Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63419
Automatic Translation
1,2, 2,3, 3, 4, 1,5,6, 1,2,5,6,7
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Summary

AAV6'ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.

Abstract

Rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV), hem laboratuvarda hem de klinikte çeşitli sağlık koşullarını tedavi etmek için genetik materyal transferi için güvenli ve başarılı bir vektör olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, AAV kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorlar (NAbs), hem büyük hayvan deney modellerinde hem de insan popülasyonlarında gen tedavilerinin başarılı bir şekilde verilmesi için devam eden bir zorluk oluşturmaktadır. AAV'ye karşı konak bağışıklığı için ön tarama, AAV tabanlı gen tedavilerinin hem bir araştırma aracı hem de klinik olarak uygulanabilir bir terapötik ajan olarak etkinliğini sağlamak için gereklidir. Bu protokol, AAV serotip 6'ya (AAV6) karşı nötralize edici faktörleri tespit etmek için kolorimetrik bir in vitro testini açıklar. Test, alkali fosfataz (AP) muhabir geni kodlayan bir AAV ile kombinasyon halinde çözünmeyen ölçülebilir mor bir leke oluşturan NBT/BCIP alt tabakası arasındaki reaksiyonu kullanır.

Bu protokolde serum örnekleri AP'yi ifade eden bir AAV ile birleştirilir ve potansiyel nötralizasyon aktivitesinin gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edilir. Virüs serum karışımı daha sonra nötralize edilmemiş AAV'lerin viral transdüksiyonu için hücrelere eklenir. NBT/BCIP substratı eklenir ve viral transdüksiyon ve nötralize edici aktiviteye karşılık gelen kromojenik bir reaksiyona uğrar. Renkli alan oranı, nötralize edici titreler oluşturmak için özgür bir yazılım aracı kullanılarak nicelleştirilir. Bu test, renklenme ve viral konsantrasyon arasında güçlü bir pozitif korelasyon görüntüler. Rekombinant AAV6'nın uygulamadan önce ve sonra koyunlardan alınan serum örneklerinin değerlendirilmesi nötralize edici aktivitede çarpıcı bir artışa yol açtı (125 ila >10.000 kat artış). Test, 1:32.000 > serum seyreltmesinde nötralizasyon aktivitesini tespit etmek için yeterli hassasiyet gösterdi. Bu tahlil, NAB'leri AAV'lere karşı tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Introduction

Adeno ilişkili virüsler (AAV), gen tedavilerinin kardiyovasküler, pulmoner, dolaşım, oküler ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli sağlık durumları için deneme tedavilerine ulaştırılmasında vektör olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1,2,3,4,5. AAV vektörlerinin önde gelen gen tedavisi platformu olarak popülaritesi, pozitif güvenlik profili, uzun süreli transgene ekspresyasyonu ve dokuya özgü geniş kapsamlı tropizmlerinden kaynaklanmaktadır1,6. Hayvan çalışmalarındaki başarılı sonuçlar, etkinlik uç noktalarına başarıyla ulaşan elliden fazla AAV gen tedavisi klinik denemesinin ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi8 tarafından onaylanan ilk ticari olarak mevcut AAV gen tedavisi ilacının piyasaya sürülmesinin önünü açmıştır8. İlk başarıların ardından, AAV tercih edilen bir vektör olarak temel ve klinik araştırma sektörlerinde ilgi görmeye devam etti ve şu anda ABD ve Avrupa'da klinik kullanım için onaylanan tek in vivo gen tedavisi9. Bununla birlikte, AAV vektör kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorların (NAbs) varlığı hem klinik öncesi araştırmalara hem de klinik çalışmaların etkinliğine engel olmaya devam etmektedir. NAb'ler hem naif insan hem de hayvan popülasyonlarında bulunur ve bir AAV vektörün in vivo yönetimini takiben gen transdüksiyonu inhibe eder1. AAV seropozitliği çoğu gen tedavisi denemesi için bir dışlama kriteridir ve bu nedenle konak bağışıklığı için ön tarama hem laboratuvarda hem de klinikte çok önemlidir. AAV'ye karşı NAB'lerin varlığını tespit edebilecek bir test oluşturmak, herhangi bir AAV gen terapisi tabanlı araştırma projesinin boru hattında önemli bir adımdır. Bu rapor, çizgili kas (kalp ve iskelet kası)1,10,11,12'de etkili ve seçici transdüksiyon nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken AAV6'ya odaklanmıştır. Gen tedavisi kalbi hedeflemek için umut verici bir strateji olarak kabul edilir, çünkü invaziv açık kalp prosedürleri olmadan kalbi özellikle hedeflemek zordur.

Nötralize edici aktivite genellikle hücre bazlı in vitro veya in vivo transdüksiyon inhibisyon tahlili kullanılarak belirlenir. In vivo NAb tahlilleri genellikle serumun bir denekten (örneğin, insan veya büyük hayvan) farelere verilmesini, ardından muhabir geni olan bir AAV'nin ve ardından muhabir geninin veya ilgili antijenin ekspresyozunun testini içerir. İn vitro tahliller, bir muhabir genini ifade eden rekombinant AAV (rAAV) ile seri seyreltmelerde insan veya büyük bir hayvandan serum veya plazma inkübasyon yaparak NAb titrlerini belirler. Hücreler serum/virüs karışımı ile enfekte edilir ve muhabir gen ekspresyonlarının ne ölçüde inhibe edildiği kontrollerle karşılaştırıldığında değerlendirilir. In vitro tahliller, in vivo testlere kıyasla nispeten daha düşük maliyeti, testlerdeki hızlılığı ve standardizasyon ve doğrulama için daha fazla kapasite13,14 nedeniyle NAb taraması için yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo tahlillerin genellikle daha fazla hassasiyete sahip olduğu bildirilmektedir15,16, ancak aynı iddia in vitro tahlillerle ilgili olarak da ortaya atıldı14,17.

