Summary
Verschillende modellen van middelste cerebrale arterie occlusie (MCAo) worden gebruikt in experimenteel beroerteonderzoek. Hier wordt een experimenteel beroertemodel van voorbijgaande MCAo via de externe halsslagader (ECA) beschreven, dat tot doel heeft een menselijke beroerte na te bootsen, waarbij de cerebrovasculaire trombus wordt verwijderd als gevolg van spontane stolsellysis of therapie.
Abstract
Beroerte is de derde meest voorkomende oorzaak van sterfte en de belangrijkste oorzaak van verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen. Tot op heden zijn therapeutische opties beperkt tot een klein deel van de patiënten met een beroerte binnen de eerste uren na een beroerte. Nieuwe therapeutische strategieën worden uitgebreid onderzocht, vooral om het therapeutische tijdvenster te verlengen. Deze huidige onderzoeken omvatten de studie van belangrijke pathofysiologische routes na een beroerte, zoals ontsteking na een beroerte, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. In het afgelopen decennium is er toenemende bezorgdheid over de slechte reproduceerbaarheid van experimentele resultaten en wetenschappelijke bevindingen bij onafhankelijke onderzoeksgroepen. Om de zogenaamde "replicatiecrisis" te overwinnen, zijn gedetailleerde gestandaardiseerde modellen voor alle procedures dringend nodig. Als een inspanning binnen het "ImmunoStroke" onderzoeksconsortium (https://immunostroke.de/), wordt een gestandaardiseerd muismodel van transiënte midden cerebrale arterie occlusie (MCAo) voorgesteld. Dit model maakt het volledige herstel van de bloedstroom mogelijk na verwijdering van het filament, waarbij de therapeutische of spontane stolsellysis wordt gesimuleerd die optreedt bij een groot deel van de menselijke beroertes. De chirurgische procedure van dit "filament" beroertemodel en hulpmiddelen voor de functionele analyse ervan worden gedemonstreerd in de bijbehorende video.
Introduction
Beroerte is wereldwijd een van de meest voorkomende oorzaken van overlijden en invaliditeit. Hoewel er voornamelijk twee verschillende vormen van beroerte zijn, ischemisch en hemorragisch, is 80-85% van alle gevallen van beroerte ischemisch1. Momenteel zijn er slechts twee behandelingen beschikbaar voor patiënten met ischemische beroerte: farmacologische behandeling met recombinant weefselplasminogeenactivator (rtPA) of mechanische trombectomie. Vanwege het smalle therapeutische tijdvenster en de meervoudige exclusiecriteria kan echter slechts een select aantal patiënten profiteren van deze specifieke behandelingsopties. In de afgelopen twee decennia heeft preklinisch en translationeel beroerteonderzoek zich gericht op de studie van neuroprotectieve benaderingen. Alle verbindingen die klinische onderzoeken hebben bereikt, hebben tot nu toe echter geen verbeteringen voor de patiënt laten zien2.
Omdat in vitro modellen niet alle herseninteracties en pathofysiologische mechanismen van beroerte nauwkeurig kunnen reproduceren, zijn diermodellen cruciaal voor preklinisch beroerteonderzoek. Het nabootsen van alle aspecten van menselijke ischemische beroerte in een enkel diermodel is echter niet haalbaar, omdat ischemische beroerte een zeer complexe en heterogene ziekte is. Om deze reden zijn er in de loop van de tijd verschillende ischemische beroertemodellen ontwikkeld bij verschillende soorten. Fototrombose van cerebrale arteriolen of permanente distale occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) zijn veelgebruikte modellen die kleine en lokaal gedefinieerde laesies induceren in de neocortex3,4. Daarnaast is het meest gebruikte slagmodel waarschijnlijk het zogenaamde "filamentmodel", waarbij een voorbijgaande occlusie van MCA wordt bereikt. Dit model bestaat uit een voorbijgaande introductie van een hechtdraadfilament aan de oorsprong van de MCA, wat leidt tot een abrupte vermindering van de cerebrale bloedstroom en het daaropvolgende grote infarct van subcorticale en corticale hersengebieden5. Hoewel de meeste slagmodellen MCA-occlusies 6nabootsen, maakt het "filamentmodel" een nauwkeurige afbakening van de ischemische tijd mogelijk. Reperfusie door filamentverwijdering bootst het menselijke klinische scenario na van cerebrale bloedstroomherstel na spontane of therapeutische (rtPA of mechanische trombectomie) stolsellysis. Tot op heden zijn verschillende modificaties van dit "filamentmodel" beschreven. In de meest voorkomende benadering, voor het eerst beschreven door Longa et al. in 19895, wordt een met silicium gecoat filament via de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) geïntroduceerd bij de oorsprong van de MCA7. Hoewel het een veel gebruikte aanpak is, laat dit model geen volledig herstel van de bloedstroom toe tijdens reperfusie, omdat de CCA permanent wordt geligeerd na verwijdering van het filament.
