Darüber hinaus stellt die multiplikative Spezifikation sowohl der Skala ( ) als auch der Form(s*) der lognormalen Granulatvolumen-Äquivalent-Kugelgrößenverteilung die wahre Natur verteilter Granulatgrößen in einer Stärkeprobe genauer dar und ist einfach zu bedienen und universell vergleichbar bei Granulatgrößenanalysen von Stärke aus denselben oder verschiedenen Quellen. Daher ermöglicht das Verfahren eine genauere, reproduzierbare reproduzierbare und statistisch gültige Bestimmung der Stärkegranulatgrößen und eine korrekte Spezifikation der ermittelten Granulat-Lognormalgrößenverteilungen. Es gilt für alle Granulatgrößenanalysen von gramgroßen Stärkeproben und könnte ein wesentliches Werkzeug für Studien darüber werden, wie Stärkegranulatabmessungen durch die Stärkebiosynthesegeräte und -mechanismen in pflanzenstärkeakkumulierenden Geweben geformt werden und wie sie sich auf Eigenschaften und Funktionalitäten von Stärke für Lebensmittel und industrielle Anwendungen auswirken.
Stärkegranulate sind Stereopartikel mit meist nicht-sphärischen Formen, so dass ihre Größen definiert und in 3D-Begriffen gemessen werden müssen. Daher definieren die Volumen von Stärkegranulaten am besten ihre Größe, und der Volumen-Äquivalent-Kugeldurchmesser ist der einzige einzelne 1D-Größenparameter, der verwendet werden kann, um die Granulat-3D-Größen richtig zu beschreiben, da keine anderen Stereoobjekte als Kugel mit einem einzigen 1D-Größenparameter definiert werden können. Darüber hinaus besitzen Stärkegranulate aller Pflanzenarten eine Reihe von Formen mit unterschiedlichen Vorkommenshäufigkeiten. In Gegenwart einer solchen Formverteilung eignen sich alle Partikelgrößentechniken, die auf Partikelformen reagieren, z. B. die Laserbeugungstechnik, nicht für reproduzierbare und statistisch gültige Bestimmungen von Stärkegranulatgrößenverteilungen, da der diesen Techniken innewohnende Systemfehler nicht einfach mit einem Formfaktor korrigiert werden kann. Tatsächlich könnte die Fehlerrate (CV) unter den Replikationsanalysen von Granulatgrößen aus derselben Süßkartoffelstärkeprobe mit der Laserbeugungstechnik bis zu 15-20%28erreichen, was auf sehr schlecht reproduzierbare Größenergebnisse hindeutet. Leider wurden die Auswirkungen von Granulatformen auf die Größenstärke von Granulaten meist übersehen, was zu einem großen Körper zweifelhafter Stärkegranulatgrößendaten führte, die mit formresponsiven Partikelgrößentechniken in der Literatur erfasst wurden.
Die Multiplikationsspezifikation mit zwei Parametern definiert sowohl den Maßstab ( ) als auch die Form (s*) der lognormalen Verteilungen und ist daher wesentlich präziser und aussagekräftiger als ein einzelner Deskriptor der mittleren Größe oder ein Größenbereich26. Die multiplikativen x/ s*, x/ (s*)2, und x/ (s*)3 Intervalle, die 
± s, ± 2sund ± 3s Intervallen einer Normalverteilung entsprechen, umfasst ca. 68,3%, 95,5% bzw. 99,7% Konfidenzintervalle einer lognormalen Verteilung bzw.27. Der geometrische Mittelwert ( ) und S.D. ( s* ) einer lognormalen Granulatgrößenverteilung entsprechen dem grafischen geometrischen Mittelwert und S.D. der Größenverteilungskurve, die von der Analyzer-Software berechnet werden und während eines Größenlaufs oder der Analyse von Ergebnissen auf dem Bildschirm angezeigt werden können. Es ist daher ziemlich bequem und einfach, die multiplikative Spezifikation zu verwenden. Darüber hinaus haben die und s* gezeigt, dass sie unterschiedliche physiologische Implikationen im Zusammenhang mit dem Stärkebiosyntheseapparat28haben. Die Granulatvolumenverteilungen von Stärke aus verschiedenen Pflanzenarten können durchaus lognormal sein, da die Bildung von Stärkegranulat in pflanzenstärkeakkumulierenden Geweben in ein sich nicht eingeschränkt entwickelndes komplexes System31 oder ein intrazelluläres katalytisches Reaktionsnetzwerk32 fällt, das für eine lognormale Verteilung charakteristisch ist. Die bimodalen Granulatgrößenverteilungen von Stärke aus einigen Pflanzenarten, z. B. aus Weizen13,14, könnten als zwei lognormale Verteilungen angesehen werden. Daher kann die multiplikative Spezifikation von Granulat-Lognormal-Volumen-Äquivalent-Sphärengrößenverteilungen auch einen statistisch gültigen universellen Vergleich von Granulatgrößen ermöglichen, die aus Stärken verschiedener Pflanzenquellen und durch unterschiedliche Messungen bestimmt werden, da der in Form eines Volumenäquivalent-Kugeldurchmessers und s* demensionslos ist.
Eine angemessene Gesamtgranulatgrößenzahl für die Analyse einer Stärkeprobe (in Methanol), die den Granulatstichprobenumfang darstellt, ist für die erfolgreiche Bestimmung der Granulatgrößenverteilung der statistischen Signifikanz für die Stärkeprobe von entscheidender Bedeutung. Bei Süßkartoffelstärkeproben ändert sich die grafische geometrische S.D. ( s*) und der geometrische Mittelwert ( ) der angezeigten differenziellen Volumengrößenverteilungskurve nicht mehr signifikant, wenn die Gesamtanzahl in einem einzigen Durchlauf mehr als 65.000 bzw. 125.000 USD erreicht ist, was minimale Zahlen für das s* und die statistische Signifikanz angibt. Die Stichprobenredundanz bei der Dimensionierung von 250.000 Granulaten für eine Stärke-Methanol-Probe im Verfahren soll für das aggregierte und beschädigte Granulat im Granulatbecken in der Größe diskontieren. Selbst wenn man davon ausgeht, dass das aggregierte und beschädigte oder gebrochene Granulat 50 % der Gesamtanzahl von 250.000 Granulaten in einem abgeschlossenen Durchlauf oder zwei zusammengeführten Wiederholungsläufen ausmachte, wäre die grafische geometrische S.D. und der Mittelwert der ermittelten Verteilung nicht wesentlich beeinträchtigt worden, da sie durch das intakte Granulat der Hälfte der Gesamtanzahl verankert worden wären. Darüber hinaus ist die Verringerung des beschädigten oder gebrochenen Granulats umso geringer, je mehr sie auf die Verteilung wirken, je mehr Volumengrößen reduziert werden. Dies liegt daran, dass kleinere Granulate einen größeren Prozentsatz annehmen, aber kleinere Volumenprozentsätze des Gesamtenkörns. Wie der Vergleich zwischen den kumulativen Verteilungen der Zahl und des Volumens für die gleiche durchschnittliche Verteilung in Abbildung 2zeigt, entfielen stärkekörnige Granulate mit einem Äquivalentkugeldurchmesser kleiner oder gleich 9,967 m auf etwa 48,53 % der Gesamtmenge, aber nur 5,854 % des Gesamtvolumens. Somit hätte jedes beschädigte oder zerlegte Granulat von weniger als 10 m einen sehr geringen Einfluss auf die differenzierte Volumen-Prozentsatz-Größenverteilung. Bei Stärkeproben anderer Pflanzenquellen kann eine angemessene Gesamtanzahl für ihre Größenanalysen diejenige sein, die die minimale Anzahl verdoppelt, über die sich der grafische geometrische Mittelwert ( ) der angezeigten Größenverteilung in einem Testlauf nicht mehr wesentlich ändert.
Technisch gesehen ist der wichtigste Schritt für einen Größenlauf, eine angemessene Menge der Stärke-Methanol-Suspension auf den Elektrolyt für einen optimalen Bereich von 5 bis 8% Nennkonzentration für die Stärke-Elektrolyt-Suspension zu fallen. Um das Ziel zu erreichen, müssen die Tropfengröße und die Konzentration der Stärke-Methanol-Suspension möglicherweise durch Versuchsläufe angepasst werden. Konzentrationen der Stärke-Elektrolyt-Suspensionen, die höher sind als der optimale Bereich, erhöhen das Risiko einer reduzierten Größenpräzision und häufige Blendenverstopfungen, die zu Abtreibungen führen, was es sehr schwierig machen könnte, einen Lauf abzuschließen. Aber eine zu geringe Konzentration (z.B. <2%) der Stärke-Elektrolyt-Suspension kann einen Lauf zu sehr verlängern und die Frequenzen von Granulaten in verschiedenen Größenbehältern verzerren, da kein zufälliges Granulat entnommen wird, was zu einer inakzeptablen Fehlerrate führen kann (der durchschnittliche CV > 5 %) für eine Replikationsanalyse. Die Gesamtanzahl für einen Größenlauf hat auch einen großen Einfluss auf die optimale Konzentration einer Stärke-Elektrolyt-Suspension, also auf die Menge und Konzentration des zugesetzten Stärke-Methanols. Je größer die Gesamtzahl für einen Lauf, desto länger die Zeit für den Abschluss des Laufs und damit die größeren Risiken für Blendenblockaden, die zu Abtreibungen führen. Das Problem der Blendenverstopfung durch Aggregate verschlimmert sich, wenn Blendenrohre mit kleineren Durchmessern für Stärkegranulate kleinerer Größen verwendet werden, was die Analyse kleiner Stärkegranulate (< 2 m) sehr schwierig macht. Dies ist in der Tat der größte Nachteil oder die Hauptbeschränkung des Verfahrens. Das Problem der Blendenverstopfung könnte mit einigen technischen Mitteln bis zu einem gewissen Grad gemildert werden. Man kann mehr Beschallung verwenden, um Aggregate (unvermeidlich auch mehr beschädigte Granulate) in einer Stärke-Methanol-Suspension aufzubrechen, und/oder eine verdünnte Stärke-Elektrolyt-Suspension bei 2-5% Nennkonzentrationen. Alternativ kann man technische Wiederholungsläufe verwenden, um die minimale Gesamtanzahl für stabile s* und die Größenverteilungen für einen Stärketyp (z.B. etwa 125.0000 Zählungen für Süßkartoffelstärke) aus derselben Stärke-Elektrolyt-Suspension zu dimensionieren und die Ergebnisse der Wiederholungsläufe zusammenzuführen. Jede der vier Replikationsverteilungen (S1a, S1b, S2a und S2b) in Abbildung 1 stammte aus zwei zusammengeführten technischen Wiederholungsläufen mit einer Größe von jeweils 125.000 Granulaten aus derselben Stärke-Elektrolyt-Suspension. Beide Methoden müssen gut getestet werden, da sie die Replikationsfehlerrate auf ein inakzeptables Niveau erhöhen können (d. h. den durchschnittlichen Cv > 5 %).
Technische und biologische Replikationsgrößenanalysen von Stärkeproben aus pflanzenquellen unter ähnlichen physiologischen Bedingungen verbessern die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der ermittelten durchschnittlichen Granulatgrößenverteilung. Praktisch können drei oder vier biologische Wiederholungen von Stärkeproben unabhängig voneinander aus demselben Gewebe unter einer bestimmten Bedingung extrahiert werden. Zuvor hatten wir jedoch festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied bei den Fehlerraten (CV und Standardfehler für den Durchschnitt) und und s* zwischen der durchschnittlichen Granulatgrößenverteilung, die aus Verteilungen von vier biologischen Replikationen (d. h. einer Größe x eine Suspension x4 Extrakte) und der von zwei technischen Probenahmen jeweils aus zwei biologischen Replikaten (d. h. einer Größe x 2 Stärke-Methanol-Suspensionen x 2 Extrakte) abgeleitet wurde, gab. So konnten biologische Replizienproben auf zwei reduziert werden, zumindest für die Süßkartoffelstärke. Andere Schritte und technische Parameter, die geändert oder angepasst werden konnten, wurden unter jedem der Schritte oder dem jeweiligen Parameter im Verfahren ausdrücklich notiert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise vom Cooperative Agriculture Research Center und dem Integrated Food Security Research Center des College of Agriculture and Human Sciences, Prairie View A&M University, unterstützt. Wir danken Hua Tian für seine technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
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