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Biochemistry

कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया की प्रोटीन आयात क्षमता का मापन

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63055
Automatic Translation
1, 1, 1
1Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Science, York University

Summary

माइटोकॉन्ड्रिया प्रमुख चयापचय ऑर्गेनेल हैं जो कंकाल की मांसपेशियों में फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी के उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं। साइटोसोल से प्रोटीन का आयात ऑर्गेनेल बायोजेनेसिस के लिए एक महत्वपूर्ण मार्ग है, जो रेटिकुलम के विस्तार और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के रखरखाव के लिए आवश्यक है। इसलिए, प्रोटीन आयात सेलुलर स्वास्थ्य के बैरोमीटर के रूप में कार्य करता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया प्रमुख चयापचय और नियामक ऑर्गेनेल हैं जो ऊर्जा की आपूर्ति के साथ-साथ सेल के समग्र स्वास्थ्य को निर्धारित करते हैं। कंकाल की मांसपेशियों में, माइटोकॉन्ड्रिया जटिल आकारिकी की एक श्रृंखला में मौजूद है, जो छोटे अंडाकार ऑर्गेनेल से लेकर एक व्यापक, रेटिकुलम जैसे नेटवर्क तक होता है। यह समझना कि माइटोकॉन्ड्रियल रेटिकुलम विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में कैसे फैलता है और विकसित होता है जैसे कि ऊर्जा की मांग में परिवर्तन लंबे समय से अनुसंधान का विषय रहा है। इस विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू, या बायोजेनेसिस, अग्रदूत प्रोटीन का आयात है, जो मूल रूप से परमाणु जीनोम द्वारा एन्कोडेड है, साइटोसोल में संश्लेषित किया गया है, और विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल उप-डिब्बों में स्थानांतरित किया गया है। माइटोकॉन्ड्रिया ने इस आयात प्रक्रिया के लिए एक परिष्कृत तंत्र विकसित किया है, जिसमें कई चयनात्मक आंतरिक और बाहरी झिल्ली चैनल शामिल हैं, जिन्हें प्रोटीन आयात मशीनरी (पीआईएम) के रूप में जाना जाता है। माइटोकॉन्ड्रियन में आयात व्यवहार्य झिल्ली क्षमता और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से ऑर्गेनेल-व्युत्पन्न एटीपी की उपलब्धता पर निर्भर करता है। इसलिए इसका माप ऑर्गेनेल स्वास्थ्य के उपाय के रूप में काम कर सकता है। पीआईएम कंकाल की मांसपेशियों में अनुकूली प्लास्टिसिटी के एक उच्च स्तर को भी प्रदर्शित करता है जो सेल की ऊर्जा स्थिति के लिए कसकर युग्मित होता है। उदाहरण के लिए, व्यायाम प्रशिक्षण को आयात क्षमता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि मांसपेशियों का उपयोग इसे कम करता है, माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के मार्करों में परिवर्तन के साथ संयोग। यद्यपि प्रोटीन आयात माइटोकॉन्ड्रिया के बायोजेनेसिस और विस्तार में एक महत्वपूर्ण कदम है, इस प्रक्रिया का कंकाल की मांसपेशियों में व्यापक रूप से अध्ययन नहीं किया जाता है। इस प्रकार, यह पेपर यह रेखांकित करता है कि प्रोटीन आयात क्षमता को मापने के लिए कंकाल की मांसपेशियों से अलग-थलग और पूरी तरह से कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कैसे किया जाए ताकि इसमें शामिल तरीकों की अधिक समझ को बढ़ावा दिया जा सके और व्यायाम, स्वास्थ्य और बीमारी में ऑर्गेनेल टर्नओवर के लिए मार्ग के महत्व की सराहना की जा सके।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया ऑर्गेनेल हैं जो विभिन्न सेल प्रकारों में जटिल आकारिकी में मौजूद हैं और सेलुलर स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण कार्यों की बढ़ती सरणी के अधिकारी के रूप में पहचाने जाते हैं। इस प्रकार, उन्हें अब केवल ऊर्जा-उत्पादक ऑर्गेनेल के लिए नीचे नहीं रखा जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रिया प्रमुख चयापचय नियामक, सेल भाग्य के निर्धारक, और सिग्नलिंग हब हैं, जिनके कार्य समग्र सेलुलर स्वास्थ्य के उपयोगी संकेतकों के रूप में काम कर सकते हैं। कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन भौगोलिक रूप से अलग-अलग सबसारकोलेमल (एसएस) और इंटरमायोफिब्रिलर (आईएमएफ) माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति का खुलासा करते हैं, जो कनेक्टिविटी 1,2,3,4 की एक डिग्री प्रदर्शित करते हैं जो अब कंकाल की मांसपेशियों की गतिविधि के स्तर में परिवर्तन के साथ-साथ उम्र और बीमारी के साथ अत्यधिक गतिशील और अनुकूलनीय होने के लिए मान्यता प्राप्त है। मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और कार्य का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है5,6, और ऑर्गेनेल अलगाव के पारंपरिक तरीकों को सेलुलर परिवेश 7,8 के प्रभाव से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की श्वसन और एंजाइमेटिक क्षमताओं (वीमैक्स) को बेहतर ढंग से समझने के लिए लागू किया गया है। विशेष रूप से, इन पारंपरिक तरीकों ने माइटोकॉन्ड्रिया के बीच सूक्ष्म जैव रासायनिक भेदों को प्रकट किया है, जो कि सबसारकोलेमल और इंटरमायोफिब्रिलर क्षेत्रों से अलग हैं, इन उपकोशिकीय क्षेत्रों में चयापचय के लिए संभावित कार्यात्मक प्रभावों को झुठलाते हैं8,9,10,11।