In het afgelopen decennium zijn steeds meer onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het modelleren van beroerte bij muizen met behulp van dit 'filamentmodel'. De aanzienlijke variabiliteit van dit model en het gebrek aan standaardisatie van de procedures zijn echter enkele van de redenen voor de hoge variabiliteit en slechte reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten en wetenschappelijke bevindingen die tot nu toe zijn gerapporteerd2,8. Een mogelijke oorzaak van de huidige "replicatiecrisis", verwijzend naar de lage reproduceerbaarheid onder onderzoekslaboratoria, zijn de niet-vergelijkbare beroerte-infarctvolumes tussen onderzoeksgroepen die dezelfde experimentele methodologie gebruiken9. Na het uitvoeren van de eerste preklinische gerandomiseerde gecontroleerde multicenter studie10, konden we bevestigen dat het gebrek aan voldoende standaardisatie van dit experimentele beroertemodel en de daaropvolgende uitkomstparameters de belangrijkste redenen waren voor het falen van de reproduceerbaarheid in preklinische studies tussen onafhankelijke laboratoria11 . Deze drastische verschillen in de resulterende infarctgroottes vormen, ondanks het gebruik van hetzelfde beroertemodel, terecht niet alleen een bedreiging voor bevestigend onderzoek, maar ook voor wetenschappelijke samenwerkingen vanwege het gebrek aan robuuste en reproduceerbare modellen.
In het licht van deze uitdagingen wilden we de procedure voor een gestandaardiseerd transiënt MCAo-model ontwikkelen en in detail beschrijven, zoals gebruikt voor de gezamenlijke onderzoeksinspanningen binnen het onderzoeksconsortium "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Dit consortium heeft tot doel de hersen-immuuninteracties te begrijpen die ten grondslag liggen aan de mechanistische principes van beroerteherstel. Daarnaast worden histologische en gerelateerde functionele methoden voor de analyse van beroerte-uitkomsten gepresenteerd. Alle methoden zijn gebaseerd op vastgestelde standaard operationele procedures die worden gebruikt in alle onderzoekslaboratoria van het ImmunoStroke-consortium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten die in deze video worden gerapporteerd, werden uitgevoerd volgens de nationale richtlijnen voor het gebruik van proefdieren en de protocollen werden goedgekeurd door de Duitse regeringscommissies (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). Tien weken oude mannelijke C57Bl/6J-muizen werden gebruikt en gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C), met een licht-donkercyclusperiode van 12 uur en toegang tot gepelletiseerd voedsel en water ad libitum.
1. Voorbereiding van het materiaal en de instrumenten
- Sluit de warmtedeken aan om de temperatuur van het operatiegebied en de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de anesthesie op 37 °C te houden.
- Autoclaaf schaar en tang, bereid 70% ethanol oplossing en houd beschikbare dexpanthenol oogzalf, verschillende stukken katoen, en 5-0 gecoate gevlochten polyester hechtdraad klaar voor gebruik. Bereid een spuit van 1 ml met 0,9% zoutoplossing (zonder naald) om de incisieplaats van het dier gehydrateerd te houden. Bereid het anesthesiegas voor (100% O2 + isofluraan).
- Bereid een houder voor de laser Doppler sonde door de punt van een 10 μL pipetpunt (3-5 mm lengte) te snijden.
OPMERKING: Alle instrumenten worden gesteriliseerd met behulp van een hete kralensterilisator. Oppervlakken worden ook voor en na de operatie gedesinfecteerd met een microbiële desinfectiespray. Voorafgaand aan de operatie worden de gebieden rond het hoofd en de borst van muizen gedesinfecteerd met een wonddesinfectiespray.
2. Voorbereiding van de laser Doppler
- Injecteer analgesie bij de muis 30 minuten voor de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine, intraperitoneaal).
- Verdoof de muis door deze in de inductiekamer te plaatsen met een isofluraandebiet van 4% tot het stoppen van spontane lichaamsbeweging en vibrissae.
- Plaats de muis in een buikligging in het operatiegebied met zijn neus in het anesthesiemasker. Houd de isofluraanconcentratie nog een minuut op 4%, verlaag deze dan en houd deze op 2%.
- Stel het bijbehorende feedbackgestuurde verwarmingskussen in om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden en plaats voorzichtig de rectale sonde om de temperatuur tijdens de chirurgische ingrepen te controleren.
- Breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen.
- Desinfecteer de huid en het haar rond het linkeroog en oor met 70% ethanol.
- Snijd de hoofdhuid tussen het linkeroor en het oog (1 cm lang) om het schedelbot bloot te leggen.
- Snijd en trek de tijdelijke spier terug om de MCA onder de schedel te visualiseren.
- Bevestig met lijm het buitenste deel van de punt met de laser Doppler sonde /vezel bovenop de linker MCA met lijm. Lijm vervolgens de huid om de wond rond de tiphouder te sluiten. Breng 2-3 druppels verharderlijm aan om het proces te versnellen. Zorg ervoor dat de laser Doppler vezel niet gelijmd is en op elk moment gemakkelijk uit de tiphouder kan worden verwijderd.
3. Transiënt MCAo-model (occlusie)
- Zet de muis in rugligging. Plaats de snuit in de anesthesiekegel en bevestig de poten met tape.
- Desinfecteer de huid en het haar rond de borst en maak een 2 cm lange middellijnincisie in de nek.
- Gebruik een tang om de huid en de submandibulaire klieren uit elkaar te trekken. Gebruik retractors om de sternomastoïde spier vast te houden, het chirurgische veld bloot te leggen en de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) te vinden. Ontleed de CCA vrij van bindweefsel en omliggende zenuwen (zonder de nervus vagus te beschadigen) en voer een voorbijgaande ligatie uit vóór de bifurcatie.
- Ontleed de uitwendige halsslagader (ECA) en knoop een permanente knoop op het meest distale zichtbare deel. Plaats een andere hechting onder de ECA, dicht bij de bifurcatie, en bereid een losse knoop voor om later te gebruiken.
- Ontleed de interne halsslagader (ICA) en plaats er een microvasculaire clip op, 5 mm over de bifurcatie. Zorg ervoor dat u de nervus vagus niet beschadigt.
- Knip een klein gaatje in de ECA tussen de strakke en de losse ligaties; pas op dat u niet de hele ERK inkort.
- Introduceer het filament en breng het naar het CCA. Span de losse ligatie in de ECA rond het lumen aan om het filament kort in die positie vast te zetten en bloedingen te voorkomen bij het verwijderen van de microvasculaire clip.
- Verwijder de microvasculaire clip en breng het filament door de ICA totdat de oorsprong van de MCA is bereikt door een scherpe reductie (>80%) in de cerebrale bloedstroom te detecteren zoals gemeten door de laser Doppler. Bevestig het filament in deze positie door de knoop rond de ECA verder aan te spannen.
OPMERKING: Wanneer het filament in de juiste richting gaat, vordert het soepel en mag er geen weerstand worden waargenomen. - Record laser Doppler waarden voor en na filament insertie.
- Verwijder het retractor en verplaats de sternomastoïde spier en de submandibulaire klieren voordat u de wond hecht. Verwijder de laser Doppler-sonde en plaats het dier gedurende 1 uur in een herstelkamer bij 37 °C (totdat de gloeidraad wordt verwijderd).
4. Transiënt MCAo-model (Reperfusie)
- Verdoof de muis door deze in de inductiekamer te plaatsen met een isofluraandebiet van 4% tot het stoppen van spontane lichaamsbeweging en vibrissae.
- Breng dexpanthenol oogzalf aan op beide ogen.
- Plaats de muis in een buikligging in het operatiegebied met zijn snuit in het anesthesiemasker. Houd de isofluraanconcentratie nog een minuut op 4%, verlaag deze dan en houd deze op 2%. Bevestig de poten van het dier met tape.
- Plaats de laser Doppler sonde in de sondehouder.
- Verwijder de wondnaad, gebruik een tang om de huid en de submandibulaire klieren uit elkaar te trekken. Gebruik retractors om voorzichtig aan de sternomastoïde spier te trekken en het chirurgische veld bloot te leggen.
- Maak de ECA-hechting los die de gloeidraad aanspant en trek voorzichtig aan de gloeidraad. Vermijd beschadiging van de siliconenrubberen coating van het filament tijdens het verwijderen.
- Bind de ECA-hechting stevig vast.
- Bevestig de toename van de cerebrale bloedstroom in het laser Doppler-apparaat (>80% van de initiële waarde vóór reperfusie).
- Neem laser Doppler waarden op voor en na het verwijderen van filamenten.
- Open de voorbijgaande ligatie vóór de bifurcatie van het CCA.
- Verwijder het terugtrekkingsmiddel en verplaats de sternomastoïde spier en de submandibulaire klieren voordat u de wond hecht. Plaats het dier gedurende 1 uur in een herstelkamer bij 37 °C om te herstellen van de anesthesie.
- Breng de muizen na herstel terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.
- Zorg voor de dieren door natte voedselkorrels en hydrogel toe te voegen in kleine petrischaaltjes op de kooivloer tot dag 3 na de operatie.
- Injecteer analgesie elke 12 uur gedurende 3 d na de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).
5. Schijnoperatie
- Voer alle procedures uit zoals hierboven beschreven, inclusief de ligatie van de slagaders en de introductie van het filament (stappen 1-3.7).
- Verwijder het filament onmiddellijk na het inbrengen. Plaats het dier vervolgens gedurende 1 uur in de herstelkamer.
- Plaats het dier opnieuw in het operatiegebied en verwijder de voorbijgaande ligatie van het CCA om een volledig herstel van de hersenbloedstroom te garanderen.
- Hecht de wond en plaats het dier gedurende 1 uur in een herstelkamer bij 37 °C om te herstellen van de anesthesie. Breng de muizen na herstel terug naar hun kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer.
- Verzorg de dieren door natvoerkorrels en hydrogel toe te voegen in kleine petrischaaltjes op de kooivloer tot dag 3 na de operatie.
- Injecteer analgesie elke 12 uur gedurende 3 d na de operatie (4 mg/kg Carprofen en 0,1 mg/kg Buprenorfine).
6. Neuroscore
- Voer de Neuroscore altijd op hetzelfde moment van de dag uit en gebruik chirurgische kleding om een "neutrale geur" tussen individuele chirurgen te behouden.
- Laat de muizen 30 minuten rusten in de kamer met een "open" kooi voor de test.
- Observeer elk item in tabel 1 en tabel 2 gedurende 30 s.
7. Intracardiale perfusie
- Bereid een spuit van 20 ml met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-heparine (2 E/ml) en plaats deze 1 m boven de bank om door zwaartekracht aangedreven perfusie te vergemakkelijken. (OPTIONEEL: Voer intracardiale perfusie uit met 4% paraformaldehyde (PFA) met behulp van een spuit van 20 ml met 4% PFA in PBS, pH 7,4).
- Injecteer intrperitoneaal 100 μL ketamine en xylazine (respectievelijk 120 en 16 mg/kg lichaamsgewicht). Wacht 5 minuten en bevestig het stoppen van spontane lichaamsbeweging en vibrissae.
- Fixeer het dier in rugligging en desinfecteer het buikoppervlak met 70% ethanol.
- Maak een 3 cm lange incisie in de buik; snijd het middenrif, de ribben en het borstbeen om het hart volledig te visualiseren.
- Maak een kleine incisie in het rechter atrium en breng de perfusiecanule in de linker ventrikel.
- Perfuseer met 20 ml PBS-heparine.
- Onthoofd na perfusie het dier en verwijder de hersenen.
- Vries de hersenen in op droogijspoeder en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
8. Infarct volumetry
- Gebruik voor cryosectie een cryostaat om de hersenen om de 400 μm dikke secties in 20 μm dikke secties te snijden. Plaats de secties op dia's en bewaar de dia's bij −80 °C tot gebruik.
- Cresyl violet (CV) kleuring
- Bereid de kleuringsoplossing door 0,5 g CV-acetaat in 500 ml H 2 O te roeren en te verhitten(60°C) totdat de kristallen zijn opgelost. Nadat de oplossing is afgekoeld, bewaar je deze in een donkere fles. Verwarm opnieuw tot 60 °C en filtreer voor elk gebruik.
- Laat de glaasjes 30 min op kamertemperatuur drogen. Dompel ze 15 minuten onder in 95% ethanol, gedurende 1 min in 70% ethanol en vervolgens 1 min in 50% ethanol.
- Dompel de glijbanen gedurende 2 minuten onder in gedestilleerd water; ververs het gedestilleerde water en plaats de glijbanen gedurende 1 min in het water. Dompel de glaasjes daarna gedurende 10 minuten bij 60 °C onder in de voorverwarmde kleuroplossing. Was de glaasjes twee keer in gedestilleerd water gedurende 1 min.
- Dompel de dia's gedurende 2 minuten onder in 95% ethanol. Plaats ze in 100% ethanol gedurende 5 minuten; ververs de 100% ethanol en plaats de glaasjes opnieuw gedurende 2 min in de ethanol. Bedek daarna de dia's met een bevestigingsmedium.
- Analyse (Figuur 4C)
- Scan de dia's en analyseer het indirecte infarctvolume volgens de Swanson-methode12 om te corrigeren voor oedeem met behulp van de volgende vergelijking:
(Ischemisch gebied) = (ischemisch gebied)-((ipsilaterale hemisfeer)-(contralaterale hemisfeer))
- Scan de dia's en analyseer het indirecte infarctvolume volgens de Swanson-methode12 om te corrigeren voor oedeem met behulp van de volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven model is een wijziging van het veelgebruikte "filament" -slagmodel, dat bestaat uit het introduceren van een met silicium gecoat filament door de ECA om de oorsprong van de MCA tijdelijk te blokkeren (figuur 1). Na het verwijderen van het filament wordt alleen de bloedstroom in de ECA permanent gestaakt, waardoor volledige rekanalisatie van het CCA en ICA mogelijk is. Dit maakt een adequate reperfusie van de hersenen mogelijk(figuur 2),vergelijkbaar met de situatie die wordt waargenomen na succesvolle farmacologische trombolyse of mechanische trombectomie bij menselijke patiënten. Bovendien beschrijft dit werk ook een methode voor het meten van de cerebrale bloedstroom tijdens zowel occlusie- als reperfusieprocedures door een canule te bevestigen die is verbonden met de laser Doppler-sonde bij de schedel over het MCA-territorium.
Het totale sterftecijfer van de chirurgische ingreep is <5% wanneer uitgevoerd door een getrainde chirurg. Op vroege tijdstippen na MCAo vertonen dieren over het algemeen ernstige houdings- en bewegingstekorten, algemene zwakte en verlies van lichaamsgewicht13. Deze ernstige tekorten zijn van voorbijgaande aard en de dieren vertonen na ongeveer 1 week een verbeterde activiteit; de tekorten zijn dus specifieker voor focale neurologische symptomen.
Gedragsstoornissen na MCA-occlusie werden beoordeeld door de samengestelde Neuroscore14; algemene en focale tekorten werden 24 uur per dag en 3 d na de operatie gemeten. De algemene Neuroscore integreert 5 items(tabel 1),inclusief de evaluatie van de vacht, oren, ogen, houding en spontane activiteit, met een maximale score van 18. De focale Neuroscore bestaat uit 7 items(tabel 2),waaronder de evaluatie van lichaamssymmetrie, gang, klimmen, cirkelgedrag, voorpotensymmetrie, verplicht fietsen en snorharenrespons, met een maximale score van 28. De samengestelde schaal varieert van 0 (geen tekorten) tot 46 (ernstige waardeverminderingen). Beroertedieren vertoonden een significante verandering in de samengestelde en focale Neuroscore, maar niet in de algemene Neuroscore, in vergelijking met schijndieren(figuur 3).
Infarctvolumering werd ook uitgevoerd met behulp van Cresyl Violet-kleuring van coronale seriële hersensecties 24 uur na beroerte-inductie. Het gemiddelde infarctvolume was 61,69 mm3, wat neerkomt op 48% van de aangetaste hersenhelft(figuur 4). Wanneer uitgevoerd door een getrainde chirurg, is de algehele variabiliteit van dit beroertemodel laag, met een variatiecoëfficiënt van <6%. Het laesiegebied omvat de somatosensorische en motorische cortex, evenals subcorticale structuren zoals het striatum(figuur 4).
Figuur 1: Schema voor de toegang en intraluminale MCA-occlusie. De gloeidraad (stippellijn) wordt ingebracht tussen de proximale en distale hechtknopen in de ECA en langs de ICA gevorderd totdat deze de oorsprong van de MCA bereikt (zie inzet). Eenmaal op zijn plaats wordt de ECA geligeerd met een hechtdraad om het filament te fixeren. Afkortingen: ACA = anterieure hersenslagader; BA = basilaire slagader; CCA = gemeenschappelijke halsslagader; ECA = uitwendige halsslagader; ICA = interne halsslagader; MCA = middelste hersenslagader; PCA = posterieure communicerende slagader; PTG = pterygopalatine slagader. Dit cijfer is aangepast van Jackman et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bloedstroom tijdens occlusie en reperfusie. De bloedstroom wordt geregistreerd voor en na het inbrengen van filamenten en voor en na het verwijderen van filamenten. Een vermindering van de bloedstroom werd waargenomen tijdens de occlusie en het herstel van de bloedstroom tijdens de reperfusie. Elke kleur vertegenwoordigt één dier. Afkortingen: MCA = middelste hersenslagader; CBF = cerebrale bloedstroom; A.U. = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Neuroscore voor functionele tekorten na tMCAo. (A) Totaal, (B) focale, en (C) algemene Neuroscore voor en 24 h en 3 d na tMCAo. Open bars: schijn; Zwarte balken: tMCAo. n=10 per groep. *p < 0,05. Afkortingen: tMCAo = transient middle cerebral artery occlusion; BL = vóór tMCAo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Volumetrische infarctanalyse en infarctuitkomst 24 uur na tMCAo. (A) Representatieve cresylpaars-gekleurde coronale hersensecties om de 400 μm om 24 uur na tMCAo. Stippellijnen bakenen het laesiegebied af. BAnalyse van het infarctvolume van 10 hersenen (elke stip vertegenwoordigt één individueel brein) 24 uur na tMCAo. De horizontale rode lijn vertegenwoordigt het gemiddelde (61,69 mm3),foutbalken geven de standaardafwijking aan (3,78 mm3). (C) Representatief beeld voor de berekening van het infarctvolume van een cresylpaarse coronale sectie. Blauw = contralaterale hemisfeer; Rood = Ipsilaterale hemisfeer; Bleek gestreept gebied = Ischemisch gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijdstip van scoren | partituur | ||
| Algemene Neuroscore | Haar | 0. Haar netjes en schoon | |
| 1. Gelokaliseerde piloerection en vuil haar in 2 lichaamsdelen (neus en ogen) | |||
| 2. Piloerection en vuil haar in >2 lichaamsdelen | |||
| Oren (muis op een open bankje) | 0. Normaal (oren worden zijdelings en achter uitgerekt, ze reageren door recht te zetten na geluid) | ||
| 1. Zijdelings uitgerekt maar niet achter (een of beide), reageren ze op geluid | |||
| 2. Hetzelfde als 1. GEEN reactie op lawaai. | |||
| Ogen (muis op OBT) | 0. Open, schoon en volg snel de omgeving | ||
| 1. Open en gekenmerkt door waterig slijm. Volg langzaam de omgeving | |||
| 2. Open en gekenmerkt door donker slijm | |||
| 3. Ellipsoïdaal gevormd en gekenmerkt door donker slijm | |||
| 4. Gesloten | |||
| Houding (plaats de muis op de handpalm en zwaai zachtjes) | 0. De muis staat rechtop met de rug evenwijdig aan de handpalm. Tijdens het schommelen staat het snel. | ||
| 1. De muis staat bultruggen. Tijdens de zwaai vlakt het het lichaam af om stabiliteit te krijgen. | |||
| 2. Het hoofd of een deel van de stam ligt op de handpalm. | |||
| 3. De muis ligt aan één kant en kan de rechtopstaande positie nauwelijks herstellen. | |||
| 4. De muis ligt in een buikligging en kan de rechtopstaande positie niet herstellen. | |||
| Spontaneos activiteit (muis op OBT) | 0.De muis is alert en verkent actief. | ||
| 1.De muis lijkt alert, maar is kalm en traag. | |||
| 2.De muis verkent met tussenpozen en traag. | |||
| 3.De muis is slaperig en gevoelloos, weinig bewegingen ter plaatse. | |||
| 4.No spontane bewegingen | |||
| Totaalscore voor algemene scores | |||
| (normaal=0 max=18) | |||
Tabel 1: Algemene Neuroscore. Dieren kregen tussen 0 en 4 punten, afhankelijk van de ernst, voor elk van de vijf gemeten algemene tekorten. De scores op de verschillende gebieden worden vervolgens toegevoegd om een totale algemene score te krijgen, variërend van 0 tot 18. Deze tabel is aangepast van Clark et al.14 . Afkorting: OBT = open benchtop.
| Tijdstip van scoren | partituur | ||
| Focale Neuroscore | Lichaamssymmetrie (muis op OBT, observeer de neus-staartlijn) | 0. Normaal (Lichaam: normale houding, romp verhoogd van de bank, met voor- en achterpoten leunend onder het lichaam. Staart: recht) | |
| 1. Lichte asymmetrie (Lichaam: leunt aan één kant met voor- en achterpoten die onder het lichaam leunen. Staart: licht gebogen) | |||
| 2. Matige asymmetrie (Lichaam: leunt aan één kant met voor- en achterpoten gestrekt. Staart: licht gebogen) | |||
| 3. Prominente asymmetrie (Lichaam: gebogen, aan één kant ligt op de OBT. Staart: gebogen) | |||
| 4. Extreme asymmetrie (Lichaam: sterk gebogen, aan één kant ligt constant op de OBT. Staart: sterk gebogen) | |||
| Gang (muis op OBT. Ongestoord waargenomen) | 0. Normaal (gang is flexibel, symmetrisch en snel) | ||
| 1. Stijf, inflexibel (bultrug lopen, langzamer dan normale muis) | |||
| 2. Hinken, met asymmetrische bewegingen | |||
| 3. Trillen, drijven, vallen | |||
| 4. Loopt niet spontaan (wanneer gestimuleerd door zachtjes duwen loopt de muis niet langer dan 3 stappen) | |||
| Klimmen (muis op een oppervlak van 45o. Plaats de muis in het midden van het grijpoppervlak) | 0. Normaal (muis klimt snel) | ||
| 1. Beklimt met spanning, zwakte van de ledematen aanwezig | |||
| 2. Houdt zich vast aan de helling, glijdt niet uit of klimt niet | |||
| 3. Glijdt van helling af, mislukte poging om falen te voorkomen | |||
| 4. Dia's onmiddellijk, geen moeite om falen te voorkomen | |||
| Cirkelgedrag (muis op OBT, vrije observatie) | 0. Afwezig cirkelgedrag | ||
| 1. Overwegend eenzijdige bochten | |||
| 2. Cirkels naar één kant, hoewel niet constant | |||
| 3. Cirkels constant naar één kant | |||
| 4. Draaien, zwaaien of geen beweging | |||
| Voorpootsymmetrie (muis opgehangen aan staart) | 0. Normaal | ||
| 1. Lichte asymmetrie: milde flexie van contralaterale voorpoot | |||
| 2. Gemarkeerde asymmetrie: gemarkeerde flexie van contralaterale ledematen, het lichaam buigt lichtjes aan de ipsilaterale kant | |||
| 3. Prominente asymmetrie: contralaterale voorpoot hecht zich aan de romp | |||
| 4. Lichte asymmetrie, geen beweging van lichaam/ledematen | |||
| Verplichte cirkeling (voorpoten op bank, achterpoten opgehangen aan de staart: het onthult de aanwezigheid van de contralaterale ledemaatverlamming) | 0. Afwezig. Normale verlenging van beide voorpoten | ||
| 1. Neiging om naar één kant te draaien (de muis strekt beide voorpoten uit, maar begint bij voorkeur naar één kant te draaien) | |||
| 2. Cirkels naar één kant (de muis draait naar één kant met een langzamere beweging in vergelijking met gezonde muizen) | |||
| 3. Draait traag naar één kant (de muis draait naar één kant en kan geen volledige cirkel uitvoeren) | |||
| 4. Gaat niet vooruit (het voorste deel van de stam ligt op de bank, langzame en korte bewegingen) | |||
| Whisker response (muis op de OBT) | 0. Normaal | ||
| 1. Lichte asymmetrie (de muis trekt zich langzaam terug wanneer deze aan de contralaterale kant wordt gestimuleerd) | |||
| 2. Prominente asymmetrie (geen reactie wanneer gestimuleerd naar de contralaterale zijde) | |||
| 3. Afwezige respons contralateraal, langzame respons wanneer ipsilateraal gestimuleerd | |||
| 4. Afwezigheid bilateraal antwoord | |||
| Totaalscore voor focale tekorten | |||
| (normaal=0 max=28) | |||
Tabel 2: Focale Neuroscore. Dieren kregen tussen 0 en 4 punten, afhankelijk van de ernst voor elk van de zeven gemeten algemene tekorten. De scores op de verschillende gebieden worden vervolgens opgeteld om een totale focusscore te geven, variërend van 0 tot 28. Deze tabel is aangepast van Clark et al.14 . Afkorting: OBT = open benchtop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een experimenteel beroertemodel op basis van de consensusovereenkomst van een Duits multicenter onderzoeksconsortium ("ImmunoStroke") om een gestandaardiseerd transiënt MCAo-model vast te stellen. Het transiënte MCAo-model dat tot stand is gebracht door een met silicium gecoat filament via de ECA te introduceren bij de oorsprong van de MCA, is een van de meest gebruikte slagmodellen om arteriële reperfusie te bereiken na een afgebakende occlusieperiode. Daarom kan deze procedure worden beschouwd als een translationeel relevant beroertemodel.
Het "filamentmodel" dat in de video wordt gepresenteerd, heeft enkele voordelen in vergelijking met andere eerder beschreven beroertemodellen, zoals het niet vereisen van craniotomie en het bereiken van volledige reperfusie van voorbijgaand het afgesloten vat. De complexiteit van de chirurgische ingreep kan echter als een beperking worden beschouwd, omdat het invasieve chirurgie en een nauwkeurige manipulatie van de verschillende slagaders in de nabijheid van de luchtpijp en de nervus vagus omvat. De lange blootstelling van het dier aan anesthetica kan ook een kritische factor zijn om te overwegen, omdat de impact van anesthetica op neuroprotectie en beroerte-uitkomst al goed is gedocumenteerd16. Ten slotte kan deze, ondanks de complexiteit van deze chirurgische ingreep, in ca. 20 minuten worden voltooid wanneer deze wordt uitgevoerd door een getrainde chirurg.
In tegenstelling tot de eerder beschreven "filament" beroerteprotocollen17, maakt de hier beschreven methode ook de meting van de cerebrale bloedstroom tijdens de occlusie- en reperfusiefasen mogelijk. Bloedstroommonitoring tijdens reperfusie kan een belangrijke parameter zijn om reperfusieletsel bij beroerte te voorkomen18, waarvan bekend is dat het schadelijke gevolgen heeft bij patiënten die farmacologische of endovasculaire interventies ondergaan voor rekanalisatie van de trombosed bloedvaten. Ondanks de discrepanties tussen de gevolgen van cerebrale bloedstroomherstel na MCAo19, kan de variabiliteit van bloedstroomherstel na een beroerte de pathofysiologische en biochemische gebeurtenissen in de hersenen beïnvloeden, evenals het infarctvolume en de neurologische tekorten van beroertemuizen20. Daarom zijn in dit model volledig herstel van de bloedstroom en de registratie ervan vereisten om reproduceerbare infarcten bij muizen te garanderen, vooral in translationele beroertestudies.
De totale mortaliteit tijdens de chirurgische ingreep is minder dan 5% en wordt voornamelijk veroorzaakt door anesthesiecomplicaties, bloedingen of opoffering als gevolg van vooraf gedefinieerde exclusiecriteria. Dit beroertemodel presenteert echter een gematigd sterftecijfer binnen de eerste 24-48 uur na beroerte-inductie, wat het aantal dieren dat per experiment nodig is om een adequaat cohort van beroertemuizen te bereiken, zou kunnen verhogen. In termen van infarctvolume induceert dit model grote infarcten, met laesies die tot 50% van het halfrond omvatten. Het produceert ook hersenoedeem, dat verschillende hersengebieden beïnvloedt, waaronder corticale en subcorticale gebieden.
Om een lage variabiliteit en hoge reproduceerbaarheid van het slagmodel te bereiken, moet rekening worden gehouden met verschillende uitsluitingscriteria, waaronder: 1) bedrijfstijd > 20 minuten; 2) >20% van de bloedstroomvermindering wanneer CCA is geligeerd (stap 3.3); 3) vermindering van de bloedstroom tijdens occlusie < 80% van de initiële pre-occlusiewaarde; en 4) de bloedstroom neemt 10 minuten na reperfusiesnelheid toe <80% in vergelijking met de pre-reperfusiewaarde. Voor een ervaren en getrainde chirurg zijn geen dieren uitgesloten vanwege het operatietijdcriterium. 10-15% van de dieren vertoont echter een vermindering van de bloedstroom met 20% bij CCA-ligatie en 5-10% vertoont geen adequate vermindering of toename van de bloedstroom tijdens respectievelijk occlusie of reperfusie. Daarom is het slagingspercentage na het uitsluiten van dieren op basis van deze criteria ongeveer 75-85%.
Bovendien worden dieren dagelijks na MCAo (lichaamsgewicht, temperatuur en fundamenteel fysiologisch gedrag) onderzocht om te controleren op ziekte, pijn of ongemakgedrag. Naast deze algemene zorg zijn er verschillende tests ontwikkeld voor specifieke gedragsanalyse na focale hersenischemie, ondanks alle bekende tests om sensomotorische disfunctie te evalueren, zoals de Rotarod-test21,Sticky label-test22,Corner-test23of de Cilindertest24. Hier werden dieren geselecteerd voor de oprichting van dit beroertemodel geëvalueerd op focale en algemene tekorten, omdat het filamentmodel ook cytokine-ziektegedrag induceert, onafhankelijk van focale (sensorische of motorische) tekorten25. Alles bij elkaar genomen is het hier beschreven "filament" beroertemodel een waardevol model voor fundamenteel en translationeel beroerteonderzoek. Dit model wordt voorgesteld als een gestandaardiseerd slagmodel dat kan worden gebruikt om beroertemodellen in laboratoria te harmoniseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken al onze samenwerkingspartners van de ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) voor suggesties en discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de Duitse excellentiestrategie in het kader van de Münchense cluster voor systeemneurologie (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) en onder de subsidies LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 en LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
