Summary
يفصل البروتوكول الحالي عزل الفيكوبيليزومات من البكتيريا الزرقاء عن طريق الطرد المركزي من خلال تدرج كثافة السكروز المتقطع. يتم تأكيد أجزاء من الفيكوبيليسومات السليمة من خلال طيف انبعاثات الفلورسنت 77K وتحليل SDS-PAGE. الكسور الفيزيائية الناتجة مناسبة للتلطيخ السلبي ل TEM وتحليل الطيف الكتلي.
Abstract
في البكتيريا الزرقاء ، الفيكوبيليسوم هو مركب بروتين هوائي حيوي يحصد الضوء وينقل الطاقة إلى النظام الضوئي الأول والثاني للكيمياء الضوئية. دراسة بنية وتكوين الفيكوبيليسوم هي ذات أهمية كبيرة للعلماء لأنها تكشف عن تطور واختلاف التمثيل الضوئي في البكتيريا الزرقاء. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفصلة ومحسنة لكسر خلايا البكتيريا الزرقاء بتكلفة منخفضة بواسطة مضرب الخرز بكفاءة. يمكن بعد ذلك عزل الفيكوبيليسوم السليم من مستخلص الخلية عن طريق الطرد المركزي الفائق لتدرج السكروز. وقد أثبتت هذه الطريقة أنها مناسبة لكل من البكتيريا الزرقاء النموذجية وغير النموذجية مع أنواع الخلايا المختلفة. كما يتم توفير إجراء خطوة بخطوة لتأكيد سلامة وخصائص البروتينات الفيزيائية بواسطة التحليل الطيفي الفلوري 77K و SDS-PAGE الملطخ بكبريتات الزنك و Coomassie Blue. يمكن أيضا إخضاع الفيكوبيليسوم المعزول لمزيد من التحليلات الهيكلية والتركيبية. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول دليل بداية مفيد يسمح للباحثين غير المطلعين على البكتيريا الزرقاء بعزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم بسرعة.
Introduction
Phycobilisome (PBS) هو مركب ضخم من البروتين الصباغي القابل للذوبان في الماء يرتبط بالجانب السيتوبلازمي من الأنظمة الضوئية في أغشية الثايلاكويد من البكتيريا الزرقاء1. يتكون PBS في المقام الأول من البروتينات الفيزيائية الملونة وبروتينات الروابط عديمة اللون1,2. يمكن تقسيم البروتينات الفيكوبيلية إلى أربع مجموعات رئيسية: فيكويريثرين ، فيكويريثروسيانين ، فيكوسيانين ، وألوفيكوسيانين 3. وتمتص المجموعات الأربع الرئيسية أطوال موجية مختلفة من الطاقة الضوئية في حدود 490-650 نانومتر، والتي يمتصها الكلوروفيل بشكل غير فعال3. يمكن أن يكون PBS بمثابة هوائي حصاد الضوء لجمع الطاقة الضوئية وتوصيلها إلى Photosystem II و I4.
يختلف هيكل وتكوين PBS من نوع إلى آخر. بشكل جماعي ، تم تحديد ثلاثة أشكال من الفيكوبيليسوم (hemidiscodial ، على شكل حزمة ، وعلى شكل قضيب) في أنواع مختلفة من البكتيريا الزرقاء5. حتى في نفس النوع ، يتغير تكوين PBS استجابة للبيئة ، مثل جودة الضوء واستنزاف المغذيات6،7،8،9،10،11. لذلك ، كان الإجراء التجريبي لعزل PBS من البكتيريا الزرقاء مفيدا في دراسة PBS12. على مدى عدة عقود ، عزلت العديد من البروتوكولات المختلفة PBS وحللت هيكلها وتكوينها ووظيفتها6،7،8،12،13،14،15،16،17. توفر المجموعة الواسعة من طرق عزل PBS بالفعل المرونة في عزل المجمع في الأنواع المختلفة باستخدام كواشف وأدوات مختلفة. ومع ذلك ، فإنه يجعل أيضا اختيار بروتوكول مناسب أكثر صعوبة للعلماء غير المألوفين مع البكتيريا الزرقاء و PBS. لذلك ، تم تطوير بروتوكول معمم ومباشر في هذا العمل للراغبين في بدء عزل PBS عن البكتيريا الزرقاء.
يتم تلخيص طرق عزل PBS عن المنشورات السابقة هنا. نظرا لأن PBS عبارة عن مركب بروتيني قابل للذوبان في الماء ويتم فصله بسهولة ، فإن هناك حاجة إلى مخزن فوسفات أيوني عالي القوة لتحقيق الاستقرار في PBS أثناء الاستخراج18. تم نشر العديد من المقالات البحثية التي تصف طرق عزل PBS عن البكتيريا الزرقاء في الماضي. تتطلب معظم الطرق تركيزا عاليا من المخزن المؤقت للفوسفات8،14،15،18،19. ومع ذلك ، تختلف إجراءات التعطيل الميكانيكي للخلايا ، مثل الاستخراج بمساعدة الخرز الزجاجي ، صوتنة 20 ، والصحافة الفرنسية 6،8،14. يمكن الحصول على بروتينات فيكوبيلي مختلفة عن طريق هطول الأمطار مع كبريتات الأمونيوم20 وتنقيتها بواسطة HPLC21 أو عمود كروماتوغرافي22. من ناحية أخرى ، يمكن عزل PBS السليم بسهولة عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز6،8،15.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام نموذج واحد من البكتيريا الزرقاء وواحد من البكتيريا الزرقاء غير النموذجية كمواد لعزل PBS. وهي نموذج أحادي الخلية يتحمل الجلوكوز Synechocystis sp. PCC 6803 (المشار إليه فيما يلي باسم Syn6803) و Leptolyngbya sp. JSC-1 الخيطي غير النموذجي (المشار إليه فيما يلي باسم JSC-1) ، على التوالي 7,23,24. يبدأ البروتوكول بتعطيل البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية والخيطية في مخزن مؤقت للفوسفات عالي القوة الأيونية. بعد التحلل ، يتم جمع المواد الفائقة عن طريق الطرد المركزي ثم معالجتها بمنظف غير أيوني (Triton X-100) لإذابة البروتينات القابلة للذوبان في الماء من أغشية thylakoid. يتم تطبيق إجمالي البروتينات القابلة للذوبان في الماء على تدرج كثافة السكروز المتقطع لتجزئة PBS. يتكون تدرج السكروز المتقطع في هذا البروتوكول من أربعة محاليل سكروز ويقسم PBS السليم في أدنى أجزاء طبقة السكروز25. يمكن تحليل سلامة PBS بواسطة SDS-PAGE ، وتلطيخ الزنك ، والتحليل الطيفي الفلوري 77K 6,7,8,26. هذه الطريقة مناسبة للعلماء الذين يهدفون إلى عزل PBS السليم من البكتيريا الزرقاء ودراسة خصائصه الطيفية والهيكلية والتركيبية.
هناك العديد من المزايا لهذا البروتوكول. (1) هذه الطريقة موحدة ويمكن استخدامها لعزل PBS السليم عن كل من البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية والخيطية. تصف معظم المقالات الطريقة التي تم تطبيقها في أي نوع واحد من البكتيريا الزرقاء4,7,8,12,13,14,16,18. (2) يتم تنفيذ هذه الطريقة في درجة حرارة الغرفة ، حيث ينفصل PBS عند درجة حرارة منخفضة19,27. (3) تصف هذه الطريقة استخدام مضرب الخرز لتعطيل الخلايا. لذلك ، فهي أرخص وأكثر أمانا من الصحافة الفرنسية عالية الضغط وتلف السمع المحتمل من الصوت بطرق أخرى8،13،14،20. (4) هذه الطريقة تعزل PBS سليمة عن طريق الطرد المركزي الفائق التدرج السكروز. وبهذه الطريقة ، يمكن فصل PBS السليم بأحجام مختلفة و PBS المنفصل جزئيا بناء على تركيز السكروز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على Synechocystis sp. PCC 6803 ، السلالة النموذجية التي تتحمل الجلوكوز ، من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان. تم الحصول على Leptolyngbya sp. JSC-1 ، خيطي غير نموذجي ، من الدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
1. زراعة الخلايا والحصاد
- قم بتلقيح خلايا Syn6803 أو JSC-1 باستخدام حلقة تلقيح معدنية في قارورة مخروطية سعة 100 مل تحتوي على 50 مل من وسط B-HEPES28. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية تحت فوتونات 50 ميكرومول m-2 s-1 (الضوء الأبيض LED) في 1٪ (v / v) CO2 مع التحريك المستمر بواسطة التقليب المغناطيسي (120 دورة في الدقيقة) حتى تصل الثقافة إلى مرحلة النمو الأسي المتوسط (OD750 = 0.6-0.8).
ملاحظة: احصد زراعة الخلايا عندما تصل الكثافة البصرية للثقافة عند 750 نانومتر (OD750) إلى 0.6-0.8 عن طريق النقل إلى قارورة جديدة. استخدمت الكثافة البصرية بشكل روتيني لتقدير كثافة الخلايا الميكروبية في المزارع السائلة29. تم استخدام الأطوال الموجية من 720-750 نانومتر في دراسات مختلفة لقياس نمو البكتيريا الزرقاء30,31,32. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام OD750 لأن JSC-1 يمكن أن تنتج أصباغ تمتص الضوء الأحمر البعيد7. وبدلا من ذلك، استخدم تركيز الكلوروفيل أيضا لقياس نمو البكتيريا الزرقاء33. - انقل ثقافة الخلية (OD750 ~ 0.8) إلى قارورة مخروطية سعة 1 لتر وقم بتخفيفها إلى OD750 = 0.2 في 500 مل من وسط B-HEPES. قم بزراعة الثقافة حتى مرحلة النمو الأسي المتأخرة (OD750 = 0.8-1.0) في نفس الحالة المذكورة أعلاه (الخطوة 1.1) ثم حصاد الثقافة عن طريق الطرد المركزي.
- قم بطرد الثقافة عند 10000 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخلص تماما من المادة الفائقة.
ملاحظة: يمكن تخزين كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. تحلل الخلايا
- تعليق كريات الخلية وغسلها مرتين مع 0.75 M K-phosphate العازلة ، درجة الحموضة 7.
ملاحظة: لعمل 0.75 M K-phosphate العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7 ، قم بإعداد 1.5 M من K2HPO4 و 1.5 M من KH2PO4 بشكل منفصل. مزيج 615 مل من 1.5 M K2HPO4 و 385 مل من 1.5M KH2PO4 للحصول على 1.5 M K-فوسفات العازلة في الرقم الهيدروجيني 7. ما عليك سوى تخفيفه بنفس الكمية من ddH2O لجعل 0.75 M K-phosphate buffer عند الرقم الهيدروجيني 7. - بيليه الخلايا في أنابيب الطرد المركزي 50 مل عن طريق الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من supernatant وأعد تعليق الخلايا باستخدام 0.75 M K-phosphate buffer. قم بقياس الوزن الرطب للحبيبة بواسطة ميزان إلكتروني وأعد تعليق 1 جم من الوزن الرطب للحبيبة في 5 مل من المخزن المؤقت.
ملاحظة: تم قياس الوزن الرطب للحبيبة عن طريق طرح وزن أنبوب طرد مركزي فارغ من وزن أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على بيليه الخلية. - أضف 1 مل من تعليق الخلية و 0.4-0.6 جم من الخرز الزجاجي 0.1 مم (انظر جدول المواد) في قارورة غطاء لولبي سعة 2 مل.
- كسر الخلايا لمدة 30 ثانية بواسطة مضرب خرزة (انظر جدول المواد). اترك الأنابيب لتبرد في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة وكرر دورة الكسر 5 مرات.
- بعد التحلل ، قم بطرد القوارير مركزيا عند 500 × g لمدة 10 s في درجة حرارة الغرفة. جمع supernatant مع ماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. اغسل الخرز ب 0.5 مل من 0.75 M K-phosphate buffer مرة واحدة ، ثم انقلها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي.
- أضف Triton X-100 (2٪ w / v ، التركيز النهائي) إلى تعليق الخلية المحللة واحتضن على شاكر هزاز (40 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح المحلول متجانسا (~ 20 دقيقة).
- جهاز طرد مركزي الأنابيب عند 17,210 جم لمدة 20 دقيقة لإزالة الخلايا السليمة وحطام الخلايا الكبيرة. قم بتخزين المادة الفائقة بدون طبقة مذيلات تريتون العلوية في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 ساعة.
ملاحظة: يحتوي supernatant على طبقتين منفصلتين. تحتوي طبقة Triton X العلوية الكارهة للماء على بروتينات ملزمة للكلوروفيل و phycobilisomess كارهة للماء على شكل قضيب6. تحتوي الطبقة المائية السفلية على PBS قابل للذوبان في الماء.
3. إعداد المخازن المؤقتة لتدرج السكروز وعزل PBS
- اصنع أربعة تركيزات من السكروز (2.0 م و 1.0 م و 0.75 م و 0.5 م) في 0.75 م ك-فوسفات العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.
ملاحظة: يقترح استخدام المخزن المؤقت K-phosphate 1.5 M عند الرقم الهيدروجيني 7 لإعداد تدرج السكروز لأن إضافة السكروز يخفف من تركيز المخزن المؤقت K-phosphate. بعد إذابة السكروز بالكامل ، أضف ddH2O لضبط التركيز على 0.75 M ، الرقم الهيدروجيني 7. - ضع 2.8 مل من المخزن المؤقت للسكروز 2.0 مل في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 40 مل وتراكب مع ثلاث طبقات من محاليل السكروز (8 مل من 1.0 م ؛ 12 مل من 0.75 م و 11 مل من 0.5 م لأنبوب الطرد المركزي 40 مل) ، وأخيرا PBS الذي يحتوي على الكسر الفائق (3.0 مل) (الشكل 1 أ).
ملاحظة: أضف محلول السكروز بعناية واسمح للسكروز بالسقوط ببطء شديد داخل الأنبوب. امسك طرف الماصة فوق سطح المحلول مباشرة في الأنبوب أثناء تحميل المحلول. يمكن ملاحظة طبقات السكروز عندما يتم وضعها ببطء. - جهاز طرد مركزي التدرجات الناتجة عند 125,800 × جم ل ~ 16h-20 h عند 25 °C.ملاحظة: مطلوب جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) لهذه الخطوة.
- عند الطرد المركزي الفائق ، قم بتكثيف PBS المجزأة والبروتينات الفيزيائية بين الطبقات. لوحظت النطاقات الزرقاء في Syn6803 (النطاقات الأرجوانية الموضحة في JSC-1) في السطوح البينية (الشكل 1D).
- جمع الكسور ببطء مع ماصة من أعلى تدرجات السكروز. قم بإزالة السكروز عن طريق التركيز المتكرر (3500 × جم لمدة 20 دقيقة) وتخفيف الكسور باستخدام 0.75 M K-phosphate buffer في وحدات مرشح الطرد المركزي الغشائية (قطع الوزن الجزيئي 10 K ، انظر جدول المواد).
4. قياس التألق PBS عند 77K
ملاحظة: يستخدم مقياس الفلورة المجهز بحاوية نيتروجين سائل (انظر جدول المواد) لقياس أطياف التألق عند 77 كلفن.
- تمييع عينة PBS المركزة مع 0.75 M K-phosphate العازلة للحصول على 500 ميكرولتر على الأقل.
ملاحظة: كانت تركيزات الفيكوسيانين في العينات ~ 4.2 ميكروغرام مل-1 استنادا إلى الصيغة: (OD615 0.474 x OD652)/5.34 [ملغم/مل]34. - أضف 500 ميكرولتر من عينة PBS إلى أنبوب زجاجي شفاف وقم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل حتى يتم تجميده بالكامل. حرك الأنبوب المجمد إلى حاوية ديوار شفافة (انظر جدول المواد) مملوءة مسبقا بالنيتروجين السائل.
ملاحظة: القطر الداخلي للأنبوب الزجاجي هو 3 مم في هذا البروتوكول. تم استخدام أنابيب زجاجية رقيقة لتقليل إعادة امتصاص انبعاث الطول الموجي القصير في العينة. - اختر الأطوال الموجية للإثارة للفيكوريثرين والفيكوسيانين لتكون 550 نانومتر و 580 نانومتر ، على التوالي.
ملاحظة: تم تسجيل انبعاثات التألق من 560-800 نانومتر (لإثارة 550 نانومتر) أو 600-800 نانومتر (للإثارة 580 نانومتر).
5. تحليل SDS-PAGE ل PBS
- تبادل المخزن المؤقت عينات PBS المركزة في 0.75 M من K-phosphate مع 50 mM من Tris buffer (الرقم الهيدروجيني 8.0) في وحدات مرشح الطرد المركزي الغشائية (قطع الوزن الجزيئي 3K ، انظر جدول المواد).
- امزج 50 ميكرولتر من محلول PBS مع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل SDS 6x [300 mM Tris pH 6.8 ، 12٪ (w / v) كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 0.06٪ (w / v) Bromphenol blue ، 50٪ (v / v) Glycerol ، 6٪ (v / v) β-Mercaptoethanol] (انظر جدول المواد) في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق وحاضنة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارية.
- افصل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE (8٪ -20٪ (ث / v) هلام بولي أكريلاميد) واستمر في تلطيخ الزنك والكوماسي. وقد تم وصف الإجراء التفصيلي في المرجع 8.
- لتلطيخ الزنك ، احتضن الجل في محلول ZnSO4 50 mM لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الجل بالماء المقطر ، وتصور التألق الناجم عن الزنك تحت الأشعة فوق البنفسجية (312 نانومتر).
- بالنسبة لتلطيخ Coomassie الأزرق ، قم باحتضان الجل في مخزن تلطيخ Coomassie Blue [0.25٪ (w / v) من Coomassie R-250 ، 10٪ (v / v) من حمض الخليك ، 50٪ (v / v) من الميثانول ، انظر جدول المواد] لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجل بالماء المقطر مرتين لإزالة المخزن المؤقت المتبقي للتلطيخ واحتضان الجل باستخدام المخزن المؤقت لإزالة البقع [10٪ (v / v) حمض الخليك ، 30٪ (v / v) الميثانول] على شاكر هزاز (40 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. تصور الجل المبطن بالكامل باستخدام كاميرا رقمية أو ماسح ضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمت زراعة خلايا Syn6803 و JSC-1 في قوارير مخروطية مع تحريك مستمر في وسط B-HEPES عند 30 درجة مئوية ، تحت ضوء أبيض LED (فوتونات 50 ميكرومول m-2s-1) في غرفة نمو مليئة ب 1٪ (v / v) CO2. في مرحلة النمو الأسي (OD750 = ~ 0.5) ، تم زرع الخلايا في وسط جديد مع كثافة بصرية نهائية OD750 = ~ 0.2. بعد الوصول إلى مرحلة النمو الأسي المتأخر (OD750 = 0.6-0.8) ، تم جمع الثقافات وطردها مركزيا (10000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة). تم التخلص من المادة الفائقة ، وتم تخزين كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية حتى تتوفر الخطوة التالية.
لكسر الخلايا ، تم إذابة الخلايا أولا في درجة حرارة الغرفة. وتعطلت الخلايا بسبب ضرب الخرز بخرز زجاجي عيار 0.1 ملم داخل المخزن المؤقت 0.75 مليون كيسفولفات. يظهر التحلل الكامل للخلايا الأعلى باللون الأزرق الداكن والأخضر قبل الطرد المركزي (الشكل 1B). بعد الذوبان بواسطة Triton X-100 والطرد المركزي لإزالة الأغشية غير القابلة للذوبان وحطام الخلايا ، تم تحميل المادة الفائقة على الجزء العلوي من محلول تدرج السكروز في أنبوب طرد مركزي سعة 40 مل (الشكل 1C). بعد 18 ساعة من الطرد المركزي ، انتقل PBS السليم إلى مركز التدرج كنطاق أزرق واضح ل Syn6803 ونطاق أرجواني ل JSC-1. ينتج الاختلاف في لونها عن التراكيب المختلفة ل PBS في Syn6803 و JSC-1. يحمل PBS من Syn6803 الفيكوسيانين35 ، في حين أن PBS من JSC-1 يحمل الفيكوسيانين والفيكوريثرين7. تظهر نتيجة الفصل بين كثافة السكروز والتدرج ل PBS المعزول عدة أجزاء من البروتينات الفيزيائية المنفصلة ، ويمثل الكسر الأدنى PBS السليم (الشكل 1D).
تتم مقارنة أطياف الامتصاص للكسور المختلفة من PBS المعزولة من JSC-1 و Syn6803 في الشكل 2A. وقد ورد وصف للإجراء التفصيلي لأطياف الامتصاص في المادتين 7 و8. أطياف الامتصاص من PBS المنفصلة و PBS السليمة من JSC-1 و Syn6803 لها نفس الذروة عند 622 نانومتر ، المقابلة للفيكوسيانين. وتم العثور على ذروة امتصاص الفيكوريثرين عند 571 نانومتر في كل من PBS المنفصل و PBS السليم من JSC-1. يظهر Allophycocyanin ذروة طفيفة مع كتف عند 670 نانومتر في كسور PBS السليمة من JSC-1 و Syn6803. تشير الاختلافات الطيفية إلى أن نسبة القضيب (الفيكوسيانين) إلى النواة (allophycocyanin) أعلى في PBS المنفصل منها في جزء PBS السليم ، حيث تم تحديد الخصائص الطيفية للبروتينات الفيزيائية سابقا5. نظرا لأن PBS المنفصلة وكسور PBS السليمة تظهران أطياف امتصاص متشابهة وميزات انبعاث الفلورسنت في درجة حرارة الغرفة ، فقد تم استخدام التحليل الطيفي الفلوري 77K لتحليل الكسور المختلفة المعزولة من تدرج السكروز. تم إثارة أطياف انبعاثات الفلورسنت 77K من PBS المنفصلة وكسور PBS السليمة بمقدار 580 نانومتر. أطياف الانبعاثات من PBS المنفصلة لها ذروة قوية واحدة عند ~ 650 نانومتر في Syn6803 و JSC-1 ، مما يمثل الانبعاثات من الفيكوسيانين (الشكل 2B). تظهر أطياف الانبعاثات الفلورية ل PBS السليمة قمتين قصوى للانبعاثات الفلورية: الذروة الضعيفة عند 651 نانومتر والقوية عند 684 نانومتر ، مما يكشف عن أن الطاقة التي يحصدها الفيكوسيانين تم نقلها بكفاءة إلى الوفيكوسيانين والباعثات الطرفية (ApcD و ApcE) في النواة9 (الشكل 2C). توضح هذه الميزات أن أدنى الكسور في تدرج السكروز تحتوي على PBS سليم.
تم فصل PBS المنفصل و PBS السليم بواسطة SDS-PAGE على هلام التدرج الخطي SDS polyacrylamide بنسبة 8٪ -20٪ (w / v). كانت الوحدات الفرعية α β من الفيكوسيانين والألوفيكوسيانين مرئية على الجل دون تلطيخ (الشكل 3A). تم تلطيخ الجل لاحقا ب 10 mM ZnSO4 لمدة 10 دقائق. وقد لوحظت البروتينات الفيزيائية المحتوية على الكروموفور عن طريق تلطيخ الزنك أثناء تشعيع الأشعة فوق البنفسجية8. الوحدات الفرعية للبروتين Phycobiliprotein (14-21 kDa) هي الفلورسنت بقوة ، وأظهر ApcE (السهم) تألقا ضعيفا (الشكل 3B). علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ Coomassie Blue تكوين البروتين المختلف بين كسور PBS المنفصلة وكسور PBS السليمة (الشكل 3C). تحتوي الكسور العليا على بروتينات أخرى غير PBS قابلة للذوبان في الماء حيث يتم تلطيخ المزيد من البروتينات أكثر من كسور PBS السليمة. يظهر PBS السليم في Syn6803 نطاقا بارزا من ApcE (سهم) يفتقر إلى كسور PBS المنفصلة (الشكل 3C).
تعد نسبة الحجم بين مستخلص PBS وتدرج السكروز أمرا بالغ الأهمية للحصول على نطاقات حادة في تدرج السكروز بعد الطرد المركزي الفائق. النسبة المقترحة من مستخلصات PBS القابلة للذوبان إلى محلول تدرج السكروز هي 1:10. استنادا إلى الخبرة السابقة ، فإن جعل تدرج السكروز في أنابيب الطرد المركزي 40 مل يظهر دقة أعلى من تدرج السكروز المصنوع في أنابيب 13 مل. ينتشر تدرج السكروز المتقطع بمرور الوقت بسبب الاهتزاز على مقاعد البدلاء. لذلك ، يمكن أن يكون أنبوب الطرد المركزي 13 مل خيارا جيدا للتعامل مع الكثير من العينات في وقت واحد. لإثبات ذلك ، تم تحضير تدرجات السكروز في أنابيب الطرد المركزي 13 مل بنسب 1: 3 و 1: 10 بين المستخلصات الخام من Syn6803 أو JSC-1 إلى محلول تدرج السكروز (الشكل 4A). بعد الطرد المركزي الفائق، يعرض تدرج السكروز المعد بنسبة 1:3 نطاقات أوسع من التدرج الناتج عن النسبة 1:10 (الشكل 4B). تحتوي الكسور الدنيا من كل تدرج على PBS سليم ، وهو ما يؤكده التحليل الطيفي للانبعاثات الفلورية 77K.
الشكل 1: تعطيل خلايا Syn6803 و JSC-1 والطرد المركزي الفائق لتدرج السكروز. (أ) رسم تخطيطي لإعداد تدرج السكروز المتوقف في أنبوب طرد مركزي سعة 40 مل. (ب) تم ملء قوارير الغطاء اللولبي ب 0.4 غرام من الخرز الزجاجي و 1 مل من تعليق الخلايا من Syn6803 أو JSC-1 ، ثم تم قص الخلايا بواسطة مضرب خرزة. (ج) تم وضع طبقة من مستخلص تريتون X-100 القابل للذوبان في طبقات أعلى تدرج كثافة السكروز. (د) بعد الطرد المركزي لمدة 18 ساعة، تم تصور كسور PBS كنطاقات زرقاء واضحة في التدرج في Syn6803 وكنطاقات أرجوانية في JSC-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: التوصيف الطيفي لكسور مختلفة من تدرجات السكروز. (أ) أطياف الامتصاص ل PBS المنفصلة وكسور PBS السليمة من JSC-1 و Syn6803. تم قياس أطياف الانبعاث الفلوري عند 77 كلفن باستخدام الطول الموجي للإثارة عند 580 نانومتر ل (B) كسور PBS المنفصلة و (C) كسور PBS السليمة من Syn6803 و JSC-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل SDS-PAGE ل PBS المعزول من تدرجات السكروز. تم تحديد كسور PBS المنفصلة والسليمة كميا (20 ميكروغرام من البروتين لكل حارة) وتحميلها على هلام بولي أكريلاميد متدرج بنسبة 8٪ -20٪ (w / v). بعد الرحلان الكهربائي الهلامي ، تم تصور الجل عن طريق تلطيخ الزنك وتلطيخ Coomassie Blue ، في وقت لاحق. (أ) لون البروتينات الفيزيائية مرئي على الجل دون تلطيخ. (ب) يظهر الجل الملطخ بالزنك تألق البروتينات الفيزيائية. (ج) يظهر الجل الملطخ ب Coomassie Blue البروتينات الفيزيائية والبروتينات الأخرى. تشير الأسهم إلى مواقع ApcE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تدرج السكروز المصنوع في أنابيب طرد مركزي سعة 13 مل. يتم وضع علامة على النسب بين المستخلص الخام ومحلول تدرج السكروز في الجزء العلوي من الصور. (أ) تم وضع طبقة من المستخلصات الذائبة Triton X-100 من Syn6803 و JSC-1 فوق تدرجات كثافة السكروز بنسب مختلفة من المستخلصات القابلة للذوبان إلى محلول تدرج السكروز. (ب) بعد الطرد المركزي لمدة 18 ساعة، لوحظت كسور PBS في Syn6803 و JSC-1 في تدرجات السكروز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقياسية لعزل PBS سليم في نوعين من البكتيريا الزرقاء، النموذج أحادي الخلية Syn6803، والخيطي غير النموذجي JSC-1. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي تجانس الخلايا والطرد المركزي الفائق على تدرج الكثافة المتقطعة للسكروز. بشكل عام ، يكون اضطراب الخلايا الخيطية أكثر تعقيدا من الخلايا أحادية الخلية. كانت زيادة كمية المواد الأولية (الوزن الرطب لحبيبات الخلية) وتكرار ضرب الخرز مفيدة لزيادة غلة PBS من خلايا البكتيريا الزرقاء الخيطية. بالنسبة للبكتيريا الزرقاء الخيطية ، JSC-1 ، تم استخدام ثلاثة أضعاف الخلايا من الخلية أحادية الخلية ، Syn6803. بالإضافة إلى ذلك ، لكسر البكتيريا الزرقاء الخيطية تماما ، فإنه يتطلب ضرب الخرز مرات أكثر من البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية لمراقبة اللون الأرجواني المزرق الداكن في المخزن المؤقت للاستخراج.
لا يقترح أن تتجاوز مدة ضرب الخرز 30 ثانية حيث يتم تسخين العينات خلال كل دورة ضرب الخرز. يوصى بتبريد الأنابيب في درجة حرارة الغرفة على مقعد (أو في حمام مائي) بين كل دورة ، حيث يتم فصل PBS السليم بسهولة عند درجة حرارة منخفضة25. لذلك ، يقترح تنفيذ كل إجراء في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة. وصفت العديد من المقالات البحثية طرقا مختلفة لتعطيل الخلايا ، بما في ذلك مجانس الضغط العالي (French-Press) أو صوت صوتي6,8,20. يقترح مجانس مطحنة الخرز لأنه أرخص وأكثر أمانا وأسهل في التعامل معه وأسرع وأكثر سهولة وأكثر كفاءة في معالجة عينات متعددة في وقت واحد.
تظهر Phycobilisomes ثلاثة أشكال مختلفة ، hemidiscoidal ، على شكل حزمة ، وعلى شكل قضيب 5. تنتمي الفيكوبيليسومات السليمة المعزولة في الشكل 2 إلى الشكل الهيديسكويدي كما نوقش في المنشورات السابقة7،13،36. ومع ذلك ، يمكن أن يحتوي الجزء العلوي الذي يمثل PBS المنفصل أيضا على PBS على شكل قضيب. يقوم Syn6803 و JSC-1 بترميز رابط قضيب أساسي محدد CpcL ، مما يشير إلى وجود PBS على شكل قضيب بالإضافة إلى PBS القاتل للديديسكويد 6,37. تم تحديد PBS على شكل قضيب مباشرة في Syn6803 ولكن ليس في JSC-17,13,37. من ناحية أخرى ، تعيد JSC-1 تشكيل PBS الخاص بها عن طريق إجراء التأقلم اللوني من النوع الثالث في الضوء الأخضر / الأحمر والملاخ الضوئي للضوء الأحمر البعيد في الضوء الأحمر / الأحمر البعيد6,7. تشير كل هذه التنوعات إلى أنه قد تكون هناك أنواع أخرى من PBS في تدرجات السكروز ، بالإضافة إلى أدنى جزء PBS hemidiscoidal سليم. على سبيل المثال ، يوجد نوعان من PBS في نفس الوقت الذي يتأقلم فيه Synechococcus sp. PCC 7335 و JSC-1 مع الضوء الأحمر البعيد8,13. يقترح أن الشخص الذي يعزل PBS عن سلالة البكتيريا الزرقاء غير المميزة يجب أن يكون أكثر حذرا في تحليل كل جزء في تدرج السكروز لتحديد أي أنواع محتملة من PBS.
بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة رخيصة وبسيطة وسريعة لتعطيل الخلايا. وقد ثبت أيضا أن هذه الطريقة موثوقة لعزل PBS من البكتيريا الزرقاء المختلفة مع أنواع مختلفة من الخلايا وتركيبات PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصلحة متنافسة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون Technology Commons ، كلية علوم الحياة ، جامعة تايوان الوطنية على الاستخدام المريح لجهاز الطرد المركزي الفائق. تم إهداء سلالات البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803 و Leptolyngbya sp. JSC-1 من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان ، والدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، على التوالي. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (تايوان) (109-2636-B-002-013- و 110-2628-B-002-065-) ووزارة التعليم (تايوان) برنامج يوشان للباحثين الشباب (109V1102 و 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