माइटोकॉन्ड्रिया का बायोजेनेसिस परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दोनों से जीन उत्पादों के योगदान की आवश्यकता में अद्वितीय है। हालांकि, इनमें से अधिकांश नाभिक से व्युत्पन्न होते हैं क्योंकि एमटीडीएनए प्रतिलेखन केवल 13 प्रोटीन के संश्लेषण की ओर जाता है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया में आमतौर पर विविध चयापचय मार्गों में शामिल >1000 प्रोटीन शामिल होते हैं, इसलिए ऑर्गेनेल के बायोजेनेसिस को उचित स्टोइकोइमेट्री और फ़ंक्शन 12,13 को बनाए रखने के लिए साइटोसोल से अग्रदूत प्रोटीन के आयात और असेंबली के विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल उप-डिब्बों में आयात और असेंबली के कसकर विनियमित साधनों की आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रिया के लिए नियत परमाणु-एन्कोडेड प्रोटीन आमतौर पर एक माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण अनुक्रम (एमटीएस) ले जाते हैं जो उन्हें ऑर्गेनेल को लक्षित करता है और उनके उप-कंपार्टमेंटल स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान करता है। अधिकांश मैट्रिक्स-बाउंड प्रोटीन में एक क्लीवेबल एन-टर्मिनल एमटीएस होता है, जबकि बाहरी या आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के लिए नियत लोगों में आमतौर पर आंतरिक लक्ष्यीकरण डोमेन 14 होता है। आयात प्रक्रिया विभिन्न चैनलों के एक सेट द्वारा की जाती है जो ऑर्गेनेल 13 में प्रवेश के लिए कई रास्ते प्रदान करते हैं। बाहरी झिल्ली (टीओएम) जटिल शटल का ट्रांसलोकेस साइटोसोल से इंटरमेम्ब्रेन स्पेस में अग्रदूतों को रखता है, जहां उन्हें आंतरिक झिल्ली (टीआईएम) परिसर के ट्रांसलोकेस द्वारा पहचाना जाता है। यह परिसर मैट्रिक्स में परमाणु-एन्कोडेड अग्रदूतों को आयात करने के लिए जिम्मेदार है, जहां प्रोटीज प्रीसीक्वेंस को लक्षित करने वाले एन-टर्मिनल को क्लीव करते हैं। बाहरी झिल्ली के लिए नियत प्रोटीन को सीधे टॉम कॉम्प्लेक्स के माध्यम से इस झिल्ली में डाला जा सकता है, जबकि आंतरिक झिल्ली के लिए नियत लोगों को एक टीआईएम प्रोटीन, विशेष रूप से टीआईएम 22 द्वारा डाला जाता है। उनके आयात के बाद, प्रोटीन को निवासी प्रोटीज और चैपरोन द्वारा आगे संसाधित किया जाता है और अक्सर बड़े परिसरों को बनाने के लिए गठबंधन किया जाता है, जैसे कि इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में पाए जाने वाले।

माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात स्वयं भी माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य के माप के रूप में कार्य करता है, क्योंकि यह प्रक्रिया झिल्ली क्षमता की उपस्थिति और एटीपी 15 के रूप में ऊर्जा के स्रोत पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, जब झिल्ली क्षमता समाप्त हो जाती है, तो प्रोटीन किनेज PINK1 को ऑर्गेनेल द्वारा नहीं लिया जा सकता है, और यह फॉस्फोराइलेशन संकेतों की ओर जाता है जो माइटोफैगी 16,17 नामक मार्ग के माध्यम से ऑर्गेनेल के क्षरण की शुरुआत को ट्रिगर करता है। इसी तरह की परिस्थितियों में, जब आयात बाधित होता है, तो प्रोटीन एटीएफ 5 ऑर्गेनेल में प्रवेश नहीं कर सकता है, और यह बाद में नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है, जहां यह यूपीआर जीन अभिव्यक्ति 18,19 के अप-विनियमन के लिए एक प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करता है। इस प्रकार, प्रोटीन आयात दक्षता को मापने से ऑर्गेनेल के स्वास्थ्य में व्यापक अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है, जबकि जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया का उपयोग नाभिक को प्रतिगामी सिग्नलिंग की डिग्री को इंगित करने के लिए किया जा सकता है।

माइटोकॉन्ड्रिया के बायोजेनेसिस के लिए और सामान्य रूप से सेलुलर स्वास्थ्य के लिए इसके स्पष्ट महत्व के बावजूद, स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रिया में आयात मार्ग उल्लेखनीय रूप से कम अध्ययन किया जाता है। इस रिपोर्ट में, हम कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया में अग्रदूत प्रोटीन के आयात को मापने में शामिल विशिष्ट चरणों का वर्णन करते हैं और मांसपेशियों और उपयोग में परिवर्तन के लिए आयात प्रणाली की अनुकूली प्रतिक्रिया को स्पष्ट करने के लिए डेटा प्रदान करते हैं, जो कंकाल की मांसपेशियों की अनुकूली प्लास्टिसिटी में प्रोटीन आयात के योगदान को दर्शाता है।

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Protocol

इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी जानवरों को यॉर्क विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधा में बनाए रखा जाता है। प्रयोगों को यॉर्क विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति (परमिट: 2017-08) से अनुमोदन के साथ पशु देखभाल दिशानिर्देशों पर कनाडाई परिषद के अनुसार आयोजित किया जाता है।

1. कंकाल की मांसपेशी से subsarcolemmal और intermyofibrillar माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक अलगाव

  1. अभिकर्मक तैयारी:
    1. तालिका 1 में उल्लिखित सभी बफ़र्स और मीडिया तैयार करें।
    2. बफर को पीएच 7.4 पर सेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस (2 सप्ताह तक) पर स्टोर करें, सिवाय नागरासे प्रोटीज को छोड़कर।
    3. हर बार ताजा नागर्स प्रोटीज (तालिका 1) तैयार करें।
  2. ऊतक हटाने और mincing
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए नीचे दिए गए चरणों का एक फ़्लोचार्ट चित्र 1 में प्रदान किया गया है।
    1. बफर 1 (तालिका 1) के ~ 20 मिलीलीटर के साथ एक ग्लास सिंटिलेशन शीशी भरें और इसे बर्फ पर रखें।
    2. जबकि माउस संवेदनाहारी के तहत है, कंकाल की मांसपेशियों (टिबिलिस पूर्वकाल, क्वाड्रिसेप्स, गैस्ट्रोकेनमियस आदि) की कटाई करता है, लगभग 500-1000 मिलीग्राम, और मांसपेशियों को ठंडा बफर 1 युक्त सिंटिलेशन शीशी में रखता है।
      नोट: गैसीय आइसोफ्लुरेन का उपयोग 2.5% पर एक संवेदनाहारी के रूप में O2 / मिनट के 0.4 एल की प्रवाह दर पर किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए एक चुटकी परीक्षण किया जाता है कि जानवर गैर-उत्तरदायी है।
    3. ऊतक संग्रह के बाद, गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के माध्यम से जानवर euthanize.
    4. बर्फ पर एक घड़ी ग्लास को पूर्व-ठंडा करें। मांसपेशियों से किसी भी वसा या संयोजी ऊतक को हटा दें और घड़ी के कांच पर ऊतक को तब तक कीमा बना दें जब तक कि यह एक समरूप घोल न हो।
    5. कीमा बनाया हुआ ऊतक को एक पूर्व-ठंडा 50 मिलीलीटर प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और सटीक वजन रिकॉर्ड करें।
    6. कीमा बनाया हुआ ऊतक 10 गुना बफर 1 + एटीपी (तालिका 1) के साथ पतला.
    7. 10 s के लिए 9.8 हर्ट्ज के पावर आउटपुट पर एक 8 मिमी ट्विन-ब्लेड homogenizer ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके मांसपेशियों के नमूने को homogenize करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मांसपेशियों का कोई दृश्यमान हिस्सा शेष नहीं है।
    8. एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 800 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: इस चरण का उद्देश्य एसएस और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रियल अंशों को अलग करना है। सुपरनेट में एसएस माइटोकॉन्ड्रिया होता है, जबकि गोली में आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया होता है।
  3. एसएस माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव
    1. किसी भी बड़े मलबे या संदूषकों को हटाने के लिए 50 मिलीलीटर प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों के एक और सेट में चीजक्लॉथ की एक परत के माध्यम से सुपरनेट को फ़िल्टर करें।
    2. एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,000 x g पर सुपरनेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सुपरनेट को छोड़ दें और बफर 1 + एटीपी के 3.5 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: एक P1000 के साथ पुन: निलंबित करें और इसे ध्यान से करें। माइटोकॉन्ड्रिया नाजुक ऑर्गेनेल हैं। धीरे से प्रदर्शन करें और पिपेट टिप के साथ गोली को छूने से बचें।
    4. एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सुपरनेट को तब तक छोड़ दें जब तक कि नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया और अन्य ऑर्गेनेल से रहित साइटोसोलिक अंश को अलग करने के लिए आगे की प्रक्रिया वांछित न हो। एक P200 पिपेट का उपयोग करके लगभग 95 μL resuspension माध्यम (तालिका 1) में गोली को ध्यान से निलंबित करें।
      नोट: चरण 1.3.3 के समान, पिपेट टिप के साथ गोली को छूने से बचें। छर्रे के आकार के आधार पर पुन: निलंबन माध्यम की मात्रा को बदला जा सकता है। यह एसएस माइटोकॉन्ड्रियल अंश है, जिसे बर्फ पर तब तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आईएमएफ अंश अलग नहीं हो जाता है। यदि वांछित है, तो साइटोसोलिक अंश, ऑर्गेनेल से रहित, एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में 100,000 x जी पर सुपरनेट को सेंट्रीफ्यूज करके अलग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें) और उसके बाद गोली को त्यागना।
  4. आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव
    1. बफर 1 + एटीपी में 10 गुना से चरण 1.2.8 से गोली को पतला करें। धीरे गोली और बफर एक साथ मिश्रण द्वारा एक Teflon pestle का उपयोग कर resuspend जब तक नमूना सुसंगत है.
    2. 10 s के लिए 9.8 हर्ट्ज के पावर आउटपुट पर एक 8 मिमी ट्विन-ब्लेड homogenizer ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके नमूने को homogenize करें।
    3. एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 800 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सुपरनेट को त्यागें और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रियल पैलेट को पतला करें 10-गुना बफर 2 का उपयोग करके और धीरे-धीरे मिश्रण करके टेफ्लॉन पेस्टल का उपयोग करके फिर से निलंबित करें जब तक कि यह सजातीय न हो।
    5. 10 मिलीग्राम / एमएल नागर्स प्रोटीज (तालिका 1) में 25 μL / g ऊतक जोड़ें और बर्फ पर इसकी तरफ सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब रखें, धीरे से ट्यूब साइड को किनारे करके हर मिनट मिश्रण करें।
      नोट: Nagarse के अलावा myofibrils के सीमित पाचन प्रदर्शन द्वारा आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया मुक्त करने में मदद करता है।
    6. 5 मिनट के बाद, निष्क्रियता के बिंदु पर नागर्स प्रोटीज को पतला करने और पाचन को रोकने के लिए बफर 2 (तालिका 1) के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. तुरंत एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. सुपरनेट को त्यागें और बफर 2 का उपयोग करके छर्रे को 10 गुना पतला करें और धीरे से मिश्रण करके टेफ्लॉन पेस्टल का उपयोग करके फिर से निलंबित करें।
    9. रेशेदार सामग्री को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 800 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. सुपरनेट को 50 एमएल प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के एक नए सेट में डालें, छर्रे को बाधित न करने के लिए सावधान रहें, जिसे त्याग दिया जा सकता है।
    11. चरण 1.4.7 के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. Supernate को छोड़ दें, बफर 2 के 3.5 mL जोड़ें और धीरे से एक P1000 पिपेट का उपयोग कर गोली resuspend.
    13. चरण 1.4.7 के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    14. Supernate को त्यागें और एक P200 पिपेट का उपयोग कर resuspension माध्यम के लगभग 180 μL के साथ धीरे से गोली resuspend छोड़ दें।
      नोट:: resuspension माध्यम की मात्रा गोली के आकार के आधार पर परिवर्तित किया जा सकता है। यह आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रियल अंश है, जिसे बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि इसका उपयोग आयात परख में नहीं किया जाना है।

2. माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात

  1. In vitro प्रतिलेखन
    नोट:: इन बाद के चरणों को रेखांकित कैसे आयात के लिए एक radiolabelled प्रोटीन तैयार करने के लिए। जांच के तहत आयात मार्ग लक्ष्य प्रोटीन की पसंद को निर्धारित कर सकता है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में आयात का मूल्यांकन करने के लिए, ऑर्निथिन कार्बामिल ट्रांसफरेज़, ओसीटी, और मैलेट डिहाइड्रोजनेज, एमडीएच, आमतौर पर उपयोग किया जाता है, जबकि टॉम 40 आमतौर पर बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में आयात के संकेत के रूप में उपयोग किया जाता है। निम्नलिखित चरणों के लिए, प्लास्मिड डीएनए पसंद के प्रोटीन को एन्कोडिंग करने की आवश्यकता होती है। प्लास्मिड डीएनए का प्रतिलेखन एक अलग दिन पर माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव से पहले किया जा सकता है, और इस प्रयोग से एकत्र किए गए एमआरएनए को संग्रहीत किया जा सकता है और भविष्य के अनुवाद और आयात प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है।
    1. डीएनए को रैखिक करें: प्लास्मिड डीएनए के 40 μL (5 μg / μL), 10x एंजाइम बफर के 5 μL और प्रतिबंध एंजाइम के 5 μL को संयोजित करें और 30 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: उपयोग किए गए प्रतिबंध एंजाइम प्लास्मिड के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, जिसके लिए एक अलग एंजाइम बफर की आवश्यकता हो सकती है, और प्रयोगात्मक स्थितियों में डीएनए का उपयोग किसी भी मात्रा / मात्रा में किया जा सकता है, क्योंकि टेम्पलेट को ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
    2. फिनोल और इथेनॉल का उपयोग करके रैखिक डीएनए को शुद्ध और अवक्षेपित करें। बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में बाद के सभी चरणों (2.1.3-2.1.15) को पूरा करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के लिए एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    3. बाँझ H2O की उपयुक्त मात्रा जोड़ें ताकि अंतिम आयतन 400 μL के बराबर हो। फिर, फिनोल के 400 μL जोड़ें।
    4. ~ 10 s के लिए व्युत्क्रम से जोरदार मिश्रण करें, और 4 °C पर 1 मिनट के लिए 17,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। वापस लें और ऊपरी चरण को बचाएं।
    5. फिनोल के 400 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamylalcohol (25: 24: 1, v: v: v)।
    6. ~ 10 s के लिए व्युत्क्रम द्वारा जोरदार रूप से मिश्रण करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 17,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। वापस लें और ऊपरी चरण को बचाएं।
    7. क्लोरोफॉर्म के 400 μL जोड़ें: isoamylalcohol (24: 1, v: v)।
    8. ~ 10 s के लिए व्युत्क्रम द्वारा जोरदार रूप से मिश्रण करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 17,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। वापस लें और ऊपरी चरण को बचाएं।
    9. 3M सोडियम एसीटेट (pH 7.0) के 40 μL जोड़ें, और 95% इथेनॉल के 1 mL जोड़ें।
    10. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों को 15 मिनट के लिए उनकी तरफ रखें।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. सुपरनेट को छोड़ दें और 80% इथेनॉल के 300 μL के साथ गोली को धोएं।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 17,000 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    14. सुपरनेट को छोड़ दें और गोली को हवा से सुखाएं। एक बार गोली सूखने के बाद, यह स्पष्ट होना चाहिए।
    15. बाँझ H2O के 20 μL में गोली resuspend
    16. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें) और सुनिश्चित करें कि A260: 280 अनुपात 1.8 से ऊपर है।
    17. बाँझ H2O में 0.8 μg / μL की एकाग्रता के लिए डीएनए को पतला करें।
    18. डीएनए को ट्रांसक्राइब करें: प्लास्मिड (0.8 μg/ μL, 60.8 μL), बाँझ H2O (8.4 μL), 10 mM NTP (5.2 μL), 10 mM ATP (10.0 μL), 1 mM M-7-G (11.6 μL) के लिए मिश्रण को संयोजित करें, जैसा कि उल्लेखित चरण 2.1.19 (15.6 μL) के लिए RNAsin (5.2 μL) और RNAsin (5.2 μL) के लिए उपयुक्त μL (5.2 μL) के लिए उपयुक्त μL (15.6 μL) के लिए उपयुक्त μL (15.6 μL) के लिए मिश्रण (5.2 μL) के लिए उपयुक्त μL (15.6 μL) और एक उपयुक्त μL के लिए RNAsin (5.2 μL) SP6 पोलीमरेज़ के लिए 40 °C)
    19. मिश्रण तैयार करने के लिए 1M HEPES (pH 7.9) के 200 μL, 1 M MgAc2 के 100 μL, 4 M KAc के 500 μL, 20 mM spermidine के 100 μL, 0.5 M DTT के 100 μL, और बाँझ H20 के 200 μL जोड़ें।
      नोट: प्रतिक्रिया को वॉल्यूम में ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है जब तक कि अभिकर्मकों के प्रदान किए गए अनुपात को बनाए रखा जाता है। उपयोग किए जाने वाले आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग प्लास्मिड के भीतर जीवाणु प्रमोटर अनुक्रम द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    20. फिर, 2.1.2-2.1.15 चरणों के रूप में फिनोल और इथेनॉल का उपयोग करके एमआरएनए को शुद्ध और अवक्षेपित करें। बाँझ H2O के साथ 400 μL तक वॉल्यूम लाएं (280 μL जोड़ें) और चरण 2.1.2-2.1.15 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। बाँझ H2O के 20 μL में अंतिम गोली resuspend.
    21. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एमआरएनए की एकाग्रता को मापें, सुनिश्चित करें कि A260: 280 अनुपात ~ 2.0 है।
    22. बाँझ H2O में mRNA को 2.8 μg/μL तक पतला करें, और 50 μL एलीकोट में -20 °C पर स्टोर करें।
  2. इन विट्रो अनुवाद
    नोट: वांछित डीएनए का अनुवाद आयात प्रयोग के उसी दिन किया जाना चाहिए। इस प्रयोग के लिए रेडियोलेबल अमीनो एसिड के उपयोग की आवश्यकता होती है, और इसलिए उपयोगकर्ता को रेडियोआइसोटोप के उपयोग के लिए एक परमिट होना चाहिए, और सभी हैंडलिंग और निपटान संस्थान की नीतियों / आवश्यकताओं के अनुसार होना चाहिए। रेडियोआइसोटोप सुरक्षा उपायों से जुड़े कदमों को छोड़ दिया गया है या संक्षेप में वर्णित किया गया है, क्योंकि ये संभवतः संस्था के आधार पर भिन्न होंगे।
    1. आयात प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले माइटोकॉन्ड्रिया के प्रति नमूने ~ 20 μL की आपूर्ति करने के लिए पर्याप्त अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण (तालिका 2) तैयार करें और अनुवाद लेन के लिए एक ही मात्रा को शामिल करें।
    2. 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें (समय एमआरएनए, 25-60 मिनट के साथ भिन्न हो सकता है)।
    3. संस्था की रेडियोधर्मी सुरक्षा आवश्यकताओं के अनुसार 35S-मेथिओनिन उपयोग रिकॉर्ड करें और संस्था के दिशानिर्देशों के अनुसार रेडियोआइसोटोप के संपर्क में आने वाली किसी भी चीज़ का निपटान करें।
  3. प्रोटीन आयात
    नोट: ताजा पृथक माइटोकॉन्ड्रिया अगले चरणों के लिए आवश्यक हैं। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव प्रोटोकॉल को देखें। अन्य अलगाव विधियों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि माइटोकॉन्ड्रिया व्यवहार्य और कार्यात्मक न हो। बाद के चरणों के लिए, उपयोग किए गए माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों को ऊपर वर्णित के रूप में एक पुनर्सस्पेंशन बफर में पुन: निलंबित कर दिया जाता है (तालिका 1). माइटोकॉन्ड्रियल नमूने की प्रोटीन एकाग्रता भी आयात परख शुरू करने से पहले मापा जाना चाहिए।
    1. अनुवाद प्रतिक्रिया की शुरुआत के बाद लगभग 15 मिनट, माइटोकॉन्ड्रिया के 90 μg को बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में एलीकोट करें और ~ 10 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-इनक्यूबेट करें।
      नोट: एलीकोट वास्तव में प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले की तुलना में अधिक माइटोकॉन्ड्रिया; केवल 75 μg वास्तव में इस्तेमाल किया जाएगा. हालांकि, अधिक मात्रा में एलीकोटिंग एक आवश्यकता नहीं है।
    2. बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के एक ताजा सेट में, अनुवाद प्रतिक्रिया के 18 μL के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के 75 μg को संयोजित करें और वांछित समय के लिए 30 °C पर इनक्यूबेट करें।
    3. बर्फ पर अनुवाद प्रतिक्रिया की शेष मात्रा रखें; इसका उपयोग बाद में किया जाएगा।
      नोट: आयात एक समय-निर्भर प्रक्रिया है, इसलिए 1-60 मिनट से इनक्यूबेशन बार में एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग के साथ शुरू करना विवेकपूर्ण हो सकता है। एक विशिष्ट प्रतिक्रिया समय 30 मिनट है।
    4. इस समय के दौरान, सुक्रोज के 1 ग्राम, 2.5 M KCl के 200 μL, 10 μL 1 M MgCl2, 1 M HEPES (pH 7.4) के 100 μL के संयोजन से सुक्रोज कुशन तैयार करें, और बाँझ H2O का उपयोग करके वॉल्यूम को 5 mL पर लाएं।
    5. आयात प्रतिक्रिया में प्रत्येक ट्यूब के अनुरूप बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों का एक नया सेट तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब में सुक्रोज कुशन के 600 μL को एलीकोट करें और आयात प्रतिक्रिया समाप्त होने तक बर्फ पर रखें।
    6. उपयुक्त इनक्यूबेशन समय के बाद आयात प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, ट्यूब को 30 डिग्री सेल्सियस से हटा दें, इसे बर्फ पर रखें और फिर सुक्रोज कुशन के साथ ट्यूब के शीर्ष पर आयात प्रतिक्रिया को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
      नोट: यह चरण यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत धीरे-धीरे किया जाना चाहिए कि माइटोकॉन्ड्रिया क्षतिग्रस्त / टूट नहीं गया है। सुक्रोज कुशन माइटोकॉन्ड्रिया के प्रवास को धीमा करने में मदद करता है और बाद के सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान ट्यूब के नीचे "कुशन" इसके वंश को धीमा कर देता है।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 x g पर नमूनों + सुक्रोज कुशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. 2.4 M sorbitol के 25 mL, 1 M HEPES (pH 7.4) के 2 mL और डबल-आसुत H2O के 72 mL के संयोजन से ब्रेकिंग बफर तैयार करें।
    9. एसडीएस-पेज जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए लाइसिस बफर तैयार करें: गर्म ग्लिसरॉल के 50 एमएल, एसडीएस के 11.5 ग्राम, 1 एम ट्रिस (पीएच 6.8) के 31.25 एमएल को मिलाएं और डबल-आसुत एच 2 ओ के साथ 500 एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
    10. नमूना तैयारी के लिए, बाद के चरण में उपयोग किए जाने वाले β-मर्केप्टोएथेनॉल के 25 μL के साथ lysis बफर के 475 μL को मिलाएं।
      नोट: Lysis बफर अग्रिम में बनाया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है; हालांकि, β-mercaptoethanol के अलावा ताजा किया जाना है।
    11. एक P1000 पिपेट का उपयोग करते हुए, सावधानी से supernate को हटा दें और गोली को परेशान न करें। एक उपयुक्त रेडियोधर्मी अपशिष्ट कंटेनर में सुपरनेट का निपटान करें।
    12. बाहरी झिल्ली में आयात के लिए, टॉम 40 का उपयोग करके इसे निष्पादित करें, ताजा तैयार 0.1 एम सोडियम कार्बोनेट (पीएच 11.5) के 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    13. इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना 14,000 x g सेंट्रीफ्यूज करें। यह चरण केवल बाहरी झिल्ली आयात प्रतिक्रियाओं के लिए किया जाता है।
    14. एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन के लिए नमूने तैयार करने के लिए, बफर को तोड़ने के 20 μL, लाइसिस बफर के 20 μL, और β-mercaptoethanol जोड़ें और अच्छी तरह से resuspend। नमूना डाई के 5 μL जोड़ें.
    15. 37 μL लाइसिस बफर और नमूना डाई के 5 μL के साथ चरण 2.3.3 से शेष अनुवाद प्रतिक्रिया के 3 μL के संयोजन से नियंत्रण / अनुवाद लेन तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं।
    16. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूनों को उबालें और पैलेटिंग माइटोकॉन्ड्रिया से बचने के लिए कम गति से धीरे से नीचे स्पिन करें।
    17. एक SDS polyacrylamide जेल के लिए नमूनों को लागू करें।
      नोट: जेल प्रतिशत और बाद में रन समय इस बात पर निर्भर करेगा कि कौन सा प्रोटीन आयात किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, OCT 37 kDA है, और इसका परिपक्व संसाधित बैंड थोड़ा छोटा है; इसलिए, एक 12% जेल इन बैंडों के अच्छे अलगाव की अनुमति देता है।
    18. एक बार वैद्युतकणसंचलन पूरा हो जाने के बाद, जेल को हटा दें और इसे डबल-आसुत H2O में रखें।
    19. जेल को 5 मिनट के लिए धुएं के हुड में 5% टीसीए में उबालें, क्रैकिंग से बचने के लिए जेल को लगातार हिलाते हुए / स्थानांतरित करें।
      नोट: TCA विज़ुअलाइज़ेशन के लिए जेल को ठोस बनाने में मदद करता है; यह एक Bunsen बर्नर पर एक धातु ट्रे में किया जा सकता है. जेल को उदारता से कवर करने के लिए पर्याप्त टीसीए का उपयोग करें, ~ 1/
    20. जेल को हटा दें और इसे डबल-आसुत H2O में वापस रखें। इसे ~ 50 rpm पर 1 मिनट के लिए घूर्णन प्लेट पर उत्तेजित करें।
    21. ~ 50 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए एक घूर्णन प्लेट पर 10 mM Tris में जेल को धोएं, फिर से जेल को उदारता से कवर करने के लिए पर्याप्त का उपयोग करके, कंटेनर के ~ 1/2।
    22. 30 मिनट के लिए एक घूर्णन प्लेट पर 1 एम सैलिसाइक्लिक एसिड में जेल को धोकर प्रोटीन को अवक्षेपित करें, फिर से जेल को उदारता से कवर करने के लिए पर्याप्त सैलिसाइक्लिक एसिड का उपयोग करके, कंटेनर का ~ 1/2 उपयोग किया जा रहा है।
    23. 2.3.24-2.3.31 चरणों में वर्णित के रूप में जेल निर्जलित करें।
      नोट: यह कई तरीकों से किया जा सकता है। एक जेल ड्रायर ( सामग्री की तालिका देखें) एक समय-कुशल विकल्प प्रदान करता है (नीचे वर्णित); हालांकि अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीकों / किट का उपयोग किया जा सकता है जो अधिक लागत प्रभावी लेकिन अधिक समय लेने वाला हो सकता है। जेल सुखाने किट का उपयोग एक विकल्प के रूप में किया जा सकता है जिसे गर्मी या सक्शन के आवेदन की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन इसके बजाय जेल को विरूपण को रोकने के लिए सेलोफेन शीट के बीच हवा-सूखने की अनुमति देता है।
    24. जेल ड्रायर के झरझरा बिस्तर पर नीचे ब्लोटिंग पेपर की एक बड़ी शीट रखें। कागज तौलिया की एक शीट उस क्षेत्र में रखें जहां जेल लागू किया जाएगा।
    25. ब्लोटिंग पेपर के एक 15 सेमी x 20 सेमी टुकड़े को काट लें और इसे पेपर तौलिया पर रखें।
    26. 15 सेमी x 20 सेमी ब्लोटिंग पेपर के दूसरे टुकड़े का उपयोग करके कंटेनर से जेल को स्कूप करें और इसे पहले टुकड़े के शीर्ष पर फ्लैट रखें।
    27. प्लास्टिक रैप का थोड़ा बड़ा टुकड़ा काटें, ~ 20 सेमी x 25 सेमी, और इसे जेल पर रखें, लपेटे में कोई क्रीज या बुलबुले सुनिश्चित न करें।
      नोट: यह कुछ प्रयास ले सकता है, लेकिन यह आवश्यक है कि कोई फंसे हुए हवा जेब नहीं हैं।
    28. धीरे से लपेटने के शीर्ष पर जेल ड्रायर के प्लास्टिक कवर को बिछाएं, फिर से यह सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले या क्रीज नहीं हैं।
    29. पंप / वैक्यूम चालू करें और सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक कवर ने एक मुहर बनाई है। प्लास्टिक कवर के एक कोने को उठाकर सील का परीक्षण करें और इसे फिर से सील करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    30. जेल ड्रायर को बंद करें और 90 मिनट के लिए चलाएं। 30 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करने के लिए तापमान सेट करें, धीरे-धीरे 80 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचें, और फिर रन के अंत में 30 डिग्री सेल्सियस पर लौटें।
    31. एक बार निर्जलित होने के बाद, जेल ठोस हो जाएगा और कागज-पतला महसूस करेगा। सुखाने की प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्लास्टिक रैप में जेल लपेटें।
    32. एक फास्फोरस फिल्म के साथ एक फिल्म कैसेट में निर्जलित जेल रखें ( सामग्री की तालिका देखें), जेल का सामना करने वाले सफेद पक्ष के साथ। एक्सपोजर समय अलग-अलग होता है लेकिन बैंड के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 24-48 घंटे हो सकता है।
    33. फास्फोरस इमेजिंग में सक्षम है कि किसी भी उपयुक्त इमेजर का उपयोग कर autoradiography का उपयोग कर कल्पना.

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Representative Results

हमने बड़े पैमाने पर सचित्र किया है कि यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक और बरकरार कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया में आयात की दर निर्धारित करने के लिए एक वैध परख है। अनुपचारित स्थितियों की तुलना में, मैट्रिक्स में मैलेट डिहाइड्रोजनेज (एमडीएच) जैसे विशिष्ट अग्रदूत प्रोटीन का आयात झिल्ली क्षमता के प्रति संवेदनशील है क्योंकि इसे वैलिनोमाइसिन, एक श्वसन श्रृंखला अनकपलर (चित्रा 2 ए) द्वारा बाधित किया जा सकता है। आयात भी बाधित होता है जब माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 की उपस्थिति में घुलनशील होते हैं। आयात प्रक्रिया बाहरी एटीपी की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है, जो झिल्ली में स्थानांतरण के लिए अग्रदूत प्रोटीन को उजागर करने का कार्य करती है, और श्वसन और एटीपी प्रावधान की दर से कसकर नियंत्रित होती है (डेटा नहीं दिखाया गया है20)। आयात में अलग-अलग अंतर भी इंटरमायोफिब्रिलर और सबसारकोलेमल माइटोकॉन्ड्रियल अंशों के बीच देखे जाते हैं, भाग में प्रोटीन आयात मशीनरी अभिव्यक्ति में भिन्नता के कारण, साथ ही साथ इन माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 2 बी) के बीच श्वसन दर।

कंकाल की मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील ऑर्गेनेल हैं जो ऊर्जा की मांग में परिवर्तन के लिए आसानी से प्रतिक्रिया करते हैं। मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री पुरानी व्यायाम की अवधि के बाद या विद्युत उत्तेजना-प्रेरित संकुचनशील गतिविधि के जवाब में बढ़ जाती है (समीक्षा 21 के लिए देखें)। उदाहरण के लिए, चूहे कंकाल की मांसपेशी की पुरानी संकुचनशील गतिविधि के 7 दिन ओम और मैट्रिक्स में आयात को क्रमशः 1.6-गुना और 1.4-गुना तक बढ़ादेते हैं, क्रमशः 22 (चित्रा 3 ए, 3 बी)। माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री में ये परिवर्तन, भाग में, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात प्रणाली की क्षमता में परिवर्तन द्वारा लाए जाते हैं। दरअसल, अग्रदूत प्रोटीन की आयात दर और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के एक अच्छे अनुमान के बीच एक घनिष्ठ संबंध, जैसा कि नियंत्रण या denervated स्थितियों के तहत जटिल IV मार्कर साइटोक्रोम ऑक्सीडेज द्वारा मापा जाता है, को सचित्र किया जा सकता है23 (चित्रा 3 सी)।  

संकुचनशील गतिविधि में परिवर्तन के लिए मांसपेशियों में आयात प्रणाली की अनुकूलन क्षमता से पता चलता है कि यदि पहचान की जाती है तो आयात मार्ग में दोषों को हल करने के लिए व्यायाम का उपयोग उपचार के रूप में किया जा सकता है। बाक्स-बाक डबल नॉकआउट जानवरों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल-मध्यस्थता एपोप्टोसिस की जांच के दौरान, हमने देखा कि इन प्रयोगात्मक जानवरों की मांसपेशियों में कम माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री मैट्रिक्स में अग्रदूत प्रोटीन के आयात में कमी के साथ थी। फिर हमने इस संभावना की जांच की कि अभ्यास इस आयात क्षमता को बहाल कर सकता है। दरअसल, स्वैच्छिक व्हील रन प्रशिक्षण के 6 सप्ताह के बाद, प्रोटीन आयात को नॉकआउट जानवरों 24 में स्तरों को नियंत्रित करने के लिए बहाल किया गया था, जो माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और कार्य (चित्रा 4) को बचाने के लिए आयात मार्ग की अनुकूली प्लास्टिसिटी को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: पिछले work8 के आधार पर कंकाल की मांसपेशी से एसएस और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए वर्कफ़्लो की योजनाबद्ध। यह प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों के भीतर उनके भौगोलिक स्थान के आधार पर कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की अनुमति देता है। एसएस माइटोकॉन्ड्रिया अधिक तेजी से और आसानी से मुक्त हो जाते हैं, जबकि आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया को मायोफिब्रिल से उन्हें अनटैगल करने के लिए प्रोटीज के साथ एक और पाचन कदम की आवश्यकता होती है। ध्यान दें कि इन subfractions के अलगाव अग्रानुक्रम में किया जा सकता है. एक अद्यतन, इसी तरह की प्रक्रिया हाल ही में प्रकाशित किया गया है25. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में प्रोटीन आयात। (ए) एमडीएच के लिए आयात की सामान्य दरों को एसएस और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया (लेन 4 और 7) और अग्रदूत एमडीएच (लेन 1) के अनुवाद उत्पाद में दिखाया गया है। निचला बैंड आयातित परिपक्व एमडीएच का प्रतिनिधित्व करता है। वैलिनोमाइसिन के अलावा एसएस और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया के मैट्रिक्स में एमडीएच प्रोटीन आयात को रोकता है, क्योंकि यह अनकपलर झिल्ली क्षमता (लेन 2 और 5) को नष्ट कर देता है। ट्राइटन-एक्स एक डिटर्जेंट है जो आंतरिक झिल्ली को घुलनशील बनाता है, जिससे इन उप-खंडों (लेन 3 और 6) में एमडीएच आयात को रोक दिया जाता है। प्रोटीन आयात समय अवधि, 4 मिनट, 7 मिनट, 10 मिनट, 15 मिनट और 30 मिनट की अवधि में वृद्धि के लिए किया गया था। ये डेटा बताते हैं कि आयात एक समय-निर्भर प्रक्रिया है और यह भी कि एसएस और आईएमएफ माइटोकॉन्ड्रिया में आयात (बी) के लिए अलग-अलग दरें या क्षमताएं हैं। टीएल, अनुवाद लेन; VAL, valinomycin; TRI, Triton-X; सीटीएल, नियंत्रण; एसएस, subsarcolemmal; IMF, intermyofibrillar. इस आंकड़े को ताकाहाशी एम और हुड डीए 20 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन आयात अनुकूलनीय है और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के अनुमानों से कसकर जुड़ा हुआ है। स्प्राग डॉली चूहों को संकुचनशील गतिविधि को प्रेरित करने के लिए विद्युत उत्तेजना के अधीन किया गया था, जो व्यायाम प्रशिक्षण का एक मॉडल था। (ए) ओएम में टॉम 40 आयात किसी भी समय बिंदु पर नियंत्रण की तुलना में क्रोनिक रूप से उत्तेजित जानवरों से मांसपेशियों में 1.6 गुना अधिक था। (बी) माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में ओसीटी आयात इनक्यूबेशन के हर समय बिंदु पर बढ़ गया था, और कुल मिलाकर, इसके परिणामस्वरूप क्रोनिक रूप से उत्तेजित मांसपेशियों से माइटोकॉन्ड्रिया में 1.4 गुना वृद्धि हुई। (सी) आयात सकारात्मक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के सूचकांक के साथ सहसंबद्ध है, जैसा कि COX गतिविधि द्वारा मूल्यांकन किया गया है, r = 0.69। ये माप उन जानवरों से लिए गए थे जिन्हें denervation के अधीन किया गया था, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और आयात की दर को कम करने के लिए दिखाया गया है। कॉन, नियंत्रण; डेन, denervated; Stim, उत्तेजित; टीएल, अनुवाद लेन; * पी < 0.05. आंकड़े 3ए और 3 बी को जोसेफ ए-एम और हुड डीए 22 और सिंह बी एंड हुड डीए 23 से 3 सी से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रशिक्षण विवो में आयात दोषों को बचाता है। बाक्स / बाक डबल नॉकआउट जानवरों ने माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में 37% तक कम प्रोटीन आयात प्रदर्शित किया। स्वैच्छिक पहिया चलने के छह सप्ताह के स्तर को नियंत्रित करने के लिए आयात दोष को बचाया। डब्ल्यूटी, वाइल्डटाइप; DKO, डबल नॉकआउट; टीएल, अनुवाद लेन; * पी < जीनोटाइप के 0.05 मुख्य प्रभाव; प्रशिक्षण के 0.05 मुख्य प्रभाव < पी। इस आंकड़े को झांग वाई एट अल.24 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफर 1: बफर 1 + एटीपी: बफर 2: पुन: निलंबन माध्यम: नागरसे प्रोटीज
100 mM KCl 100 mM KCl 100 mM KCl 100 mM KCl बफर 2 में 10 मिलीग्राम / एमएल
5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 10 mM MOPS नोट: ताजा बनाओ और बर्फ पर रहो
5 mM EDTA 5 mM EDTA 5 mM EGTA 0.2% BSA
50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM Tris
1 mM ATP 1mM एटीपी

तालिका 1: बफ़र्स और resuspension मीडिया.

अभिक्रिया आयतन का % 1 प्रतिक्रिया मिश्रण
रेटिकुलोसाइट लिसेट 64.10% 11.8 μL
अमीनो एसिड (-मेथिओनिन) 2.20% 0.4 μL
बाँझ H2O 21.60% 3.97 μL
35 एस-मेथिओनिन 7.20% 1.33 μL
mRNA 5.40% 1.0 μL
कुल वॉल्यूम 18.5 μL
नोट:
1) 35S-methionine पिछले जोड़ें;
2) बर्फ पर धीरे-धीरे लिसेट को पिघलाएं, और फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों को दो तक सीमित करें। यह अनुशंसा की जाती है कि लाइसेट को आगमन पर एलीकोट किया जाए
3) mRNA की मात्रा को तदनुसार बाँझ H2O मात्रा को बदलकर ट्रांसलेशनल दक्षता को अनुकूलित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

तालिका 2: अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण

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Discussion

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के भीतर उनके संश्लेषण और विस्तार के लिए परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम दोनों की अभिव्यक्ति और समन्वय पर विशिष्ट रूप से निर्भर हैं। हालांकि, परमाणु जीनोम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम के विशाल बहुमत (99%) को एन्कोड करता है, और यह माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस का समर्थन करने में प्रोटीन आयात मशीनरी के महत्व को रेखांकित करता है। आयात भी एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग घटना के रूप में कार्य करता है, क्योंकि आयात करने में विफलता सामने आए प्रोटीन प्रतिक्रिया और / या माइटोफैगी 15,16,26 की दीक्षा को बढ़ावा दे सकती है। चूंकि आयात कई कार्यात्मक चैनलों और चैपरोन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, एक बरकरार झिल्ली क्षमता, साथ ही एटीपी की उपलब्धता, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात का मूल्यांकन ऑर्गेनेल के स्वास्थ्य और ऊर्जा की स्थिति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन आयात क्षमता के मूल्यांकन के लिए मानक विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकों का उपयोग करके आसपास के ऊतकों से ऑर्गेनेल के अलगाव की आवश्यकता होती है। आयात का मूल्यांकन उसी तरह से किया जाता है जैसे कि कोई माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम गतिविधियों के वीमैक्स का मूल्यांकन करेगा, समय और सब्सट्रेट एकाग्रता पर निर्भर एक अत्यधिक नियंत्रित तरीके से और सेलुलर साइटोसोलिक प्रभावों से स्वतंत्र। यहां प्रस्तुत अलगाव विधि, या इसके समान प्रस्तुतियों, का उपयोग कई वर्षों से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और एंजाइम गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है8,9,10,11। यह तकनीक अपनी सीमाओं के बिना नहीं है, क्योंकि यह माइटोकॉन्ड्रिया की सामान्य आकृति विज्ञान को बाधित करती है क्योंकि वे सीटू 27 में मौजूद हैं, जो कंकाल की मांसपेशियों में अत्यधिक जटिल है, जो छोटे गोलाकार संरचनाओं से लेकर, एक अत्यधिक शाखित रेटिकुलर नेटवर्क 3 तक है, जो मांसपेशियों की कोशिका के भीतर उनके सबसारकोलेमल या इंटरमायोफाइब्रिलर स्थान पर निर्भर करता है। इसके अलावा, प्रोटीज नागरसे का उपयोग जांच के दायरे में आया है3,28। इस विधि के लिए एक अद्यतन, nagarse के बजाय ट्रिप्सिन का उपयोग करते हुए, हाल ही में प्रकाशित किया गया है25, और ट्रिप्सिन का उपयोग दूसरों द्वारा मांसपेशियों के माइटोकॉन्ड्रिया 29 को अलग करने के लिए किया गया है। दरअसल, किसी भी वैकल्पिक अलगाव विधि का उपयोग किया जा सकता है जो कार्यात्मक रूप से बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया उत्पन्न करता है, जिसमें ऐसी तकनीकें शामिल हैं जो प्रोटीज 30 को नियोजित नहीं करती हैं या मानव मांसपेशियों से छोटे बायोप्सी आकार के नमूनों के लिए डिज़ाइन की गई हैं। यहां प्रस्तुत विधि में एसएस माइटोकॉन्ड्रिया को जल्दी और आसानी से अलग करने का लाभ है, लेकिन आईएमएफ उप-खंड के अलगाव के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया की अधिक उपज और शुद्धता प्राप्त की जा सकती है। यदि सावधानी से किया जाता है, तो इस अलगाव प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप उच्च श्वसन नियंत्रण अनुपात के साथ कार्यात्मक रूप से बरकरार ऑर्गेनेल हो सकते हैं, जो राज्य 3 और 4 श्वसन 8 की उचित दरों का संकेत है।

माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात के माप के लिए यह भी आवश्यक है कि ये ऑर्गेनेल अपनी झिल्ली क्षमता को बनाए रखते हैं, क्योंकि आंतरिक झिल्ली में आयात इस इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोटॉन प्रेरक बल पर निर्भर करता है, जो सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अग्रदूत अनुक्रमों को आकर्षित करने और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए मैट्रिक्स स्पेस में अग्रदूत के परिवहन में मध्यस्थता करने में मदद करता है। ऐसी स्थितियों के तहत, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और आयात की तुलना का मूल्यांकन शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच किया जा सकता है, जैसे कि व्यायाम, उम्र बढ़ने और मांसपेशियों का उपयोग, उदाहरण के लिए। इस संबंध में, पिछले काम से पता चला है कि आयात एक अत्यधिक अनुकूलनीय मार्ग है जो मांसपेशियों के उपयोग और उपयोग के परिवर्तित राज्यों का जवाब देता है और अत्यधिक आरओएस उत्सर्जन 10,22,23,32 के माध्यम से निषेध के प्रति संवेदनशील है। यह प्लास्टिसिटी, भाग में, प्रोटीन आयात मशीनरी घटकों की अभिव्यक्ति में अनुकूली परिवर्तनों के कारण है। चूंकि यह तकनीक माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव पर निर्भर करती है, इसलिए आयात मार्ग पर कोई भी विनियमन जो साइटोसोलिक कारकों या अंतर-ऑर्गेनेल क्रॉसस्टॉक से स्टेम हो सकता है, प्रयोग की व्याख्या से हटा दिया जाता है। यह तकनीक की एक सीमा और ताकत दोनों है, क्योंकि निष्कर्ष आयात मार्ग की क्षमता से ही बनाए जा सकते हैं (एंजाइम गतिविधि के Vmax के समान), लेकिन क्षणिक या बाहरी संकेत जो प्रयोगात्मक मॉडल के साथ हो सकते हैं, खो सकते हैं। इसे दरकिनार करने के लिए, साइटोसोलिक अंश के नमूने के साथ आयात प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करना संभव है, जैसा कि ऊपर वर्णित है, साइटोसोलिक वातावरण में परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए जो आयात दरों को प्रभावित कर सकते हैं, जैसा कि पहले किया गया था22। इसके अलावा, आयात मशीनरी घटक तीव्र, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के अधीन हैं जो उनके कार्यों को बदल सकते हैं। हाल के काम से पता चला है कि विशिष्ट टॉम आयात रिसेप्टर्स के फॉस्फोराइलेशन को माइटोफैगी 33 से जोड़ा जा सकता है। दरअसल, अनुसंधान का एक क्षेत्र जो अधिक ध्यान देता है, वह आरओएस द्वारा मध्यस्थता किए गए आंतरिक सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से आयात प्रक्रिया का तीव्र मॉडुलन है या आयात रिसेप्टर्स और चैपरोन के सहसंयोजक संशोधन द्वारा, जैसा कि खमीर और अन्य निचले जीवों में प्रलेखित है34,35।

माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन आयात अनुकूली ऑर्गेनेल विकास के लिए एक प्रवेश द्वार का प्रतिनिधित्व करता है और माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक संवेदनशील संकेतक है। यह समझना कि इस प्रक्रिया को कैसे विनियमित किया जाता है, माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस, यूपीआर सिग्नलिंग और माइटोफैगी की दीक्षा के विनियमन पर प्रकाश डाल सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात स्तनधारी प्रयोगात्मक मॉडल में एक व्यापक रूप से अध्ययन की गई प्रक्रिया नहीं है, और इस क्षेत्र में अनुसंधान की विशाल क्षमता का विकास हमें उन बीमारियों की अधिक समझ प्राप्त करने में मदद कर सकता है जिनमें माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन स्पष्ट है या माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को बढ़ावा देने के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखकों द्वारा हितों का कोई संघर्ष, वित्तीय या अन्यथा घोषित नहीं किया जाता है।

Acknowledgments

लेखक मैकगिल विश्वविद्यालय के डॉ जी.C शोर, वाशिंगटन स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ ए स्ट्रॉस और ला ट्रोब विश्वविद्यालय के डॉ.M टी रयान को अभिव्यक्ति प्लास्मिड के मूल दान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं जो इस शोध के लिए उपयोग किए गए थे। इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) से डी ए हूड तक वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। डी ए हूड सेल फिजियोलॉजी में कनाडा रिसर्च चेयर के धारक भी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2% BSA Sigma A2153
35S-methionine Perkin Elmer NEG709A500UC Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP Sigma A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper Thermo Fisher 05-714-5
Cassette for film Kodak Kodak Xomatic
Centrifugation Tube Thermo Fisher 3138-0050
Chloroform Thermo Fisher C298-4
DTT Sigma D9779-5G
EDTA BioShop EDT002
EGTA Sigma E4378
Gel Dryer BioRad Model 583
Gel Drying Kit Sigma or BioRad Z377570-1PAK or OW-GDF-10 Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol Caledon Laboratory Chemicals 5350-1-40
HEPES Sigma H3375
High Speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer IKA T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol Sigma I9392
KAc BioShop POA301.500
KCl Sigma P3911
M7G New England Biolab S1404S Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl BioShop MAG510
MgSO4 Thermo Fisher M65-500
MOPS BioShop MOP001
NaCl BioShop SOD001
NTP Thermo Fisher R0191
OCT Plasmid - - Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada
pGEM4Z/hTom40 Plasmid - - Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid - - Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol Sigma P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol Sigma P3803 Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film Fujifilm BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate Promega L4960 Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin Promega N2311
Rotor for High Speed Centrifuge Beckman Coulter JA-25.50
SDS BioShop SDS001.500 Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate Bioshop SAA 304
Sodium Carbonate VWR BDH9284
Sodium salicylate Millipore Sigma 106601
Sorbitol Sigma S6021
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
Spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop 2000
Spermidine Sigma S-2626
Sucrose BioShop SUC507
T7 RNA Polymerase Promega P2075
Tabletop Centrifuge Thermo Fisher AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid Thermo Fisher A322-500
Tris BioShop TRS001
β-mercaptoethanol Sigma M6250-100ML

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References

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जैव रसायन अंक 179 माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस subsarcolemmal माइटोकॉन्ड्रिया intermyofibrillar माइटोकॉन्ड्रिया व्यायाम प्रशिक्षण इन विट्रो प्रतिलेखन
कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया की प्रोटीन आयात क्षमता का मापन
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Oliveira, A. N., Richards, B. J., Hood, D. A. Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria. J. Vis. Exp. (179), e63055, doi:10.3791/63055 (2022).

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