Bugüne kadar, in vitro NAb tahlilleri nötralizasyonunu tespit etmek için muhabir geni olarak esas olarak lüminesans (luciferaz) kullanmıştır. Işık tabanlı bir yöntemin birçok bağlamda değeri olsa da, kolorimetrik/kromojenik bir NAb tahlili bazı durumlarda avantajlı olabilir. Nötralizasyonunu değerlendirmek için yapılan kolorimetrik tahliller influenza ve adenovirüs gibi diğer virüsler için başarıyla sunulmuştir18,19. Çekicilikleri basitliklerinden, daha düşük maliyetlerinden ve sadece günlük laboratuvar cihazları ve araçları için gereksinimden kaynaklanmaktadır20. Lüminesans tabanlı bir muhabir geni kullanan NAb tahlilleri, yüksek maliyetli substrat kitleri, bir luminometre ve analiz için ilgili yazılım gerektirir21. Bu kolorimetrik test, sadece hafif bir mikroskop ve çok ucuz bir substrat gerektirme avantajına sahiptir. Kolorimetrik ve parlak testlere karşı duyarlılığının raporlanması çelişkili sonuçlar verdi. Bir çalışma, lüminesans tabanlı ELISA testlerinin daha fazla hassasiyet ve kolorimetrik testlerle karşılaştırılabilir tekrarlanabilirlik gösterdiği öne sürsürürd22, bir diğeri ise daha fazla hassasiyet sağlamak için kolorimetrik tabanlı ELISA tahlilleri buldu23. Burada, alkali fosfataz (AP) muhabir geni ile nitro mavisi tetrazolium /5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (NBT/BCIP) substratı arasındaki kromojenik reaksiyonu kullanan AAV'ye karşı bir in vitro NAb tahlili için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu adım adım protokol, AAV24'e karşı nötralize edici aktiviteyi tespit etmek için hPLAP (insan plasntal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP) kullanan önceki bir rapora dayanarak geliştirilmiştir. Bu test uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolaydır ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktif gerektirir. Ayrıca, bu tahlilin basitliği, farklı hücre, doku veya viral serotip türlerinde geniş uygulamalar için optimize edilebilir potansiyel verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan bakımı ve deneyinin tüm yönleri Florey Nörobilim ve Ruh Sağlığı Enstitüsü yönergeleri ve Avustralya Hayvanların Bakımı ve Kullanımı için Referans25'i takiben Bilimsel Amaçlar için Kodu'nu izleyerek gerçekleştirildi. Çalışmada 1,5-3 yaşındaki Merinos koyunları kullanılmıştır. Şekil 1'de test protokolüne şematik bir genel bakış sağlanmaktadır.

Figure 1
Şekil 1: NAb tahlil protokolünün şematik diyagramı. (A) Üç günlük protokolde yer alan birincil adımları gösteren NAb tahlilinin görsel gösterimi. Kısaca, hücreler bir gecede yetiştirilir ve kaplanr. Ertesi gün serumun seri seyreltmeleri hazırlanır, AAV ile inkübe edilir ve daha sonra bir gecede hücrelerle inkübe edilir. Ertesi gün, hücreler sabitlenir, yıkanır, inkübe edilir, substratla birleştirilir ve tekrar inkübe edilir, ardından görüntüleme ve nicelik. (B) Minimum sinyal kontrolü (komple AAV inhibisyonu), maksimum sinyal kontrolü (inhibisyon yok) ve ~%50 sinyal inhibisyonu olan bir yumurta serumu örneğinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. İlk hazırlık

  1. Koyunlarda değerlendirme için: 8 mL serum ayırıcı pıhtı aktivatör tüplerinde kan toplayın (bkz. Malzeme Tablosu), kan örneğini 20-30 dakika oda sıcaklığında (RT) bırakın ve daha sonra 15 dakika boyunca 2.100 x g'da aşağı çevirin. Tüplerin üst kısmında oluşan açık süpernatant serumdur. Berrak sulu fazı mikrosantrifüj tüplerine aliquot ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: -80 °C'deki serum ~5 yıl boyunca sabit kalır. Şah damarından 16 G iğne (ucu kesilmiş) ve bilinçli hayvanlardan şırınga kullanılarak kan toplandı.
  2. Isı fetal sığır serumu (FBS) 30 dakika boyunca 56 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek inaktive ve aralıklı olarak döner. Hassasiyet için, eşdeğer miktarda su içeren ikinci bir şişeye bir termometre yerleştirin ve FBS şişesiyle aynı anda ısı banyosuna ekleyin. Termometre 56 °C'ye ulaştığında zamanlamaya başlayın.
  3. Hücre kültürü kaputunda gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar için uygun aseptik teknik ve hücre kültürü uygulaması 26,27.'yi uygulayın. Kullanmadan önce tüm nesnelere ve davlumbaz üzerine% 70 etanol püskürtün ve tamamlandığında% 1 sodyum hipoklorit ile temizleyin.
  4. Yüksek glikoz (%4,5 g/L) DMEM (%89) ile ısı inaktive FBS (%10) ve Penisilin Streptomisin 'i (%1) birleştirerek Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) 'ini tamamlayın. Steril vakum filtrasyon sistemi (0,22 μm gözenek boyutu, poliethersülfon membran) kullanarak birleştirin ve filtreleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de folyoya sarılı komple DMEM depolayın.
  5. Referans28'de açıklandığı gibi HT1080 hücreleri (bkz. Malzeme Tablosu) ve 75 cm2 karelik bir şişede geçiş oluşturun. Birden fazla dondurulmuş hücre stokları oluşturun. Daha fazla pasaj test sonuçlarını etkileyebileceğinden, 20 pasajdan sonra hücreleri kullanmayın.

2. Gün 1 - Hücrelerin kaplat

  1. Ht1080 hücrelerini ~%80 izdiah süresine ulaştıklarında geçiş yap.
  2. Bir su banyosunda önceden ısınan komple DMEM (adım 1.4), %0.05 tripsin-EDTA ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C arasında. Bir aspirasyon sistemi kullanarak geçişli hücrelerden büyüme ortamını çıkarın.
    NOT: Bu protokoldeki tüm aspirasyon, steril 5 mL serolojik pipete bağlı bir tüpe sahip bir vakum sistemi kullanır.
  3. Hücreleri şişeden ayırmak için önceden ısıtılmış 10 mL (37 °C) 1x PBS ve trypsinize hücrelerini 4 mL önceden ısıtılmış 0,05% trypsin-EDTA'da 3-4 dakika yıkayın.
  4. Önceden ısıtılmış 6 mL komple DMEM ekleyerek tripsin inaktive edin ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe pipetlayın. Hemositometre ve trippan mavi dışlama yöntemi29 kullanarak canlı hücrelerin sayısını ve konsantrasyonu hesaplayın.
  5. Önceden ısıtılmış komple DMEM'de hücreleri 1 x 105 hücre/mL konsantrasyonda seyreltin. Tohum 100 μL hücre /kuyu net 96 kuyu düz tabanlı plakalar içine (kuyu başına 1 x 104 hücre). Plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın, 16-22 saat boyunca gece boyunca% 5 karbondioksit (CO2).

3. Gün 2 - Hücreleri enfekte etme

  1. Plakayı/plakaları inkübatörden çıkarın ve hücrelerin kuyulara eşit şekilde dağıldığını ve izdiahın ~% 50 olduğunu doğrulamak için hafif bir mikroskop kullanın. Hücreler %45-%55 izdiah aralığında değilse, '1. gün' protokolünü tekrarlayın ve ilk hücre konsantrasyonu buna göre ayarlayın.
  2. Seyreltici olarak önceden ısıtılmış komple DMEM kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde ilgi çekici serum örneklerinin seri seyreltmelerini oluşturun. Tablo 1 , üç taraflı numuneler için seyreltme kaskadının neslini göstermektedir.
    1. Tahlilleri üç taraflı olarak gerçekleştirmek için, bir virüs stok çözeltisini 1x PBS'de seyrelterek 7,5 x 106 vektör genomu (vg)/μL AAV6-hPLAP çalışma çözeltisi hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 264 μL serum/ortam seyreltme içeren her tüpe 7,5 x 106 vg/μL virüs çalışma çözeltisinin 66 μL'sini ekleyin (toplam hacim/seyreltmenin 330 μL'si, bkz. Tablo 1).
      NOT: Bu, mükemmel kültür koşulları gerektirmeyen sağlam bir testtir. Bununla birlikte, her test çalışmasının doğru bir şekilde nicel olması ve güvenilir olduğundan emin olmak için aşağıdakileri dahil etmek gerekir: (1) yalnızca bir virüs ve ortam kontrolü, (2) yalnızca bir ortam kontrolü ve (3) aynı deneysel koşullar altında tüm plakalarda bir NAb pozitif kontrol örneği. Açıklanan hacim (330 μL), serum ve virüs karışımının +%10'u kadar üç taraflı örnekleri oluşturmaktadır. Nötralize edici aktivitenin doğru tespiti için çoğaltmaların gerçekleştirilmesi şiddetle tavsiye edilir.
  3. Pipetleme ile virüs/serum seyreltmelerini karıştırın ve virüs/serum karışımlarını içeren tüpleri 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin, 30 dakika boyunca% 5 CO2 potansiyel nötralizasyonun gerçekleşmesini sağlamak için.
  4. Pipet 100 μL virüs/serum karışımı her kuyuya 96 kuyu plakasında her bir kuyuya 1 x 104 hücre/kuyu içeren her seyreltme için.
    NOT: Bu, her kuyuda 15k virüs / hücre çokluğu enfeksiyon (MOI) nihai viral konsantrasyonu üretecektir. Tablo 2 , numuneleri 1/512 seyreltme için değerlendirmek için örnek bir 96 kuyu örnek plaka düzeni sağlar.
  5. Hücre, serum ve AAV-hPLAP içeren 96 kuyu plakasını folyoya sarın ve AAV'nin hücrelere girmesine izin vermek için 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin, 16-24 saat boyunca bir gecede% 5 CO2 .
Seyreltme basamaklı etiketi Seyreltme 3 x numune (240 μL) + %10 tampon hacmi (24 μL) Serum oranı:medya
Seyreltme 1 (D1) 1/2 264 μL serum 264 μL ortam 50:50
Seyreltme 2 (D2) 1/4 264 μL D1 + 264 μL ortam 25:75
Seyreltme 3 (D3) 1/8 264 μL D2 +264μL ortam 12.5:87.5
Seyreltme 4 (D4) 1/16 264 μL D3 +264 μL ortam 6.25:93.75
Seyreltme 5 (D5) 1/32 264 μL D4 +264 μL ortam 3.13:96.87
Seyreltme 6 (D6) 1/64 264 μL D5 +264 μL ortam 1.56:98.44
Seyreltme 7 (D7) 1/128 264 μL D5 +264 μL ortam 0.78:99.22
Seyreltme 8 (D8) 1/256 264 μL D5 +264 μL ortam 0.39:99.61
Seyreltme 9 (D9) 1/512 264 μL D7 + 264 μL ortam 0.2:99.8
Seyreltme 10 (D10) 1/2048 132 μL D8 + 396 μL ortam 0.05:99.95
Seyreltme 11 (D11) 1/8192 132 μL D9 + 396 μL ortam 0.01:99.99
Seyreltme 12 (D12) 1/32768 132 μL D10 + 396 μL ortam 0.003:99.997

Tablo 1: Üç taraflı serumun seri seyreltmelerini oluşturmak için serum ve seyreltici hacimleri gereklidir.

Serum örneği #1 Serum örneği #2 Serum örneği #3 Mono AB (mAB), kontroller ve ekstra numuneler
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 50 ng MAb 50 ng MAb 50 ng MAb
B 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 5 ng MAb 5 ng MAb 5 ng MAb
C 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 0.5 ng MAb 0.5 ng MAb 0.5 ng MAb
D 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 MO (-C) MO (-C) MO (-C)
E 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 VO (+C) VO (+C) VO (+C)
F 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 Örnek #1 1/512 Örnek #1 1/512 Örnek #1 1/512
G 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Örnek #2 1/512 Örnek #2 1/512 Örnek #2 1/512
H 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 Örnek #3 1/512 Örnek #3 1/512 Örnek #3 1/512

Tablo 2: 1/2 ile 1/512 arasında değişen seyreltmelerde naif serum örneklerini değerlendirmek için örnek 96 kuyu plakası düzeni. AAV NAbs (yönetim sonrası numuneler) için pozitif olduğu bilinen bir numunenin değerlendirilmesi veya daha yüksek bir titrenin gerekli olması durumunda daha yüksek seyreltmeler teste dahil edilir. MO (-C): Yalnızca ortam kontrolü. VO (+C): Virüs ve medya yalnızca kontrol eder. mAb: AAV'ye karşı monoklonal antikor (NAb pozitif kontrol).

4. Gün 3 - Hücrelere sabitleme ve alt tabaka ekleme

  1. 1x PBS ila 37 °C (~25 mL/96-well plaka) aliquot'u önceden ısıtın. PBS (~25 mL/96 kuyu plakası) ve çift damıtılmış H2O (DDW, ~25 mL/96 kuyu plakası) ile 4 °C arasında soğuk ayrı aliquots. BCIP/NBT peletini (bkz. Malzeme Tablosu) 10 mL DDW'de 50 mL konik santrifüj tüpünde girdapla çözün (2 x 96 kuyu plakası için 10 mL yeterlidir).
  2. Emiş bazlı bir aspirasyon sistemine veya duman kaput vakumuna bağlı serolojik bir pipet veya benzeri bir pipet kullanarak 96 kuyu plakasının kuyularından medyayı epire edin. Serolojik pipet ucunu yavaşça kuyuya yerleştirin ve yapışan hücreleri bozmamak için dikkatli davranarak ortamı çıkarın.
    1. Pipet kullanarak her kuyuya 50 μL RT %4 PFA ekleyin. Plakayı folyoya sarın ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika RT'de bırakın.
      DİkKAT: Paraformaldehit (PFA) olası bir kanserojendir ve cilt veya göz teması veya solumadan toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanın yanı sıra yüz maskesi ile duman kaputunda sapın. PBS'de seyreltilmiş taze% 4 PFA yapın (96 kuyu plakası başına ~ 7 mL gereklidir).
  3. Hücreleri 200 μL RT 1x PBS ile yıkayın ve aspire edin. Bu adımı iki kez yineleyin.
    NOT: Çok kanallı pipet pipet, pipetleme adımları için verimli bir seçenektir.
  4. Pipet 200 μL önceden ısıtılmış PBS her kuyuya, plakayı folyoya sarın ve endojen alkali fosfataz aktivitesini denature etmek için 90 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın30.
  5. Kuyuları epire edin ve hücreleri 200 μL soğuk (4 °C) PBS ile yıkayın. Tekrar aspire edin, 200 μl soğuk DDW'de yıkayın ve tekrar aspire edin.
  6. Çözünmüş BCIP/NBT'nin pipet 50 μL'si (adım 4.1'de hazırlanmıştır) her kuyuya.
  7. Plakayı folyoya sarın ve RT'de 2-24 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Çalıştırmalar arasındaki kuluçka süresiyle tutarlı olun; zaman esnekliği, kullanıcıların kuyuları 3.
  8. Hafif bir mikroskop kamerası kullanarak, 4x objektif lens kullanarak her kuyunun fotoğraflarını çekerek, aynı pozlama, beyaz dengeleme ve ışık ayarlarının gerçekleştirilen tüm tahliller için tutarlı bir şekilde kullanılmasını sağlayın.
    1. Her birini aynı şekilde konumlandırın ve kuyunun kenarlarının fotoğraflarda görünmemesini sağlayın. Fotoğrafları TIF biçiminde veya benzer bir biçimde kaydedin.
      NOT: Belirli ayarlar mikroskoplar arasında değişir, ancak arka plan aydınlatması kuyular boyunca yüksek ve tutarlıysa nicelik en etkili olacaktır (Şekil 1B).

5. ImageJ kullanarak nötralize etme etkinliğini belirlemek için nicellik

  1. Serbestçe kullanılabilen "ImageJ" yazılımını indirip yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Dosya > Aç'ı seçerek ImageJ'de analiz edilecek görüntüyü açın (Şekil 2).
  3. Renkli görüntüler kullanıyorsanız, Görüntü > Tür > 8 bit'i seçerek gri tonlamalı görünüme dönüştürün.
  4. Görüntü > > Eşiğini Ayarla'ya tıklayın. Tüm renkli alanlar kırmızı renklendirilene kadar eşiği ayarlayın, ancak arka plan renklendirilmez. NBT/BCIP'yi ekledikten sonra, renkli ürün hPLAP'yi ifade eden hücrelerin etrafındaki alana birikir.
    NOT: Aynı plakada yakalanan tüm görüntüler için aynı eşik ayarının kullanılması önerilir.
  5. Ölçümleri > Ayarla'yı analiz et'e tıklayın ve Alan, Eşikle Sınırla, Alan Kesir ve Etiket Göster onay kutularını işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın.
  6. Belirli bir kuyunun sinyal okumasını (renklendirme yüzdesi) belirlemek için Ölçü > Analiz Et'i tıklatın. Açılır pencerenin 'Alan Yüzdesi' sütunu sinyal okumasını görüntüler.
  7. Tüm örnek çoğaltmaları için nicelik gerçekleştirin. Kirlenmiş kuyuları, düzensiz hücre dağılımını gösteren kuyuları veya hücre yoğunluğu veya aydınlatmasında değişen kuyuları hariç tutun.
    NOT: Hariç tutma için dikkate alınması gereken kuyu örnekleri için Ek Şekil 1'e bakın. Tipik olarak, 3-4 kuyu 96 kuyu plakasından hariç tutulması gerekebilir. Şekil 2 , ImageJ kullanarak nicellik işleminin görsel bir gösterimini sağlar.

Figure 2
Şekil 2: ImageJ yazılımını kullanarak yüzde renklendirmeyi belirleme adımları. (A) Analiz edilecek görüntüyü ImageJ yazılımı ile açın. (B) Görüntüyü 8 bit gri tonlamalı olarak dönüştürün. (C) Eşik penceresini açın. (D) Tüm renkli alanların kapsanması için maksimum eşiği ayarlayın, ancak arka plan alanı örtülmez (bu eşik tüm plaka boyunca tutarlı olmalıdır). (E) 'Analiz Et' dropbox'ını seçin, 'Ölçümleri ayarla' ve 'Alan', 'Alan fraksiyonu', 'Eşiği sınırla' ve 'Ekran etiketi'ni işaretleyin ve 'Tamam'a tıklayın. (F) Kapalı alanı ölçmek için 'Ölçü'ye tıklayın. % alanı, renkli görüntünün oranını gösterir. Bu daha sonra TI50 titresini belirlemek için kontrol örnekleriyle birlikte kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Transdüksiyon İnhibisyonunun (TI50) Titerinin Belirlenmesi

  1. Aşağıdakiler için çoğaltmalardan ortalama okuma (adım 5'te açıklanan adımları kullanarak) belirleyin: (1) Yalnızca ortam denetimi (temel sinyal okuma). (2) Virüs + sadece medya kontrolü (maksimum sinyal okuma). (3) Virüs + serum örnekleri ilgi çekici.
  2. Aşağıdaki formülü kullanarak inhibisyon yüzdesini hesaplayın:
    100 - [(Test numunesi sinyal okuma (virüs + serum ilgi örneği) - taban çizgisi sinyal okuma (yalnızca medya kontrolü)) / (maksimum sinyal okuma (yalnızca medya ve virüs) - temel sinyal okuma) x 100] = % Transdüksiyon inhibisyonu13.
  3. Formülü 6.2'de kullanarak tüm numuneler için her seyreltmenin tüm çoğaltmalarından % transdüksiyon inhibisyonunu hesaplayın. Tüm numuneler ve kontroller için her seyreltme için teknik çoğaltmalar arasındaki ortalama transdüksiyon inhibisyonunu belirleyin.
  4. HPLAP aktivitesinin % 50 veya daha fazla transdüksiyon inhibisyonunu veren numunenin en düşük seyreltmesini belirleyerek bir ilgi örneğinin% 50 transdüksiyon inhibisyon titerini (TI50 titer) hesaplayın. örneğin, bir numunenin 1/8 seyreltilmesi, 6,2'de yapılan hesaplamaya göre % 50'den fazla transdüksiyon inhibisyona sahipse (ve 1/4 seyreltme değilse), TI50 titerini 1/8 olarak bildirin.

7. Nötralize edilmiş AAV parçacıklarının belirlenmesi

  1. Aşağıdaki formülü kullanarak belirli bir örnek için serumun μL başına nötralize edilmiş AAV partiküllerinin sayısını hesaplayın:
    ((MOI x hücre sayısı/kuyusu) / (serum hacmi / TI50 titresinin seyreltme faktörü)) / 2 = nötralize AAV parçacıkları / μL serum9.
    NOT: Nötralize edilmiş parçacıkların %50'sini ölçen TI50 için 2 hesaba bölme. 1/4 TI50 titer (%25 serum) veren bir örnek için, %75 seyreltilmemiş serum ve 1 x 104 hücre üzerine 15k kaplama moi kullanıldığı %75 seyreltici) aşağıdaki hesaplamalar kullanılacaktır: (((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75x106 nötralize parçacıklar / μL serum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plaka kapsamı için en uygun viral dozluğu belirlemek için transdüksiyon tahlilleri
Bu test için köklü bir fibrosarkom hücre hattı olan HT1080 hücreleri seçildi. 1 x 104 HT1080 hücre/kuyu konsantrasyonu, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda ~% 50 hücre konflüensi sağladı. Test için en uygun viral konsantrasyonu belirlemek için, bir hPLAP (insan plasetal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP)31'i kodlayan bir rAAV, hücre başına parçacık içeren bir dizi vg konsantrasyonunda triplicate eklendi (MOI: 0, 150, 500, 1500, 5000, 15000, 50000 ve 150000 (Şekil 3A)). 15000 moi (1.5 x 108 vg/well) %36 plaka renklendirmesi verdi ve en uygun viral dozaj olarak seçildi. 0 ile 15000 arasındaki tüm MOI'ler için renklenme ve viral konsantrasyonlar arasında pozitif korelasyon gözlendi (n = 6, r = 0.995, P<0.001). Bu konsantrasyon, NAb'lerin yokluğunda renk doygunluğu nedeniyle hassasiyet kaybetmezken (yüksek renklenme, Şekil 3B) yüksek NAb konsantrasyonları (düşük plaka renklendirmesi) varlığında muhabir gen sinyalini arka planın üzerinde yeterince gösterdi.

Testin etkinliği, nötralize edici elementlere maruz kaldığında, üç taraflı olarak bir anti-AAV6 fare monoklonal antikorunun (mAb) seri seyreltmeleri kullanılarak denendi. Belirli bir numunenin nötralize edici titresini belirlemek için %50 veya daha fazla transdüksiyon inhibisyonu (TI50) görüntülemek için ilk seyreltmeyi kullanmanın standart yaklaşımı uygulanmıştır (adım 6). Log10 seyreltmelerini değerlendiren anti-AAV6 mAb, ~10 ng/mL (1 ng toplam mAb) ti50 titresi gösterirken, 500 ng/mL (50 ng toplam Ab) ve üzeri bir konsantrasyonda muhabir gen ekspresyonunu tamamen inhibe etti (Şekil 3C).

Figure 3
Şekil 3: Viral dozun optimizasyonu ve anti-AAV6 monoklonal antikora (mAB) karşı test etkinliğinin değerlendirilmesi. (A) Her viral doz (solda) için alkalin fosfataz (hPLAP) ve NBT/BCIP arasındaki karşılık gelen kromojenik reaksiyonu gösteren farklı enfeksiyon (MOI) ve temsili görüntülerdeki (aşağıda) bireysel kuyular için renklenme oranı (toplam alanın% ' i). Yüzde plaka kapsamı da tablolu formda gösterilir (sağda). Her veri noktası teknik bir yinelemeyi temsil eder (n = MOI başına 3 çoğaltma). (B) Şekil 3A'da renklenme ve MOI arasındaki korelasyonun bir gösterimi gösterilmiştir. Kırmızı noktalı çizgi, renklenme ve viral konsantrasyon arasındaki doğrusal korelasyonu etkilemeyen test edilen en yüksek konsantrasyonu temsil eder. (C) Log10 seyreltmelerinde anti-AAV6 monoklonal antikordan AAV6'ya karşı nötralize edici aktivite. AAV6 transdüksiyonunun (TI50) %50 inhibisyonu ~10 ng/mL konsantrasyonda gözlenir. n = Seyreltme başına 3 çoğaltma. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder.

Koyun örneklerinde NAB'lerin AAV6'ya karşı değerlendirilmesi
Serum, karotis damardan 16 G iğne (ucu kesilmiş) ve şırınga bilinçli naif sağlıklı yetişkin koyunlardan (1,5-3 yaşındaki Merinos koyunları) (n = 11) toplanarak kolorimetrik NAb testi kullanılarak TI50 titresini belirlemek için tarandı. Her serum örneği için 1/2 ile 1/512 arasında değişen iki katlı seri seyreltmeler mükerrer veya üç taraflı olarak değerlendirildi. 1/2 seyreltme, μL serum başına 1.88 x 106 AAV partikül konsantrasyonuna karşılık gelen toplam 40 μL serum içeriyordu. AAV nötralizasyon derecesi naif örnek popülasyon içinde farklılık göstermiş, TI50 titer değerleri 1/2 (mavi çizgi) ile 1/80 arasında değişmektedir (yeşil çizgi, 1.88 x 106 ila 7.5 x 107 nötralize AAV parçacıkları/μL serum) (Şekil 4A).

Daha sonra, AAV6'nın doğrudan kardiyak enjeksiyonu (n = 5), naif koyunlara 5 x 1012 ile 3 x 1013 vg arasında değişen dozlarda yapıldı. Kısaca, koyunlar daha önce açıklandığı gibi uyuşturuldu32. Kalp sol yanal pozisyondan açığa çıktı. Perikard açıldı ve AAV, sol ön alçalan koroner arterin (LAD) ikinci dalı çevresindeki bölgede sol ventrikül miyokardına (ön) 10-40 ~20 μL enjeksiyon ile uygulandı. Perikard, interkostal kas, deri altı dokusu ve cilt kapatıldı ve anestezi alındı. Serum, AAV yönetiminden önce ve altı ila sekiz hafta sonra tüm hayvanlardan 16 G iğne kesilmiş ve şırınga (~5 mL serum/hayvan) kullanılarak önceden kanüle edilmiş sağ şah damarından toplanmıştı. Kolorimetrik NAb tahlili, AAV6 yönetiminden sonra NAb titer'deki değişikliği belirlemek için kullanıldı. Post-AAV serum örnekleri üç taraflı olarak 1/2 ile 1/32768 seyreltme arasında değişen 2-4 kat seri seyreltmeler olarak tarandı. Tahlil sonuçları, AAV uygulaması öncesi AAV inhibisyon TI50 titer değerlerinin 1/4 ila 1/80 arasında değiştiğini gösterdi (3.75 x 106 ila 7.5 x 107 nötralize AAV parçacıkları/μL serum; Şekil 4B). AAV kardiyak enjeksiyonu sonrasında AAV öncesi serum titrelere göre NAb titerinde net ve tutarlı bir kontrast gözlenmiştir (Şekil 4B, Tablo 3). En düşük AAV dozu (5 x 1012 vg) 1/2048 TI50 titre (kesik mavi çizgi, 1.92 x 109 nötralize AAV partikülleri/μL serum) ve dozların geri kalanı (1-3 x 1013 vg) 1 arasında değişen TI50 titreler gösterdi /12000 ila >1/32768 (1,13 x 1010 ila >3 x 1010 nötralize edilmiş AAV partikülleri/μL serum).

Figure 4
Şekil 4: Ovine serum örnekleri kullanılarak antikor (Nab) test sonuçlarının nötralize edildiğine örnek olarak. (A) Adeno-İlişkili Virüs (AAV) nötralize edici serum örnekleri, 1/2 ile 1/512 arasında değişen 2 kat seri seyreltmelerle ölçülen 11 naif koyundan toplanmıştır. Renkli çizgiler, düşük ve yüksek nötralize edici aktiviteye sahip örnekleri temsil eder; gri çizgiler dokuz ek örneği temsil eder. Noktalı çizgi, düşük (mavi) ve yüksek (yeşil) temsili numuneler için % 50 transdüksiyon inhibisyonunu (TI50) ve karşılık gelen TI50 titerlerini temsil eder. (B) Doğrudan kardiyak enjeksiyon yoluyla bir doz AAV almadan önce ve aldıktan sonra beş koyundan toplanan serum örneklerinin AAV nötralize edici aktivitesi. Nötralize edici aktivite 1/2 ile 1/32768 arasında değişen 2 kat seri seyreltmelerde değerlendirildi. Her renk farklı bir hayvandan serumu, dolgulu çizgiler AAV öncesi yönetimi ve noktalı çizgiler AAV sonrası yönetimi temsil eder. n = Her örnek için seyreltme başına 2-3 çoğaltma. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder.

Koyun Kimliği Yönetim durumu Alınan doz (vg) NAb Titer (TI50) AAV nötralize / μL serum Katlama değişikliği Öncesi ve Sonrası karşılaştırması
Koyun 1 AAV Öncesi 1x1013 1/5 5.6x106 6400
Sonrası –AAV 1/32000 3x1010
Koyun 2 AAV Öncesi 1x1013 1/80 7.5x107 200
Sonrası –AAV 1/16000 1.5x1010
Koyun 3 AAV Öncesi 5x1012 1/16 1.5x107 125
Sonrası –AAV 1/2000 1.9x109
Koyun 4 AAV Öncesi 2x1013 1/4 3.8x106 >10000
Sonrası –AAV >1/32000 >3x1010
Koyun 5 AAV Öncesi 3x1013 1/8 7.5x106 1700
Sonrası –AAV 1/12000 2.3x1010

Tablo 3: AAV maruziyetinin nötralize edici aktivite üzerindeki etkisi. Koyunlar için nötralize edici aktivite, rAAV6'nın çeşitli dozlarda doğrudan kardiyak enjeksiyonulmadan önce ve aldıktan sonra değerlendirildi. Ti50 titer öncesi ve sonrası alınan doz ve uygulamadan sonra kat değişimi görüntülenir.

Ek Şekil 1: Numune kuyularını hariç tutarak farklı nedenlerin görsel örnekleri. (A) Kontaminasyon varlığı merkezdeki kümeler tarafından görülebilir. (B) Yüksek hücre yoğunluğu. (C) Kuyunun düzensiz aydınlatılışı (sol görüntü), sağ alt köşede (sağ görüntü) fazla kapsama alanı gösteren aynı kuyunun karşılık gelen eşiği. (D) Teknik çoğaltma görüntüleri, soldaki görüntü normal hücre yoğunluğuna sahip sonuçları temsil eder, sağdaki görüntü düşük hücre yoğunluğuna sahip sonuçları yansıtır. (E) Hücreler bir kuyuya eşit olmayan bir şekilde dağıtılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2: hPLAP kesici ucu gösteren basitleştirilmiş plazmid harita. CMV: Sitomegalovirüs promotörü. hPLAP: insan plasetal alkali fosfataz. SV40: Simian virüsü 40 poliadenilasyon sinyali. ITR: Ters terminal yineleme sıraları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu rapor, in vitro viral transdüksiyon derecesine karşılık gelen kromojenik reaksiyonu değerlendirerek belirli bir serum örneğinde AAV nötralizasyonunun kapsamını değerlendiren kolorimetrik bir tahlil açıklanmaktadır. Protokolün geliştirilmesi, immünhistokimi gibi uygulamalarda protein hedeflerinin tespiti için bir boyama aracı ve viral transdüksiyonu değerlendirmek için bir muhabir aracı olarak yaygın olarak kullanılan alkali fosfataz enzimi ile NBT/BCIP arasındaki bilinen kromojenik reaksiyona dayanıyordu24,33,34,35 . Liyakati, zaman ve maliyet etkinliği, erişilebilirliği, yüksek derecede etkinlik gösterirken kurma ve gerçekleştirme kolaylığından kaynaklanmaktadır. Bu testte (AAV-hPLAP) kullanılan rAAV6, muhabir geni insan plasetalin fosfataz (hPLAP) taşır ve sitomegalovirüs (CMV) promotörü34 (Ek Şekil 2) tarafından tahrik edilir. NBT/BCIP, başlangıçta alkali fosfataz ile defosforilasyona tabi olan ve sırayla bir dimer oluşturmak için oksidasyona uğrayan ve canlı mor bir renk olan çözünmeyen bir ürünle sonuçlanan bir hPLAP substratıdır36.

Bu test için en uygun MOI'yi seçerken, amaç, AAV muhabir genini virüs hücre bağlama yoluyla yeterince ifade edecek bir viral konsantrasyon oluşturmak ve NBT / BCIP substratı ile birlikte, doğru bir şekilde ölçülebilecek bir aralıkta renklenme sağlamaktı. Renklenme ve viral konsantrasyon arasındaki doğrusal korelasyonu etkilemeyen test edilen en yüksek konsantrasyon olduğu için 15.000 MOI seçildi. Daha yüksek konsantrasyonlar (50.000 ve 150.000 MOI), renk doygunluğunu gösteren konsantrasyon-renk tepki eğrisinin platoya düşmesine neden oldu (Şekil 3B). Viral MMI'lerin 0 ile 15.000 (n = 6) arasında değerlendirilmesi ve bunlara karşılık gelen renklenme düzeyi r = 0.995 (P < 0.001) ile sonuçlandı ve viral konsantrasyon ile muhabir-gen odaklı renklenme arasında çok güçlü bir pozitif korelasyon kurarak tahlilin hassasiyetini doğruladı. Hücre kültürü koşulları, laboratuvar teknisyenleri, teknikler ve ekipman gibi faktörlerin yanı sıra viral partilerdeki farklılıklar göz önüne alındığında, herhangi bir yeni kullanıcının bir NAb tahlilini kurarken en uygun MOI'nin ön deneme değerlendirmesini yapması önerilir.

Belirli bir NAb tahlil için seçilen MOI, belirli bir serum örneği için gözlenen genel titreye önemli bir katkıda bulunan faktördür. 15.000 yerine 5.000 MOI seçilmiş olsaydı, titer değerinde 3 kat fark beklenebilirdi. Bu tarihsel olarak AAV gen tedavisi alanında sorunlu olmuştur, çünkü farklı preklinik ve klinik çalışmalar, 1.000'den daha az ila yüksek 25.00037 arasında değişen MOI değerlerine sahip AAV NAb tahlillerini uygulamıştır, bu da belirli bir AAV serotip için NAb titerlerinin her türlü çapraz çalışma karşılaştırmasının çok az veya hiç bir değeri olmadığı anlamına gelir. Son zamanlarda, titerlerin serumun μL'si başına nötralize AAV parçacıkları olarak rapor verilmesinin farklı çalışmalarda daha karşılaştırılabilir değerler sağlayabildiği öne sürülmektedir9,38. Hücre hattının seçimi, muhabir geni, kuluçka süreleri ve kültür koşulları gibi çalışmalar arasındaki titrlerde çok sayıda başka faktör varyasyona katkıda bulunabilir. AAV NAb tahlillerinin standardizasyonunu kolaylaştırmak için serumun hem titer değerleri hem de nötralize edilmiş AAV parçacıkları/μL'si bildirilmiştir.

Plakalar arasında hem pozitif bir kontrol hem de ortak bir örnek olarak hareket etmek için her plakaya bilinen bir NAb örneğinin seri seyreltilmesinin dahil edilmesi önemlidir. Bu, ayrı çalıştırmalar arasındaki olası değişkenliği tanımlamak için önemlidir. İlgi AAV'ye karşı nötralize edici bir monoklonal antikor ideal bir pozitif kontrol ve standarttır, ancak NAbs için pozitif olan bir serum örneği de kabul edilebilir. Testin etkinliği, bozulmamış AAV6 parçacıklarına (ADK6) özgü monoklonal bir antikorun konsantrasyona bağlı bir şekilde transdüksiyonu nicel olarak inhibe edebileceği gösterilerek doğrulandı.

Üreticinin malzeme veri sayfasına dayanarak, BCIP / NBT substrat sistemi çözünmeyen mavi-mor ürünü ~ 10 dakika içinde üretir ve çok kararlıdır. Bununla birlikte, prosedürlerin kuluçka süresinin uzunluğunu etkileyebileceğine dikkat edilir. Önceki raporlara göre, 1-24 saat zaman dilimleri kullanılmıştır30,39. Bu test için, kuluçka süreleri çalıştırmalar arasında tutarlı olmalıdır. Zaman esnekliği, kullanıcıların protokolün 3.

Büyük hayvan modelleri kullanılarak yapılan preklinik çalışmalar, koyun ve domuz gibi hayvanların insanlarla paylaştığı fizyolojik benzerlik nedeniyle laboratuvar ve klinik arasında çok önemli bir basamak sağlar1,40,41. Tarihsel olarak, klinik çalışmalara giren aday AAV gen tedavilerinin çoğu büyük hayvanlarda ön denemelerden geçmiştir1. Birden fazla çalışma, hem insanların hem de koyunlar, domuzlar, köpekler, tavşanlar ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere bir dizi büyük hayvanın, AAV6'nın yanı sıra diğer birçok AAV serotipine karşı nötralize edici antikorları barındırabileceğini göstermiştir42,43. Bu, hem büyük hayvan modellerinde hem de insanlarda denemelerden önce NAb'ler için ön taramanın önemini vurgulamaktadır. Daha önce AAV'ye maruz kalmamış koyunlardan alınan serum örneklerinin NAb durumu değerlendirildi ve bunlardan 11'inden 10'unun TI50 titresinin 1/30'< (<3 x 107 nötralize edilmiş AAV parçacıkları/μL serum). Buna karşılık, biri 1/80'lik bir TI50 titresi gösterdi (7,5 x 107 nötralize edilmiş AAV parçacıkları/μL serum). Koyunlardan beşi doğrudan kalp kası enjeksiyonu almaya devam etti. Tüm örnekler arasında, AAV'nin yönetimi nötralizasyon aktivitesini önemli ölçüde değiştirdi ve AAV öncesi ve sonrası maruz kalma arasındaki TI50 titer değerlerinde 125 ila 10.000 > arasında değişen kat değişim artışları (Tablo 3). Not olarak, uygulanan en düşük AAV6 dozu (5 x 1012 vg), en düşük AAV sonrası TI50 titer değerine (TI50 titer 1/2000) ve kat değişim artışına (125 kat) karşılık gelir. Buna karşılık, 11 naif koyun içinde önceden var olan NAb'lere dair AAV transdüksiyonunun önüne geçebilecek seviyelerde net bir kanıt gözlenmedi (tüm TI50 titer değerleri <1/100). Doğrudan AAV enjeksiyonu alan 5 koyundan elde edilen veriler, NAb pozitifliği için bir kesintinin 1/1000 > olacağını düşündürecektir (AAV öncesi ve sonrası değerlere göre). NAb öncesi ve sonrası titer ile 1/32.000 > titreleri algılama kapasitesi arasındaki keskin fark, test etkinliğinin ve hassasiyetinin daha fazla doğrulanmasını sağlar. Bir numunenin nötralize edici aktivite için olumlu kabul edildiği bir kesme noktası oluşturmak, NAb pozitif hayvanlar için bir eşik belirlerken sonraki önemli bir adımdır. Bu, belirli bir ilgi popülasyonundan naif örneklerin bir grubundaki (~n ≥ 30) değişkenlik değerlendirilerek belirlenebilir. Bu, bir numunenin aktiviteyi nötralize etmek için olumlu kabul edildiği istatistiksel olarak türetilmiş bir kesme noktası seçmek için kriterler oluşturulmasına izin verir. Alternatif olarak, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, hem AAV öncesi hem de sonrası hayvanlardan alınan pozitif kontrol örnekleri, aktiviteyi nötralize etmek için pozitif titer aralığını gösterebilir. Literatürde kesme noktası eşiklerinin oluşturulması ve in vitro nötralize edici testlerin doğrulanması ve optimizasyonu ile ilgili öneriler kapsamlı bir şekilde açıklanmıştır44,45,46,47.

Teknik belirli sınırlamalar içerir. Mikroskop kamerasının görüntü kuyularına kullanılması yararlıdır, çünkü nötralizasyon derecesini doğru bir şekilde ayırt edebilecek çok yüksek kaliteli görüntüler sağlar. Bununla birlikte, mikroskopi emek yoğun olabilir ve birçok (>100) numune işleniyorsa pratik olmayabilir. Görüntülerin kalitesi ve aydınlatması korunabiliyorsa, yüksek çözünürlüklü bir düz yataklı veya plaka tarayıcı kuyuların görüntülenmesine daha hızlı bir yaklaşım sağlayabilir. Yüksek MOI'ların test algılama hassasiyetini azalttığı bildirilmiştir. Yüksek AAV dozlarının nötralize edici aktiviteden kaçabileceği veya NAbs48,49,50 varlığında AAV transdüksiyonunun gerçekleşebileceği ileri sürülmektedir. Bu test orta derecede yüksek bir MOI (15.000) kullanır; ancak çok yüksek seyreltmelerde nötralizasyon aktivitesini tespit edebildiği için hassasiyet engellenmiş görünmemektedir (>1:32.000) (Şekil 4B). Son olarak, bu test viral bir vektör kullandığından, rekombinant AAV kullanmak için genellikle bir yönetim organı tarafından uygun onay gereklidir; bu ülkeden ülkeye farklılık gösterecektir.

Özetle, bu in vitro test, rAAV6'ya karşı nötralize edici antikorların varlığını tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli, kolay erişilebilir ve basit bir yöntem sağlar. Bu test, farklı AAV serotipleri ile nispeten kolay bir şekilde performans sergileyecek şekilde ayarlanabilir ve optimize edilebilir. Talep üzerine bu test için AAV6-hPLAP vektörü sağlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, JRM ve CJT'ye Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Proje Hibesi (ID 1163732) ve kısmen Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edildi. SB, Baker Kalp ve Diyabet Enstitüsü-La Trobe Üniversitesi Doktora Bursu ile desteklenmektedir. KLW, Avustralya Ulusal Kalp Vakfı'ndan (ID 102539) Shine On Foundation ve Geleceğin Lider Bursu tarafından desteklenmektedir. JRM, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kıdemli Araştırma Bursu (ID 1078985) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 178
Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bass-Stringer, S., Thomas, C. J.,… More

Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter