Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Udvidelse af værktøjssættet til In Vivo-billeddannelse af axonal transport

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

Ved hjælp af transgene fluorescerende mus beskrives detaljerede protokoller for at vurdere in vivo axonal transport af signalende endosomer og mitokondrier inden for motoriske og sensoriske axoner af den intakte iskiasnerve hos levende dyr.

Abstract

Axonal transport opretholder neuronal homeostase ved at muliggøre tovejshandel med forskellige organeller og laster. Forstyrrelser i axonal transport har ødelæggende konsekvenser for individuelle neuroner og deres netværk og bidrager til en overflod af neurologiske lidelser. Da mange af disse tilstande involverer både celleautonome og ikke-autonome mekanismer og ofte viser et spektrum af patologi på tværs af neuronale undertyper, er metoder til nøjagtigt at identificere og analysere neuronale delmængder afgørende.

Dette papir beskriver protokoller til vurdering af in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier i iskiasnerver hos bedøvede mus. Trinvise instruktioner gives til 1) skelne motoriske fra sensoriske neuroner in vivo, in situ og ex vivo ved hjælp af mus, der selektivt udtrykker fluorescerende proteiner i kolinerge motorneuroner; og 2) separat eller samtidig vurdere in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier. Disse komplementære intravitale tilgange letter samtidig billeddannelse af forskellige laster i forskellige perifere nerveaksoner for kvantitativt at overvåge aksonal transport i sundhed og sygdom.

Introduction

Det perifere nervesystem (PNS) forbinder centralnervesystemet (CNS) med dets distale mål, hvilket gør det muligt for relæet af efferente signaler at udøve motorisk kontrol og afferente signaler for at give sensorisk feedback. Ved hjælp af de mange fremskridt inden for musegenetik har forskere udviklet forskellige musemodeller til at undersøge mange sygdomme / syndromer, der rammer PNS 1,2,3. Da de fleste neurodegenerative patologier er multifaktorielle med celleautonome og ikke-autonome bidrag 4,5, kan frigørelse af celle-/neuronspecifikke patologier give afgørende, ny indsigt i sygdomsmekanismer.

Til dette formål har udviklingen af bakterielle kunstige kromosom (BAC) -transgene mus6 muliggjort selektiv endogen ekspression af fluorescerende proteiner i målrettede undergrupper af neuroner. For eksempel er BAC-transgene mus tilgængelige, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i kolinerge7 eller glycinerge neuroner8 eller en variant rødt fluorescerende protein (tdTomato) i parvalbumin-positive neuroner9. Alternativt kan selektiv neuronal ekspression af fluorescerende proteiner opnås via Cre-loxP-teknologi 10. For eksempel kan musestammer, der udtrykker Cre-rekombinase i undergrupper af neuroner (f.eks. Cholinacetyltransferase (ChAT)-Cre), opdrættes med mus, der udtrykker et fluorescerende protein (f.eks. tdTomato eller GFP) fra et konstitutivt sted (f.eks. Gt (ROSA)26Sor) under kontrol af en transkriptionel repressor flankeret af loxP-steder11 (f.eks. genererende mus, der kun udtrykker tdTomato i kolinerge neuroner). Ved hjælp af Cre-loxP-rekombination er der faktisk genereret transgene mus, der udtrykker gult fluorescerende protein i axoner i den faldende corticospinalkanal12.

Derudover muliggør nylige fremskridt inden for CRISPR / Cas9-genredigering, såsom ORANGE, fluorescerende mærkning af flere endogene neuronale proteiner, hvor ekspression kan opnås ved nanoskalaopløsning13. Desuden kan ORANGE-CAKE i kombination med Cre-ekspressive musestammer bruges til at mærke flere endogene proteiner i individuelle neuroner13. Alternativt tillader viral medieret neuronal sporing også mærkning af neuronale delmængder og kan opnås med målrettede kombinationer af virale serotyper og / eller cellespecifikke promotorer 14,15,16,17.

Ud over de neuronale mærkningsmetoder er muselinjer også blevet konstrueret til at udtrykke reporterproteiner rettet mod specifikke organeller, såsom mitokondrier, der udtrykker cyan fluorescerende protein (Mito.CFP)18 eller autofagosomer, der udtrykker GFP (LC3.GFP)19. Desuden er muselinjer blevet konstrueret til at vurdere calciumdynamik specifikt i neuroner (f.eks. Thy1.GCaMP)20,21. Alt i alt, med udviklingen af sådanne modeller, gør nye eksperimentelle applikationer det muligt for forskere at stille mere præcise biologiske og patologiske spørgsmål om CNS og PNS.

Hovedrollen af perifere motoriske nerver er at transmittere elektriske signaler til skeletmuskulaturen for at fremkalde bevægelse. Derudover og forekommer over længere tidsskalaer, neurokemiske og fysiologiske meddelelser i form af forskellige organeller (f.eks. Mitokondrier, endolysosomer, signalerende endosomer) krydser det cytoskeletale netværk på en en- eller tovejs måde for at hjælpe med at opretholde neuronal homeostase 22,23,24. Forringelser i aksonal transport har katastrofale konsekvenser for neuronal sundhed og er forbundet med mange neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme25. På molekylært niveau kan forringelser i axonal transport forstyrre fysiologiske hændelser, der regulerer synaptisk signalering og plasticitet, gentransskription og lokal translation gennem axon26,27. Mens der er en lang række værktøjer til at studere disse begivenheder i dyrkede celler / neuroner28,29, er det nødvendigt at vurdere axonal transportdynamik og axonalbundne biologiske begivenheder in vivo for at bekræfte nøgleindsigt i fysiologiske og patologiske processer30.

I årenes løb har Schiavo Laboratory optimeret protokoller til at stille forskellige spørgsmål om axonal transport 31,32,33,34,35,36. Disse eksperimenter er udvidet fra opdagelsen af, at et fluorescerende mærket atoksisk fragment af stivkrampe neurotoksin (HCT) internaliseres i axonterminaler i skeletmuskulatur gennem interaktioner med nidogens og polysialogangliosider37. Når HCTer internaliseret, transporteres H C T retrogradt i Rab7-positive, neurotrofinholdige signalendedosomer, der er bestemt til cellelegemerne i motoriske og sensoriske neuroner 38,39,40,41. Parallelt hermed har fremskridt inden for billeddannelsesteknologi muliggjort realtidsanalyse af perifere nervebundter og individuelle axoner i levende, bedøvede mus30. Det første forsøg på at vurdere in vivo axonal transportdynamik i patologi afslørede præsymptomatiske svækkelser i transporten af signalendedosomer og mitokondrier i SOD1G93A musemodellen af amyotrofisk lateral sklerose (ALS)35. Det er vigtigt, at disse defekter sandsynligvis ikke blot repræsenterer sekundære konsekvenser af neurodegeneration, da det konstateres, at motorneurontab kan forekomme i fravær af aksonale transportforstyrrelser i en musemodel af Kennedys sygdom42 og en heterozygot mutant FUS-model af ALS43. Sådanne aksonale transportunderskud kan afhjælpes hos ALS-mus ved anvendelse af inhibitorer af specifikke kinaser33 eller vækstfaktorreceptorer34. Desuden ændrer behandling af neuroner med en specifik histon deacetylaseblokker mitokondrietransport in vivo36. Senest rapporterer vi, at den BDNF-afhængige modulering af axonal transport er dysreguleret i forskellige motorneuronundertyper i ALS-mus44.

Ved at bruge et stadigt voksende værktøjssæt til vurdering af aksonal transportdynamik 28,29 skitserer denne videoprotokol flere applikationer, der giver yderligere indsigt i forskellige biologiske og patologiske scenarier. For det første bruges transgene mus, der selektivt udtrykker fluorescerende proteiner i kolinerge neuroner (dvs. motorneuroner) til at skelne mellem motoriske og sensoriske axoner både in vivo og ex vivo. Fluorescerende mærket HCT indlæses derefter i signalende endosomer i tre transgene linjer for at differentiere aksonal transportdynamik i forskellige perifere neuroner. Den næste eksperimentelle protokol beskriver en multiplex fluorescens tilgang til at vurdere mitokondrietransport specifikt i motorneuroner ved at opdrætte ChAT.tdTomato mus med Mito-CFP mus. Endelig gives der instruktioner om, hvordan man samtidig afbilder mitokondrier og signalerer endosomer inden for samme axon in vivo.

Protocol

Al musehåndtering og forsøg blev udført i overensstemmelse med Animals (Scientific Procedures) Act (1986) og blev godkendt af University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee.

1. Dyr

  1. Opbevar alle dyr i individuelt ventilerede bure i et temperatur- og fugtighedskontrolleret miljø og hold dem på en 12 timers lys/ mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand.
  2. Brug både han- og hunmus af følgende transgene stammer: 1) heterozygote Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd-mus, benævnt ChAT.eGFP-mus; 2) heterozygot B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, benævnt HB9. GFP mus; og 3) heterozygote B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, benævnt Mito.CFP mus.
  3. Generer ChAT.tdTomato mus ved at krydse homozygote B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, benævnt ChAT.Cre mus, med homozygote B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, benævnt Rosa26.tdTomato mus.
  4. Generer ChAT.tdTomato::Mito.CFP mus ved at krydse heterozygote ChAT.tdTomato mus med heterozygote Mito.CFP mus.

2. Intramuskulære injektioner af fluorescerende HCT

  1. Forberedelse før operationen
    1. Express HCT (HCT441, rester 875-1315) smeltet sammen til et forbedret cysteinrigt mærke i bakterier som et glutathion-S-transferase fusionsprotein pr. 45. Mærk HCT med AlexaFlour555 C2 maleimid31, dialyser det i iskold dialysebuffer (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7,4), frys det i flydende nitrogen, og opbevar det ved -80 °C. Før du udfører in vivo-eksperimenter , skal du først teste HCT in vitro for vellykket optagelse og transport i primære neuroner.
    2. Fortyndet fluorescerende HCT(f.eks. HCT-555) til en endelig og eksperimentelt konsistent koncentration fra 2,5 til 10 μg/μL i sterilt phosphatbufferet saltvand (PBS) i et 0,2 ml rør. På dette trin tilsættes flere forbindelser/faktorer til HCT-opløsningen, hvis det er nødvendigt (f.eks. hjerneafledt neurotrofisk faktor).
      BEMÆRK: Det endelige volumen skal være passende for størrelsen på den eller de muskler, der er af interesse. Forbered for eksempel et injektionsvolumen på 3-4 μL for tibialis forreste (TA) muskel og ~ 1 μL for den mindre soleus muskel. Arbejdskoncentrationen af HCT holdes mellem 2,5 og 10 μg/μL uanset det endelige volumen.
    3. Bland HCT-opløsningen ved hjælp af en pipette eller hvirvel, og drej kortvarigt ned ved lav hastighed ved hjælp af en skrivebordscentrifuge for at opsamle væsken og fjerne store bobler. Beskyt HCT mod lys og transport på is.
    4. Brug en trukket glasmikropipet til optimale intramuskulære injektioner i mindre muskler (f.eks. Soleus) eller til intrasciatic nerveinjektioner. Træk graduerede glasmikropipetter (pr. 46) før operationen.
      BEMÆRK: For at muliggøre pipettering og begrænse strømmen op og ud af mikropipettens bagside skal du forsigtigt afbryde et lille stykke fra den skarpe spids ved hjælp af fine tang under et dissekeringsmikroskop. Pas på at bortskaffe den ødelagte ende i den passende skraldespand.
    5. Steriliser og rengør alle kirurgiske værktøjer inden brug.
  2. Kirurgi-intramuskulære injektioner
    1. Forbered dig på operation ved at sikre en steril kirurgisk drapering på en varmemåtte indstillet til 37 ° C. Placer og fokuser betjeningsmikroskopet. For at operationen kan påbegyndes, skal du pakke de presteriliserede kirurgiske værktøjer, kirurgisk tape, sterile vatpinde, 70% (v / v) ethanol i vand, steril saltvand, suturer og en Hamilton-nål eller trukket glasmikropipetter ud på den kirurgiske drapering.
    2. Sørg for, at bedøvelsesmaskinen har tilstrækkelig ilt og isofluran i løbet af den kirurgiske procedure. Ret strømmen af anæstesi til induktionskammeret og tænd for bedøvelsesmaskinen.
      1. Til at begynde med skal du bruge en iltstrømningshastighed på 1-2 l / min og 5% isofluran. Placer musen i induktionskammeret for at starte anæstesi. Når den oprettende refleks er fraværende, reducer anæstesi til 2-3% isofluran, ret anæstesistrømmen til mundstykket og overfør musen til mundstykket placeret i et separat område af det kirurgiske rum.
    3. Sørg for, at både hornhinde- og pedaludtagningsreflekserne er fraværende, før du barberer det område af pels, der dækker den eller de muskler, der skal injiceres. Når du er færdig, skal du fjerne så meget barberet pels fra musen som muligt ved hjælp af den klæbrige side af kirurgisk tape og placere musen på vejevægte for at registrere dens prækirurgiske vægt.
    4. Påfør forsigtigt øjensmøremiddel ved hjælp af en vatpind og overfør musen og mundstykket til det kirurgiske område.
      BEMÆRK: Prøv at begrænse mængden af barberet pels, der også overføres til det kirurgiske område. Brug kirurgisk tape til at fastgøre hovedet til mundstykket for at forhindre musen i at glide ud. Brug en separat vatpind til at anvende ethanol på det barberede område for at sterilisere og reducere pelsforurening.
    5. Placer kroppen i henhold til den muskel, der skal injiceres. For eksempel for TA skal du placere musen på ryggen og strække bagbenet ud ved ~ 10 ° fra midterlinjen. Alternativt kan du placere dyret på siden ved soleusinjektioner og forlænge bagbenet med ~45° fra midterlinjen. Når bagbenet er i den rigtige position, skal du bruge kirurgisk tape over foden for at forhindre uønsket bevægelse under operationen.
      BEMÆRK: Injektionsprocedurerne for TA, gastrocnemius og soleus muskler er tidligere blevet beskrevet32.
    6. Før du foretager et snit, skal du bekræfte, at anæstesien er tilstrækkelig ved at teste pedaludtagningsrefleksen. Overvåg anæstesien løbende og vedligehold den under hele den kirurgiske procedure med regelmæssig vurdering af vejrtrækning og tilbagetrækningsrefleksen.
    7. På dette tidspunkt skal du trække den fungerende HCT-opløsning ind i Hamilton-sprøjten eller den trukne glasmikropipette.
    8. Lav et lille snit over den eller de muskler, der er af interesse i det eller de områder, der svarer til motorens endepladeområder 46,47,48. Gennembor den ydre fascia på musklen og injicer langsomt HCT pr. 32. Lad sprøjten/mikropipetten stå på plads i 5-10 s, før den langsomt trækker sig ud.
    9. Luk snittene med 1-2 suturer og overfør musen til et isoleret genopretningsbur. Overvåg musen efter operationen i mindst 30 minutter, før du returnerer den til hjemmeburet. Når musen er kommet sig, og den kirurgiske overvågning er afsluttet, skal du returnere buret til normale boligforhold.

3. In vivo aksonal transport

  1. Udsætter iskiasnerven
    1. Mikroskopets miljøkammer indstilles til 37 °C mindst 1 time før billeddannelse.
    2. Forbered dig på at udsætte iskiasnerven ved at arrangere den kirurgiske drapering, værktøjer, tape, sterile vatpinde, 70% ethanol og steril saltvand omkring det kirurgiske område. Sørg for, at bedøvelsesmaskinen har tilstrækkelige lagre af ilt og isofluran i op til 2 timer pr. Mus. Opret en kile ud af parafilm eller usynlig tape ved at skære den i et smalt rektangel (f.eks. ~ 1 cm bredde for større mus) med en vinklet spids og placere den under den udsatte iskiasnerve for at hjælpe billeddannelsesprocessen. Placer induktionskammeret oven på en varmemåtte og indstil det til kropstemperatur.
      BEMÆRK: Fire timer er rigelig tid til, at HCT er blevet optaget og retrograd transporteret fra injektionsstedet til iskiasnerven; derfor kan en enkelt mus gøres klar til genbedøvelse efter denne tid.
    3. Ret strømmen af anæstesi ind i induktionskammeret, tænd bedøvelsesmaskinen med en iltstrømningshastighed på 1-2 l / min og 3-4% isofluran, og placer musen i induktionskammeret for at starte anæstesi.
      BEMÆRK: Da in vivo axonal transporteksperimentet er en terminal procedure, er der ingen grund til at smøre øjnene.
    4. Når den korrigerende refleks er fraværende, reducer anæstesi til 2-3% isofluran, ret anæstesistrømmen til mundstykket og overfør musen til mundstykket. Brug kirurgisk tape til at fastgøre hovedet til mundstykket, forlæng den målrettede bagkant ved ~ 45 ° fra midterlinjen, og brug kirurgisk tape over foden for at opretholde denne position.
      BEMÆRK: Reduceret anæstesi er fordelagtig på dette tidspunkt, da det kan begrænse virkningen af vejrtrækningsartefakter under billeddannelsesprocessen.
    5. Sørg for, at hornhinde- og pedalabstinensreflekser er fraværende, og brug derefter saks til at skære huden overliggende iskiasnerven32 (dvs. et stort område, der strækker sig fra den centrale rygmarv til midten af baglåret). Fjern den overliggende biceps femoris muskel, samt enhver anden muskulatur og bindevæv, der er nær iskiasnerven. Undgå at beskadige iskiasnerven og de omkringliggende blodkar, især dem, der ligger nær det laterale aspekt af patella / proximalt aspekt af det laterale gastrocnemiushoved.
    6. Når den intakte iskiasnerve er tilstrækkeligt eksponeret, skal du anvende forvarmet steril saltvand på området omkring iskiasnerven for at forhindre udtørring. Brug buede tang til at forstyrre det dybtliggende bindevæv og placere den forberedte parafilm 'kile' under nerven. Når du er færdig, anbringes saltvandsvædet vat på det udsatte område, og musen flyttes ind i induktionskammeret placeret oven på varmemåtten (indstillet til 37 °C), som stadig skal fyldes med isofluran iO2.
  2. In vivo axonal billeddannelse
    1. Placer et 22 x 64 mm dækglas på det tilpassede mikroskoptrin, og fastgør dets position med tape. Vælg og påfør nedsænkningsolie til målet, og tilslut derefter mikroskopstadiet til det omvendte mikroskop. Hæv langsomt det oliedybte mål, indtil der er kontakt mellem olie- og dækglasset.
      BEMÆRK: Enten 40x, 1.3 numerisk blænde (NA) DIC Plan-Apochromat eller 63x, 1.4 NA DIC Plan-Apochromat olie-nedsænkningsmål kan bruges til at afbilde in vivo-transport i iskiasnerven.
    2. Flyt det bedøvende mundstykke på mikroskopstadiet, og fastgør anæstesislangerne med tape for at forhindre forstyrrelse af anæstesien. Fjern bomuldsulden fra iskiasnerven, og overfør musen fra induktionskammeret til mundstykket med den udsatte nerve vendt mod dækglasset. Brug kirurgisk tape for at sikre, at musens hoved er fastgjort til mundstykket og opretholde det laveste, effektive anæstesiniveau. Løft forsigtigt musen ved halen og tilsæt steril saltvand til dækslippen nær den udsatte iskiasnerve for at begrænse udtørring og hjælpe billeddannelse.
      BEMÆRK: Luk alle døre i miljøkammeret for at sikre, at området forbliver ved kropstemperatur.
    3. Brug okularerne til at lokalisere iskiasnerven, bestemme det optimale fokuspunkt og vælge et interesseområde indeholdende bevægelige aksonale organeller.
      BEMÆRK: En detaljeret forklaring af denne proces er tidligere beskrevet32.
    4. Skift til computersoftwaren ved at klikke på knappen Anskaffelse (eller tilsvarende), og vælg et interesseområde. Brug en digital zoom til at opnå en samlet >80x forstørrelse, og drej det valgte område vandret for at visualisere axonerne (f.eks. højre mod venstre bevægelig retrograd last og venstre mod højre bevægelig anterograd last).
      BEMÆRK: Retningsparametrene er brugerafhængige, men skal forblive konsistente under hele eksperimenterne.
    5. Optimer signalintensiteten ved at justere parametre som laserintensitet (0,2 - 1%), pinhole blænde (1 AU - max), forstærkning (Master) (700 - 1000), digital offset (-50 - 0) og digital forstærkning (1,0 - 4,0). For at reducere den potentielle påvirkning af fototoksicitet skal laserintensiteten opretholdes på ≤ 1% , hvor det er muligt, med en maksimal laserintensitet på 2%.. Skift alle andre parametre, før du justerer laserintensiteten for optimal signaldetektering.
    6. Klik på feltet Områder (eller tilsvarende), vælg et rektangulært område af interesse, og indstil derefter rammestørrelsen til mindst 1024 x 1024 pixel i anskaffelsestilstand (eller tilsvarende), og start timelapse-anskaffelse af 100-1.000 billeder.
      BEMÆRK: Den ønskede billedoptagelseshastighed er brugerafhængig (f.eks. kan transport vurderes med billedhastigheder mellem 0,1 og 6 s) og kan justeres med softwareparametre, såsom interesseområde, scanningshastighedstid, anskaffelsesgennemsnit og laserretning. For eksempel for at opnå en langsommere billedhastighed, øge højden / bredden af interesseområdet, erhverve langsommere scanningshastigheder, øge erhvervelsesgennemsnittet og bruge enkelt laserretning og omvendt for en hurtigere billedhastighed. Billedoptagelseshastigheden skal forblive konsistent på tværs af sammenlignelige datasæt, fordi billeddannelse ved forskellige frekvenser kan forårsage uoverensstemmelser. Hurtige laster såsom signalendedosomer kræver en hurtigere billedhastighed (f.eks. 0,1-3 s) sammenlignet med langsommere organeller som mitokondrier, der kan analyseres ved hjælp af en langsommere hastighed (f.eks. 2,5-6 s).
    7. Målet er at fange mindst 10 bevægelige laster fra mindst tre axoner pr. Mus.
      BEMÆRK: Baseret på to-stikprøve, tosidede effektberegninger (med standardeffekt på 0,8 (1-β) og type I-fejlprocent på 5% (α)) er prøvestørrelser på 6-8 tilstrækkelige til at identificere aksonale transportforskelle mellem vildtype- og sygdomsmodeller35,43.
    8. Når billeddannelsen er afsluttet, skal du straks aflive musen, mens den er under anæstesi (f.eks. Cervikal dislokation). Post mortem væv, såsom muskler og iskiasnerver, kan også høstes til yderligere analyse.

Representative Results

Dette papir beskriver en alsidig protokol, der udvider in vivo axonal transportværktøjssæt i gnavermodeller. Figur 1 viser, at motorneuronaksoner kan differentieres fra både sensoriske neuronaksoner og Schwann-celler ved hjælp af transgene mus. Figur 1A viser eGFP-ekspression i kolinerge motoraksoner fra en levende, bedøvet ChAT.eGFP-mus. Figur 1B bruger en alternativ metode til at opnå tdTomato-ekspression i en friskskåret nerve (dvs. ingen yderligere vævsbehandling) fra en ChAT.tdTomato-mus. Derfor muliggør brug af transgene stammer som ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato eller Hb9.GFP motor axonspecifik mærkning in vivo.

Alternativt kan axoner også identificeres ved at injicere sporstoffer/markører (f.eks. HCT31,32 eller vira, der koder for eGFP15) i skeletmuskler. Figur 2 fremhæver en sådan applikation, der viser otte robust udtrykkende ChAT.eGFP-positive axoner, der indeholder HCT-555-positive signalendedosomer (hvide pile), ~ 4 timer efter sondeinjektion i TA-musklen. Ved hjælp af dette eksperimentelle design kunne vi identificere TA-innerverende α-motoriske neuroner, som overvejende er hurtigt fedtige44. Yderligere fem ChAT.eGFP-axoner med mindre robust eGFP-ekspression (figur 2A, orange stjerner) var delvist ude af fokus og sandsynligvis placeret lidt dybere inde i iskiasnerven.

Desuden identificerede vi HCT-555-positive signalendedosomer i eGFP-negative sensoriske axoner (gule pile). Som sådan kan man ved hjælp af dette eksperimentelle paradigme specifikt vurdere og sammenligne den aksonale transport af signalendedosomer i motoriske versus sensoriske neuroner in vivo. Ved hjælp af denne transgene reporterstamme opdagede vi faktisk, at transport af signalendedosomer i ChAT.eGFP-positive motoraksoner er hurtigere end i ChAT.eGFP-negative sensoriske axoner, som pålideligt kan differentieres ved hjælp af axonbredder43.

Vi har tidligere identificeret motorneuronaksoner ved hjælp af ChAT.eGFP-musen in vivo43. Vi rapporterer nu, at HB9. GFP-mus kan også bruges til at opnå motorneuron axon identifikation in vivo. Figur 3 viser faktisk en række timelapsebilleder af HB9. GFP-axoner indeholdende retrogradt bevægende HCT-555-positive signalendedosomer. Bemærk, at I modsætning til ChAT-drevet udtryk har GFP et mere punktligt/granulært mønster i HB9. GFP axoner; Årsagen til dette er uklar.

Vi har tidligere beskrevet, hvordan man overvåger in vivo mitokondriedynamik i iskiasnerver via intrasciatic nerveinjektioner af mitokondriemålrettet farvestof, tetramethylrhodamin, ethylester, perchlorat (TMRE)32,36. For pålideligt at skelne mellem motoriske og sensoriske mitokondrier kan Mito.CFP-musen, der udtrykker CFP under Thy1-promotoren 18, krydses med transgene mus, der udtrykker et fluorescerende reportergen i specifikke neuronale typer. Ved at opdrætte Mito.CFP-mus med ChAT.tdTomato-mus (kaldet ChAT.tdTomato::Mito.CFP) kunne vi visualisere mitokondrier specifikt i motoraksoner, som vist i figur 4. I dette live multiplexeksempel kunne fem ChAT.tdTomato axoner visualiseres, hvoraf fire indeholder CFP-positive mitokondrier. Desuden kunne Ranviers knude (hvid pil i panel iii) også identificeres. Desuden er knudepunkterne i Ranvier tydeligt detekterbare i ChAT.eGFP, HB9. GFP- og Mito.CFP-mus (ikke vist). Disse dobbelttransgene stammer muliggør time-lapse intravital billeddannelse af levende, bedøvede mus til overvågning af motorneuronspecifikt mitokondrieindhold og aksonal transportdynamik.

Endelig kan signalerende endosomer og mitokondrier samtidig visualiseres inden for de samme axoner in vivo ved at injicere HCT i musklerne hos Mito.CFP-mus (figur 5). Intramuskulære injektioner af HCT-555 blev udført i TA-muskler i en Mito.CFP-mus ~ 4 timer før billeddannelse. Både mitokondrier (i paneler) og signalende endosomer (ii paneler) blev samtidigt visualiseret i muskelspecifikke axoner (dvs. axoner, der innerverer TA). Faktisk kan anterogradely (gule trekanter) og retrogradt (grønne trekanter og cirkler) bevægelige organeller samt stoppede organeller (orange trekanter og cirkler) observeres. Ved hjælp af dette eksperimentelle paradigme kan man vurdere de komplekse funktionelle interaktioner mellem axonale mitokondrier og signalende endosomer in vivo. Samlet set demonstrerer vi flere forskellige eksperimentelle tilgange til vurdering af axonal transport af signalendedosomer og / eller mitokondrier, specifikt i kolinerge motorneuroner in vivo.

Figure 1
Figur 1: Iskiasnervemotoriske axoner. (A) Repræsentativt enkeltplanbillede af eGFP-positive motoraksoner opnået in vivo fra en ChAT.eGFP-mus. (B) Repræsentativt enkeltplansbillede af tdTomato-positive motoraksoner i en udskåret iskiasnerve fra en ChAT.tdTomato-mus. Sondringer i axonkaliber skyldes forskelle i musens alder og størrelse. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ChAT = cholin acetyltransferase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: In vivo axonal transport af signalendedosomer i levende iskiasnervemotoriske og sensoriske neuroner af en ChAT.eGFP-mus. (A-C) Repræsentative billeder af kolinerge axoner, der udtrykker eGFP (A) og indeholder HCT-555-positive signalendedosomer (B) og fusioneret (C). De hvide pile fremhæver en eGFP-positiv motor axon indeholdende HCT-555-positive signalendedosomer, cyanpilene identificerer en motor axon, der mangler HCT-555-positive signalendedosomer, og de gule pile fremhæver en eGFP-negativ sensorisk axon, der transporterer HCT-555-positive signalendedosomer. Orange stjerner identificerer motoraksoner med svagere eGFP-udtryk. Skala bar = 25 μm. Forkortelser: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ChAT = cholin acetyltransferase; HCT-555 = stivkrampetoksinbindende domæne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Time-lapse billedserie, der repræsenterer in vivo axonal transport af signalendedosomer i levende motorneuroner i en HB9. GFP-mus. (A-D) Time-lapse-billeder taget hver 3. s, der viser motorneuronaksoner, der udtrykker grønt fluorescerende protein (i) og indeholder HCT-555-positive signalendedosomer (ii) og fletningen (iii). Hver cirkel af samme farve identificerer det samme bevægelige endosom på tværs af forskellige rammer. Retrograd bevægelse er fra højre mod venstre. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; HCT-555 = stivkrampetoksinbindende domæne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vivo axonal transport af mitokondrier i levende iskias nervemotoriske neuroner af en ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: mus. (A-C) Repræsentative billeder af tdTomato-positive motoraksoner (A), indeholdende CFP-positive mitokondrier (B) og fusion (C). De indsatte billeder i-iii indeholder en højere forstørrelse fra hvert panel. Den hvide pil repræsenterer en mistænkt knude af Ranvier. Skalastænger = 25 (A-C) og 10 μm (i-iii). Forkortelser: ChAT = cholin acetyltransferase; CFP = cyan fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse billedserie, der repræsenterer samtidig in vivo axonal transport af mitokondrier og signalerende endosomer i levende iskiasnervemotoriske neuroner hos en Mito.CFP-mus. (A-C) Time-lapse billeder taget hver 3 s, der viser axonal transport af både mitokondrier (i) og signalerende endosomer (ii) inden for samme iskiasnerve axon (iii). De gule trekanter identificerer laster i bevægelse før tiden, de grønne cirkler/trekanter identificerer laster i retrograd bevægelse, og de orange cirkler/trekanter identificerer stationære laster. Anterograd bevægelse er fra venstre mod højre, mens retrograd bevægelse er i den modsatte retning. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: HCT-555 = stivkrampetoksinbindende domæne; CFP = cyan fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne protokol beskriver trin til vurdering in vivo axonal transport af signalendedosomer og mitokondrier i intakte axoner i musens iskiasnerve. Faktisk tilvejebringes en eksperimentel opsætning, der gør det muligt for brugerne at 1) skelne motoriske fra sensoriske neuroner in vivo, in situ og ex vivo ved hjælp af mus, der udtrykker fluorescerende reporterproteiner selektivt udtrykt i motorneuroner; 2) vurdere in vivo axonal transport af signalendedosomer specifikt i motorneuron axoner ved hjælp af tre forskellige transgene mus; 3) undersøge in vivo axonal transport af mitokondrier specifikt i motorneuron axoner; og 4) samtidig vurdere in vivo transportdynamik af signalering af endosomer og mitokondrier inden for samme axon. Denne tilgang har et stort potentiale til at undersøge aksonal transport under basale forhold og kan bruges til at vurdere patologiske forstyrrelser i forskellige sygdomme, der påvirker perifere motoriske og sensoriske nerver.

Ved hjælp af tidligere eksperimentelle paradigmer som fundament31,32 har vi her detaljerede nye, robuste måder at differentiere aksonal transport, der forekommer i motoriske versus sensoriske neuroner ved hjælp af transgene reportermus. Ved hjælp af Mito.CFP-musen er denne fremgangsmåde blevet videreudviklet til at vurdere in vivo mitokondrietransport ved at undgå intrasciatiske nerveinjektioner af TMRE36. Dette omgår mulige neurale skader og forstyrrelser i aksonal transport forårsaget af probens intranerve injektion. Desuden tillader denne protokol visualisering af aksonal transport af flere organeller i motoraksoner, der innerverer muskler med forskellige fysiologiske egenskaber (f.eks. hurtige træk fedtbare muskler vs. langsomme træthedsresistente muskler). Som sådan kan signalering af endosom og / eller mitokondrieaksonal transportdynamik vurderes i forskellige undergrupper af α-motoriske neuroner44. Desuden kan den aksonale transport af disse organeller i patologiske omgivelser også vurderes gennem krydsning med musemodeller af forskellige neurodegenerative sygdomme 1,2,3.

Det aksonale transportværktøjssæt udvides løbende28,29, og ex vivo-protokoller er blevet udviklet til at vurdere transportdynamikken ved hjælp af dyrkede museventrale horneksplolanter49 eller udskårne musenervemuskelpræparater50. Desuden har udviklingen af protokoller til vurdering af axonal transport i induceret human pluripotent stamcelle (hiPSC) afledte kortikale51 neuroner eller hiPSC-afledte spinalmotorneuroner52 muliggjort undersøgelse af humane neuroner med sygdomsfremkaldende mutationer. Sådanne banebrydende protokoller i musevæv og humane celler kan give kritisk indsigt i neuronal funktion, lette ny patomekanistisk opdagelse i neurodegenerative sygdomsmodeller og bruges til at teste terapeutiske molekyler og strategier.

Flere kritiske trin skal følges for en vellykket implementering af disse teknikker, og nogle vigtige noter er angivet i protokolafsnittet. De vigtigste krav til intravital billeddannelse er det omvendte konfokale mikroskop med tilpasset trinindsats og udstyret til at opretholde anæstesi og optimal temperatur. Faktisk er der behov for et specialiseret mobilt bedøvelsessystem til 1) induktion af anæstesi, 2) dissektion / vævsbehandling (dvs. udsættelse af iskiasnerven) og 3) opretholdelse af anæstesi under intravital billeddannelse (som tidligere beskrevet i 31,32). Især når du bruger højere forstørrelsesmål (f.eks. 40x eller 63x), kan anæstesidybden påvirke billedkvaliteten, da dybere anæstesi inducerer store 'gaspy' vejrtrækninger, der resulterer i hyppige skift i fokus. Sådanne store bevægelser vil utvivlsomt påvirke transportanalyser efter billeddannelse (f.eks. Sporing af laster ved hjælp af Fiji-plugins TrackMate53 eller KymoAnalyzer54), da vejrtrækningsbevægelserne producerer artefakter i time-lapse-videoer, der kan gøre dem uegnede til automatiseret sporing eller kræve mere tidskrævende vurdering. Desuden har vi også observeret billeddannelsesartefakter forårsaget af pulserende arterier i iskiasnerven, som kun kan løses ved at vælge en anden billeddannelsesregion. Mikroskopet skal være udstyret med et miljøkammer, der er i stand til at opretholde konstant kropstemperatur, da temperatur og pH påvirker aksonal transport55. Desuden bør anvendelse af smertestillende midler efter operationen undgås, da de kan ændre transportdynamikken56. Hvis forsøgsdesignet er tidssvarende og kræver gentagen billeddannelse (f.eks. 57), skal dissektionsprotokollerne justeres på passende vis, så de er minimalt invasive, og kan kræve yderligere etisk godkendelse/licensgodkendelse.

Visse eksperimentelle overvejelser skal tages i betragtning. For det første involverer de fleste af de protokoller, der er beskrevet heri, brugen af transgene mus, der besidder fluorescerende reporterproteiner i mitokondrier eller motorneuronaksoner. Hver af disse muselinjer skal opdrættes og afbildes som hemi-/heterozygote. Undtagelserne er dog ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato muselinjer, der kan opretholdes separat som homozygoter, med det resulterende hemizygote-afkom, der muliggør tdTomato-ekspression i kolinerge neuroner efter Cre-loxP-rekombination . Når man krydser transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. Mito.CFP) med andre transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. ChAT.eGFP), skal man nøje overveje avlsstrategien, da det kan være tidskrævende at opnå det ønskede antal dobbeltmutante afkom. Når man opdrætter F1-generationen af ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato-mus (dvs. ChAT.tdTomato) med yderligere transgene stammer (f.eks. Mito.CFP), bør man desuden forvente endnu færre mus, der bærer de ønskede tredobbelte transgener. Derudover skal man også overveje det potentielle fluoroforoverlap, når man opdrætter to-reportermus med nærliggende bølgelængdeegenskaber (f.eks. Mito-CFP-excitation: 435 nm, emission: 485 nm, opdrættet med ChAT.eGFP-excitation: 488 nm, emission: 510 nm), selvom det kan være muligt at overvinde dette problem med spektral ublanding58.

Denne teknik har nogle begrænsninger, der skal overvejes. I dette arbejde og vores tidligere protokoller31,32 har vi vist, hvordan flere genetisk kodede markører og forskellige farvningsmetoder kan bruges til at mærke og spore forskellige organeller in vivo. Imidlertid er ikke alle sonder egnede til denne eksperimentelle tilgang. Vi vurderede injektioner i enten TA eller soleus muskel af koleratoksin beta-underenhed (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 timer før billeddannelse), en sonde, der rutinemæssigt bruges til at mærke motorneuroncellelegemer i in vivo retrograde sporstofeksperimenter59,60. Men når den blev injiceret alene eller injiceret sammen med HCT-555, var CTB-488-mærkningen dårlig på trods af anvendelse af koncentrationer svarende til dem, der blev brugt til vellykket retrograd motorneuronsporing. Således konkluderer vi, at på trods af at CTB er en fremragende in vitro-markør for signalering af endosomer i neuronale kulturer61, forbliver HCT guldstandardproben til at identificere signalende endosomer in vivo i iskiasnerveaksoner.

Ved hjælp af forskellige ruter testede vi også sonder, der rutinemæssigt blev brugt til mærkning af lysosomer, såsom LysoTracker grøn DND-26, og markører af aktive lysosomale hydrolaser, såsom BODIPY-FL-pepstatin A for Cathepsin D62 og Magic Red for Cathepsin B, men uden succes. Vi prøvede intramuskulær levering af BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg i TA ~ 4 timer før billeddannelse) samt intrasciatisk nerveinjektion af 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) eller Magic Red (1/10) 30-60 min før billeddannelse. På trods af at disse sonder fremhævede nerven, kunne vi ikke finde tydeligt mærkede organeller. Sonderne akkumulerede omkring axoner, sandsynligvis bevaret af Schwann-celler. Derfor kan den mislykkede mærkning af lysosomer skyldes mangelfuld sondeafgivelse i neuroner, selvom eksistensen af mere egnede koncentrationer ikke kan udelukkes. I betragtning af at TMRE-mærkning fungerer under lignende forhold (dvs. intrasciatiske nerveinjektioner), kan mærkningsintensiteten være farvestofafhængig og skal testes for hver markør uafhængigt. Vi konkluderer imidlertid, at målretning af lysosomer in vivo med disse sonder ikke er mulig i de ovennævnte koncentrationer.

Anæstesimetoder kan ændre forskellige fysiologiske aflæsninger (f.eks. Cochlea-funktion63 og kortikal elektrofysiologi64); men om anæstesi påvirker in vivo axonal transport i iskiasnerven er i øjeblikket ukendt. I betragtning af den reducerede neuromuskulære aktivitet under isofluraninduceret anæstesi er det muligt, at transportkinetik adskiller sig i forhold til den vågne tilstand. Den eneste in vivo-undersøgelse, der direkte har undersøgt dette, afslørede imidlertid, at transport af tætte kernevesikler i thalamokortiske fremskrivninger ikke adskiller sig mellem bedøvede og vågne mus65. Da sondringer i transport mellem vildtype- og sygdomsmodelmus kan påvises under anæstesi35,43, er det desuden klart, at isofluraneksponering ikke forhindrer identifikation af forstyrrelser i signalering af endosom eller mitokondriehandel.

Denne protokol har andre potentielle anvendelser, som er beskrevet nedenfor. Opdræt af de transgene mus, der er skitseret i denne protokol (f.eks. Mito.CFP, ChAT.eGFP) med neurodegenerative sygdomsmusmodeller 1,2,3 vil muliggøre neuronundertype- og / eller lastspecifikke undersøgelser. Desuden ville nyligt udviklede muselinjer66 også tillade visualisering af fluorescerende reporterproteiner i forskellige sensoriske axonpopulationer. For eksempel kan Rosa26.tdTomato mus krydses med et neuropeptid Y receptor-2-ekspressive (Npy2r). Cre mus for at aktivere tdTomato fluorescens i myelinerede A-fiber nociceptorer67. Desuden kan tidsmæssig kontrol også opnås ved hjælp af inducerbare Cre-systemer (f.eks. Tamoxifen)68. En anden potentiel anvendelse er afhængig af tilgængeligheden af transgene mus, der udtrykker fluorescerende reporterproteiner i Schwann-celler. Faktisk muliggør S100-GFP69 og PLP-GFP70 mus in vivo og / eller in situ billeddannelse af Schwann-celler og har været i spidsen for forskning involveret i Schwann-cellemigration under perifer nerveregenerering.

Ud over disse anvendelser og som supplement til Mito.CFP-musen er tilgængeligheden af flere transgene muselinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner i forskellige organeller, såsom mitokondrier og autofagosomer. For eksempel kan det være muligt at undersøge in vivo mitokondrietransport med mito::mKate2 mus71 eller den fotokonverterbare mitoDendra mus57. Desuden kan in vivo mitophagosomtransport være mulig ved hjælp af den pH-følsomme mito-Keima mus72 og mito-QC mus73 til mitofagianalyser. Desuden kan de lysosomale mærkningsvanskeligheder, vi stødte på, overvindes ved hjælp af mus, der udtrykker LAMP1-GFP, med det forbehold, at LAMP1 også er til stede i endocytiske organeller, der adskiller sig fra lysosomer74.

Sammenfattende har vi givet nye måder at vurdere in vivo axonal transport af flere organeller i specifikke perifere nerveaksoner fra forskellige transgene mus. Den samtidige billeddannelse af forskellige organeller vil være særlig vigtig i betragtning af nylige fund af aksonale interaktioner og co-trafficking af organeller såsom mitokondrier og endosomer75,76. Vi mener, at de præsenterede metoder vil være nyttige til at forbedre forståelsen af axoners basale fysiologi in vivo og udrede vigtige patomechanismer, der driver neurodegeneration af perifere nerver.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for at dele ChAT-eGFP, ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus og Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for at dele HB9. GFP-mus. Vi vil gerne takke Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers og Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af et Junior Non-Clinical Fellowship fra Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z og 223022 / Z / 21 / Z) (GS), en UK Dementia Research Institute Foundation-pris (GS); og en medicinsk forskningsråds karriereudviklingspris (MR / S006990 / 1) (JNS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  2. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  3. De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
  4. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
  5. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  6. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  7. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
  8. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
  9. Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neuroscience. 321, 236-245 (2016).
  10. Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
  11. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
  13. Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
  14. Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
  15. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
  16. Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
  17. Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
  18. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  19. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  20. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
  21. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  22. Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
  23. Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
  24. Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
  25. Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
  26. Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
  27. Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
  28. Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
  29. Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
  30. Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
  31. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  32. Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
  33. Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
  34. Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
  35. Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
  36. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
  37. Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
  38. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
  39. Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
  40. Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
  41. Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
  42. Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
  43. Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
  44. Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
  45. Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
  46. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
  47. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
  48. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
  49. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
  50. Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
  51. Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
  52. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
  53. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  54. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  55. Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
  56. Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
  57. Bolea, I., Gan, W. -B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
  58. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
  59. Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
  60. Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
  61. Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
  62. Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
  63. Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
  64. Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  65. Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
  66. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  67. Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
  68. Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
  69. Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
  70. Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
  71. Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
  72. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  73. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  74. Cheng, X. -T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  75. Cioni, J. -M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
  76. Liao, Y. -C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 178
Udvidelse af værktøjssættet til <em>In Vivo-billeddannelse</em> af axonal transport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos,… More

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter