Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Utvidelse av verktøysettet for in vivo-avbildning av aksonal transport

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

Ved bruk av transgene fluorescerende mus beskrives detaljerte protokoller for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i motoriske og sensoriske aksoner av den intakte isjiasnerven hos levende dyr.

Abstract

Aksonal transport opprettholder nevronal homeostase ved å muliggjøre toveis handel med forskjellige organeller og laster. Forstyrrelser i aksonal transport har ødeleggende konsekvenser for individuelle nevroner og deres nettverk, og bidrar til en mengde nevrologiske lidelser. Siden mange av disse forholdene involverer både celleautonome og ikke-autonome mekanismer, og ofte viser et spekter av patologi på tvers av nevronale subtyper, er metoder for nøyaktig å identifisere og analysere nevronale delmengder avgjørende.

Dette papiret beskriver protokoller for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i isjiasnerver hos bedøvede mus. Trinnvise instruksjoner er gitt for å 1) skille motoriske fra sensoriske nevroner in vivo, in situ og ex vivo ved å bruke mus som selektivt uttrykker fluorescerende proteiner i kolinerge motorneuroner; og 2) separat eller samtidig vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier. Disse komplementære intravitale tilnærmingene letter samtidig avbildning av forskjellige laster i forskjellige perifere nerveaksoner for kvantitativt å overvåke aksonal transport i helse og sykdom.

Introduction

Det perifere nervesystemet (PNS) kobler sentralnervesystemet (CNS) til dets distale mål, slik at reléet av efferente signaler kan utøve motorisk kontroll og avferente signaler for å gi sensorisk tilbakemelding. Ved hjelp av de mange fremskrittene innen musegenetikk har forskere utviklet forskjellige musemodeller for å undersøke mange sykdommer / syndromer som rammer PNS 1,2,3. Siden de fleste nevrodegenerative patologier er multifaktorielle med celleautonome og ikke-autonome bidrag 4,5, kan untangling av celle- / nevronspesifikke patologier gi avgjørende, ny innsikt i sykdomsmekanismer.

For dette formål har utviklingen av bakterielle kunstige kromosom (BAC) -transgene mus6 muliggjort selektivt endogent uttrykk av fluorescerende proteiner i målrettede delmengder av nevroner. For eksempel er BAC-transgene mus tilgjengelige, som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i kolinerg7 eller glycinergiske nevroner8, eller en variant rødt fluorescerende protein (tdTomato) i parvalbumin-positive nevroner9. Alternativt kan selektivt nevronuttrykk av fluorescerende proteiner oppnås via Cre-loxP-teknologi 10. For eksempel kan musestammer som uttrykker Cre-recombinase i undergrupper av nevroner (f.eks. Kolin acetyltransferase (ChAT) -Cre) avles med mus som uttrykker et fluorescerende protein (f.eks. TdTomato eller GFP) fra et konstitutivt lokus (f.eks. Gt (ROSA) 26Sor) under kontroll av en transkripsjonell repressor flankert av loxP-steder11 (f.eks. genererer mus som uttrykker tdTomato bare i kolinerge nevroner). Faktisk, ved bruk av Cre-loxP-rekombinasjon, har transgene mus blitt generert som uttrykker gult fluorescerende protein i aksoner i den synkende kortikospinale kanalen12.

I tillegg muliggjør nylige fremskritt innen CRISPR / Cas9-genredigering, som ORANGE, fluorescerende merking av flere endogene nevronproteiner, med uttrykk som kan oppnås ved nanoskalaoppløsning13. Videre, i kombinasjon med Cre-uttrykkende musestammer, kan ORANGE-CAKE brukes til å merke flere endogene proteiner i individuelle nevroner13. Alternativt tillater viralmediert nevronsporing også merking av nevronale undergrupper og kan oppnås med målrettede kombinasjoner av virale serotyper og / eller cellespesifikke promotorer 14,15,16,17.

I tillegg til de nevrale merkingsmetodene har muselinjer også blitt konstruert for å uttrykke reporterproteiner rettet mot spesifikke organeller, for eksempel mitokondrier som uttrykker cyan fluorescerende protein (Mito.CFP)18 eller autofagosomer som uttrykker GFP (LC3.GFP)19. Videre har muselinjer blitt konstruert for å vurdere kalsiumdynamikk spesifikt i nevroner (f.eks. Thy1.GCaMP)20,21. Til sammen, med utviklingen av slike modeller, gjør nye eksperimentelle applikasjoner forskere i stand til å stille mer presise biologiske og patologiske spørsmål om CNS og PNS.

Hovedrollen til perifere motoriske nerver er å overføre elektriske signaler til skjelettmuskulatur for å fremkalle bevegelse. I tillegg, og forekommer over lengre tidsskalaer, krysser nevrokjemiske og fysiologiske meldinger i form av forskjellige organeller (f.eks. Mitokondrier, endolysosomer, signalende endosomer) cytoskeletalnettverket på en uni- eller toveis måte for å opprettholde nevronal homeostase 22,23,24. Svekkelser i aksonal transport har katastrofale konsekvenser for nevronhelsen og er knyttet til mange nevrodevelopmentale og neurodegenerative sykdommer25. På molekylært nivå kan svekkelser i aksonal transport forstyrre fysiologiske hendelser som regulerer synaptisk signalering og plastisitet, gentranskripsjon og lokal oversettelse gjennom hele aksonet26,27. Mens det er en rekke verktøy for å studere disse hendelsene i dyrkede celler / nevroner28,29, er det nødvendig å vurdere aksonal transportdynamikk og aksonale koblede biologiske hendelser in vivo for å bekrefte nøkkelinnsikt i fysiologiske og patologiske prosesser30.

Gjennom årene har Schiavo-laboratoriet optimalisert protokoller for å stille forskjellige spørsmål om aksonal transport 31,32,33,34,35,36. Disse forsøkene har utvidet seg fra oppdagelsen av at et fluorescerende merket atoksisk fragment av tetanusneurotoksin (HCT) internaliseres til aksonterminaler i skjelettmuskulatur gjennom interaksjoner med nidogener og polysialogangliosider37. Når internalisert, blir HCT retrograd transportert i Rab7-positive, nevrotrofinholdige signalende endosomer som er bestemt for cellelegemene til motoriske og sensoriske nevroner 38,39,40,41. Parallelt har fremskritt innen bildebehandlingsteknologi muliggjort sanntidsanalyse av perifere nervebunter og individuelle aksoner i levende, bedøvede mus30. Det første forsøket på å vurdere in vivo aksonal transportdynamikk i patologi avslørte presymptomatiske svekkelser i transporten av signalende endosomer og mitokondrier i SOD1G93A-musemodellen for amyotrofisk lateral sklerose (ALS)35. Det er viktig at disse feilene ikke bare representerer sekundære konsekvenser av nevrodegenerasjon, gitt funnet at motorneurontap kan oppstå i fravær av aksonale transportforstyrrelser i en musemodell av Kennedys sykdom42 og en heterozygot mutant FUS-modell av ALS43. Slike aksonale transportunderskudd kan avhjelpes hos ALS-mus ved bruk av hemmere av spesifikke kinaser33 eller vekstfaktorreseptorer34. Videre endrer behandling av nevroner med en spesifikk histon deacetylaseblokker mitokondriell transport in vivo36. Senest rapporterer vi at den BDNF-avhengige moduleringen av aksonal transport er dysregulert i forskjellige motornevronundertyper i ALS-mus44.

Ved å bruke et stadig voksende verktøysett for å vurdere aksonal transportdynamikk28,29, skisserer denne videoprotokollen flere applikasjoner som vil gi ytterligere innsikt i forskjellige biologiske og patologiske scenarier. For det første brukes transgene mus som selektivt uttrykker fluorescerende proteiner i kolinerge nevroner (dvs. motorneuroner) til å diskriminere mellom motoriske og sensoriske aksoner både in vivo og ex vivo. Fluorescerende merket HCT lastes deretter inn i signalende endosomer i tre transgene linjer for å differensiere aksonal transportdynamikk i forskjellige perifere nevroner. Den neste eksperimentelle protokollen beskriver en multipleks fluorescensmetode for å vurdere mitokondriell transport spesielt i motorneuroner ved å avle ChAT.tdTomato-mus med Mito-CFP-mus. Til slutt blir det gitt instruksjoner om hvordan man samtidig kan avbilde mitokondrier og signalisere endosomer innenfor samme akson in vivo.

Protocol

All musehåndtering og eksperimenter ble utført i samsvar med Animals (Scientific Procedures) Act (1986) og ble godkjent av University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee.

1. Dyr

  1. Hus alle dyr i individuelt ventilerte bur i et temperatur- og fuktighetskontrollert miljø og vedlikehold dem på en 12 timers lys / mørk syklus med ad libitum tilgang til mat og vann.
  2. Bruk både hann- og hunnmus av følgende transgene stammer: 1) heterozygot Tg (Chat-EGFP) GH293Gsat / Mmucd mus, referert til som ChAT.eGFP mus; 2) heterozygot B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, referert til som HB9. GFP mus; og 3) heterozygote B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, referert til som Mito.CFP mus.
  3. Generer ChAT.tdTomato mus ved å krysse homozygote B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, referert til som ChAT.Cre mus, med homozygote B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, referert til som Rosa26.tdTomato mus.
  4. Generer ChAT.tdTomato::Mito.CFP mus ved å krysse heterozygote ChAT.tdTomato mus med heterozygote Mito.CFP mus.

2. Intramuskulære injeksjoner av fluorescerende HCT

  1. Forberedelse før kirurgi
    1. Express HCT (HCT441, rester 875-1315) smeltet til en forbedret cysteinrik tag i bakterier som et glutation-S-transferase fusjonsprotein per 45. Merk HCT med AlexaFlour555 C2 maleimid31, dialyse den i iskald dialysebuffer (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7,4), frys den i flytende nitrogen og oppbevar den ved -80 °C. Før du utfører in vivo eksperimenter, må du først teste HCT in vitro for vellykket opptak og transport i primære nevroner.
    2. Fortynn fluorescerende HCT (f.eks. HCT-555) til en endelig og eksperimentelt konsistent konsentrasjon fra 2,5 til 10 μg/μL i steril fosfatbufret saltvann (PBS) i et rør på 0,2 ml. På dette trinnet, legg til flere forbindelser / faktorer til HCT-løsningen om nødvendig (f.eks. Hjerneavledet nevrotrofisk faktor).
      MERK: Det endelige volumet må være passende for størrelsen på muskelen (e) av interesse. Forbered for eksempel et injeksjonsvolum på 3-4 μL for tibialis anterior (TA) muskel og ~ 1 μL for den mindre soleusmuskelen. Hold arbeidskonsentrasjonen av HCT mellom 2,5 og 10 μg / μL uavhengig av sluttvolumet.
    3. Bland HCT-oppløsningen med en pipette eller virvel, og spinn kort ned ved lav hastighet ved hjelp av en stasjonær sentrifuge for å samle væsken og fjerne store bobler. Beskytt HCT mot lys og transport på is.
    4. Bruk en mikropipette i pulled glass for optimale intramuskulære injeksjoner i mindre muskler (f.eks. soleus) eller for intrasciatic nerveinjeksjoner. Trekk graderte glassmikropipetter (per 46) før operasjonen.
      MERK: For å muliggjøre pipettering og begrense strømmen opp og ut på baksiden av mikropipetten, bryt forsiktig av et lite stykke fra den skarpe spissen ved hjelp av fine tang under et dissekerende mikroskop. Pass på å kaste den ødelagte enden i riktig søppelkasse.
    5. Steriliser og rengjør alle kirurgiske verktøy før bruk.
  2. Kirurgi-intramuskulære injeksjoner
    1. Forbered deg på kirurgi ved å sikre en steril kirurgisk drapering på en varmematte satt til 37 °C. Plasser og fokuser driftsmikroskopet. For at operasjonen skal starte, pakk ut på kirurgisk drapering de presteriliserte kirurgiske verktøyene, kirurgisk tape, steril bomullspinne, 70% (v / v) etanol i vann, steril saltvann, suturer og en Hamilton-nål eller trukket glassmikropipetter.
    2. Forsikre deg om at bedøvelsesmaskinen har tilstrekkelig oksygen og isofluran i løpet av den kirurgiske prosedyren. Rett strømmen av anestesi til induksjonskammeret og slå på bedøvelsesmaskinen.
      1. For å begynne, bruk en oksygenstrømningshastighet på 1-2 l / min og 5% isofluran. Plasser musen i induksjonskammeret for å starte anestesi. Når høyrerefleksen er fraværende, reduser anestesi til 2-3% isofluran, diriger strømmen av anestesi til munnstykket og overfør musen til munnstykket som ligger i et eget område av kirurgisk rom.
    3. Forsikre deg om at både hornhinnen og pedaluttaksrefleksene er fraværende før du barberer området med pels som dekker muskelen (e) som skal injiseres. Når du er ferdig, fjern så mye barbert pels fra musen som mulig ved hjelp av den klebrige siden av kirurgisk tape, og plasser musen på veievekter for å registrere den prekirurgiske vekten.
    4. Påfør øyesmøremiddel forsiktig med en bomullspinne og overfør musen og munnstykket til det kirurgiske området.
      MERK: Prøv å begrense mengden barbert pels som også overføres til det kirurgiske området. Bruk kirurgisk tape for å feste hodet til munnstykket for å forhindre at musen glir ut. Bruk en separat bomullspinne til å påføre etanol til det barberte området for å sterilisere og redusere pelsforurensning.
    5. Plasser kroppen i henhold til muskelen som skal injiseres. For TA, for eksempel, plasser musen på ryggen og strekk ut bakbenet ved ~ 10 ° fra midtlinjen. Alternativt, for soleus injeksjoner, plasser dyret på sin side og utvide bakbenet på ~ 45 ° fra midtlinjen. Når bakbenet er i riktig posisjon, bruk kirurgisk tape over foten for å forhindre uønsket bevegelse under operasjonen.
      MERK: Injeksjonsprosedyrene for TA, gastrocnemius og soleus muskler har tidligere blitt beskrevet32.
    6. Før du gjør et snitt, bekreft at anestesien er tilstrekkelig ved å teste pedaluttaksrefleksen. Overvåk anestesien kontinuerlig og oppretthold den gjennom hele den kirurgiske prosedyren med regelmessig vurdering av pusten og uttaksrefleksen.
    7. På dette tidspunktet trekker du den fungerende HCT-løsningen inn i Hamilton-sprøyten eller mikropipetten i trukket glass.
    8. Gjør et lite snitt over muskelen (e) av interesse for området (e) som tilsvarer de motoriske endeplateområdene 46,47,48. Pierce den ytre fascia på muskelen og sakte injisere HCT som per 32. La sprøyten/mikropipetten stå på plass i 5-10 s før den trekkes sakte opp.
    9. Lukk snittene med 1-2 suturer og overfør musen til et isolert gjenopprettingsbur. Overvåk musen etter operasjonen i minst 30 minutter, før du returnerer den til hjemmeburet. Når musen har gjenopprettet og etter kirurgisk overvåking er fullført, returner buret til normale boligforhold.

3. In vivo aksonal transport

  1. Utsette isjiasnerven
    1. Sett mikroskopets miljøkammer til 37 °C minst 1 time før avbildning.
    2. Forbered deg på å eksponere isjiasnerven ved å ordne kirurgisk drapering, verktøy, tape, steril bomullspinne, 70% etanol og steril saltvann rundt det kirurgiske området. Sørg for at bedøvelsesmaskinen har tilstrekkelige lagre av oksygen og isofluran i opptil 2 timer per mus. Lag en kile av parafilm eller usynlig tape ved å kutte den i et smalt rektangel (f.eks. ~ 1 cm bredde for større mus) med en vinklet spiss og plasser den under den eksponerte isjiasnerven for å hjelpe bildeprosessen. Plasser induksjonskammeret på toppen av en varmematte og sett den til kroppstemperatur.
      MERK: Fire timer er god tid for HCT å ha blitt tatt opp og retrograd transportert fra injeksjonsstedet til isjiasnerven; derfor kan en enkelt mus klargjøres for re-anestesi etter denne tiden.
    3. Rett strømmen av anestesi inn i induksjonskammeret, slå på bedøvelsesmaskinen med en oksygenstrømningshastighet på 1-2 l / min og 3-4% isofluran, og plasser musen i induksjonskammeret for å starte anestesi.
      MERK: Siden in vivo aksonal transporteksperimentet er en terminal prosedyre, er det ikke nødvendig å smøre øynene.
    4. Når høyrerefleksen er fraværende, reduser anestesi til 2-3% isofluran, rett strømmen av anestesi til munnstykket og overfør musen til munnstykket. Bruk kirurgisk tape for å feste hodet til munnstykket, forleng den målrettede bakbenet ved ~ 45 ° fra midtlinjen, og bruk kirurgisk tape over foten for å opprettholde denne posisjonen.
      MERK: Redusert anestesi er fordelaktig på dette tidspunktet, da det kan begrense virkningen av pusteartefakter under bildebehandlingsprosessen.
    5. Sørg for at hornhinne- og pedalabstinensreflekser er fraværende, og bruk deretter saks for å kutte bort huden som ligger over isjiasnerven32 (dvs. et stort område som strekker seg fra den sentrale ryggmargen til midten av nedre bakben). Fjern den overliggende biceps femoris muskelen, så vel som enhver annen muskulatur og bindevev som er nær isjiasnerven. Unngå å skade isjiasnerven og omkringliggende blodkar, spesielt de som ligger nær det laterale aspektet av patella / proksimalt aspekt av lateral gastrocnemiushodet.
    6. Når den intakte isjiasnerven er tilstrekkelig utsatt, bruk prewarmed steril saltvann til området rundt isjiasnerven for å forhindre uttørking. Bruk buede tang for å forstyrre det dyptliggende bindevevet og plasser den ferdig forberedte parafilmkilen under nerven. Når du er ferdig, plasser saltvannsdynket bomullsull på det eksponerte området og flytt musen inn i induksjonskammeret plassert på toppen av varmematten (satt til 37 °C), som fortsatt skal fylles med isofluran i O2.
  2. In vivo aksonal avbildning
    1. Plasser et 22 x 64 mm deksel på det tilpassede mikroskoptrinnet og fest posisjonen med tape. Velg og bruk nedsenking olje til målet, og koble deretter mikroskopstadiet til det inverterte mikroskopet. Løft det oljenede målet sakte til det kommer i kontakt mellom oljen og dekselet.
      MERK: Enten 40x, 1,3 numerisk blenderåpning (NA) DIC Plan-Apochromat eller 63x, 1,4 NA DIC Plan-Apochromat olje-nedsenking mål kan brukes til å avbilde in vivo transport i isjiasnerven.
    2. Flytt bedøvelsesmunnstykket på mikroskopstadiet og fest anestesislangene med tape for å forhindre forstyrrelse av anestesien. Fjern bomullsullen fra isjiasnerven og overfør musen fra induksjonskammeret til munnstykket, med den eksponerte nerven vendt mot dekselglasset. Bruk kirurgisk tape for å sikre at musens hode er festet til munnstykket og opprettholde det laveste, effektive anestesinivået. Løft musen forsiktig etter halen og legg steril saltvann til dekslene nær den eksponerte isjiasnerven for å begrense uttørking og hjelpe avbildning.
      MERK: Lukk alle dører til miljøkammeret for å sikre at området forblir ved kroppstemperatur.
    3. Bruk okularet, finn isjiasnerven, bestem det optimale fokuspunktet, og velg et interesseområde som inneholder motile aksonale organeller.
      MERK: En detaljert forklaring av denne prosessen er tidligere beskrevet32.
    4. Bytt til dataprogramvaren ved å klikke anskaffelsesknappen (eller tilsvarende), og velg et interesseområde. Bruk en digital zoom for å oppnå totalt >80x forstørrelse og roter det valgte området for å visualisere aksonene horisontalt (f.eks. høyre-til-venstre-bevegelig retrograd last og venstre-til-høyre-bevegelig anterograd last).
      MERK: Retningsparameterne er brukeravhengige, men må være konsekvente gjennom eksperimenter.
    5. Optimaliser signalintensiteten ved å justere parametere som laserintensitet (0,2 - 1 %), nåhullsåpning (1 AU - maks), forsterkning (Master) (700 - 1000), digital offset (-50 - 0) og digital forsterkning (1,0 - 4,0). For å redusere den potensielle påvirkningen av fototoksisitet, oppretthold laserintensiteten på ≤ 1% der det er mulig, med en maksimal laserintensitet på 2%. Endre alle andre parametere før du justerer laserintensiteten for optimal signaldeteksjon.
    6. Klikk Områder-boksen (eller tilsvarende), velg et rektangulært interesseområde, angi deretter bildestørrelsen til minimum 1024 x 1024 piksler i anskaffelsesmodus (eller tilsvarende), og start time-lapse-innhenting av 100–1 000 bilder.
      MERK: Ønsket bildeinnhentingshastighet er brukeravhengig (f.eks. transport kan vurderes med bildefrekvenser mellom 0,1 og 6 s) og kan justeres med programvareparametere, for eksempel interesseområde, skannehastighetstid, anskaffelsesgjennomsnitt og laserretning. For eksempel, for å oppnå en lavere bildefrekvens, øk høyden / bredden på interesseområdet, oppnå langsommere skannehastigheter, øk anskaffelsesgjennomsnittet og bruk enkelt laserretning, og omvendt for en raskere bildefrekvens. Rammeinnsamlingsfrekvensen må forbli konsistent på tvers av sammenlignbare datasett fordi avbildning ved forskjellige frekvenser kan forårsake inkonsekvenser. Raske laster som signalende endosomer krever en raskere bildefrekvens (f.eks. 0,1-3 s) sammenlignet med langsommere organeller som mitokondrier som kan analyseres med en langsommere hastighet (f.eks. 2,5-6 s).
    7. Målet er å fange minst 10 bevegelige laster fra minimum tre aksoner per mus.
      MERK: Basert på to-sample, tosidige effektberegninger (med standard effekt på 0,8 (1-β) og type I feilrate på 5% (α)), er utvalgsstørrelser på 6-8 tilstrekkelig til å identifisere aksonale transportforskjeller mellom villtype og sykdomsmodeller35,43.
    8. Når avbildningen er fullført, avliv musen umiddelbart mens du er under anestesi (f.eks. Cervikal dislokasjon). Post mortem vev, som muskler og isjiasnerver, kan også høstes for videre analyse.

Representative Results

Denne artikkelen beskriver en allsidig protokoll som utvider in vivo aksonal transportverktøykasse i gnagermodeller. Figur 1 viser at motornevronaksoner kan differensieres fra både sensoriske nevronaksoner og Schwann-celler ved hjelp av transgene mus. Figur 1A viser eGFP-uttrykk i kolinerge motoraksoner fra en levende, bedøvet ChAT.eGFP-mus. Figur 1B bruker en alternativ metode for å oppnå tdTomato-ekspresjon i en nyskåret nerve (dvs. ingen ekstra vevsbehandling) fra en ChAT.tdTomato-mus. Derfor muliggjør bruk av transgene stammer som ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato eller Hb9.GFP motoraksonspesifikk merking in vivo.

Alternativt kan aksoner også identifiseres ved å injisere sporstoffer/markører (f.eks. HCT31,32 eller virus som koder for eGFP15) i skjelettmuskulaturen. Figur 2 fremhever en slik applikasjon, som viser åtte robust uttrykk chAT.eGFP-positive aksoner som inneholder HCT-555-positive signalende endosomer (hvite piler), ~ 4 timer etter sondeinjeksjon i TA-muskelen. Ved hjelp av denne eksperimentelle designen kunne vi identifisere TA-innerverende α-motoriske nevroner, som hovedsakelig er utmattelige44. Ytterligere fem ChAT.eGFP-aksoner med mindre robust eGFP-uttrykk (figur 2A, oransje stjerner) var delvis ute av fokus og sannsynligvis lokalisert litt dypere inne i isjiasnerven.

Videre identifiserte vi HCT-555-positive signalende endosomer i eGFP-negative sensoriske aksoner (gule piler). Som sådan, ved hjelp av dette eksperimentelle paradigmet, kan man spesifikt vurdere og sammenligne den aksonale transporten av signalende endosomer i motoriske versus sensoriske nevroner in vivo. Faktisk, ved hjelp av denne transgene reporterstammen, oppdaget vi at transport av signalende endosomer i ChAT.eGFP-positive motoraksoner er raskere enn i ChAT.eGFP-negative sensoriske aksoner, som kan differensieres pålitelig ved hjelp av aksonbredder43.

Vi har tidligere identifisert motornevronaksoner ved hjelp av ChAT.eGFP-musen in vivo43. Vi rapporterer nå at HB9. GFP mus kan også brukes til å oppnå motor neuron axon identifikasjon in vivo. Faktisk presenterer figur 3 en serie time-lapse-bilder av HB9. GFP-aksoner som inneholder retrograd bevegelige HCT-555-positive signalende endosomer. Merk at, i motsetning til ChAT-drevet uttrykk, har GFP et mer punktlig / granulært mønster i HB9. GFP aksoner; årsaken til dette er uklar.

Vi har tidligere beskrevet hvordan man kan overvåke mitokondriell dynamikk in vivo i isjiasnervene via intrasciatiske nerveinjeksjoner av mitokondrielt rettet fargestoff, tetrametylrhodamin, etylester, perklorat (TMRE)32,36. For pålitelig å skille motoriske versus sensoriske mitokondrier, kan Mito.CFP-musen, som uttrykker CFP under Thy1-promotoren 18, krysses med transgene mus som uttrykker et fluorescerende reportergen i bestemte nevrontyper. Faktisk, ved å avle Mito.CFP-mus med ChAT.tdTomato-mus (referert til som ChAT.tdTomato::Mito.CFP), kunne vi visualisere mitokondrier spesielt i motoraksoner, som vist i figur 4. I dette levende multiplekseksemplet kan fem ChAT.tdTomato-aksoner visualiseres, hvorav fire inneholder CFP-positive mitokondrier. Videre kunne noden til Ranvier (hvit pil i panel iii) også identifiseres. Videre er nodene til Ranvier tydelig påviselige i ChAT.eGFP, HB9. GFP- og Mito.CFP-mus (ikke vist). Disse dobbelttransgene stammene muliggjør time-lapse intravital avbildning av levende, bedøvede mus for å overvåke motorneuronspesifikt mitokondrielt innhold og aksonal transportdynamikk.

Endelig kan signalende endosomer og mitokondrier visualiseres samtidig innenfor de samme aksonene in vivo ved å injisere HCT i musklene til Mito.CFP-mus (figur 5). Intramuskulære injeksjoner av HCT-555 ble utført i TA-muskel i en Mito.CFP-mus ~4 timer før bildediagnostikk. Både mitokondrier (i-paneler) og signalende endosomer (ii-paneler) ble samtidig visualisert i muskelspesifikke aksoner (dvs. aksoner som innerverer TA). Faktisk kan anterogradely (gule trekanter) og retrograd (grønne trekanter og sirkler) bevegelige organeller samt stalled organeller (oransje trekanter og sirkler) observeres. Ved hjelp av dette eksperimentelle paradigmet kan man vurdere de komplekse funksjonelle interaksjonene mellom aksonale mitokondrier og signalende endosomer in vivo. Samlet sett demonstrerer vi flere forskjellige eksperimentelle tilnærminger for å vurdere aksonal transport av signalende endosomer og / eller mitokondrier, spesielt i kolinerge motorneuroner in vivo.

Figure 1
Figur 1: Isjiasnervemotoriske aksoner. (A) Representativt enkeltplanbilde av eGFP-positive motoraksoner oppnådd in vivo fra en ChAT.eGFP-mus. (B) Representativt enkeltplanbilde av tdTomato-positive motoraksoner i en utskåret isjiasnerve fra en ChAT.tdTomato-mus. Forskjeller i aksonkaliber skyldes forskjeller i musens alder og størrelse. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ChAT = kolin acetyltransferase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: In vivo aksonal transport av signalende endosomer i levende isjiasnervemotoriske og sensoriske nevroner i en ChAT.eGFP-mus. (A-C) Representative bilder av kolinerge aksoner som uttrykker eGFP (A) og inneholder HCT-555-positive signalende endosomer (B), og flettingen (C). De hvite pilene fremhever en eGFP-positiv motorakson som inneholder HCT-555-positive signalende endosomer, cyanpilene identifiserer en motorakson som mangler HCT-555-positive signalende endosomer, og de gule pilene fremhever en eGFP-negativ sensorisk akson som transporterer HCT-555-positive signalende endosomer. Oransje stjerner identifiserer motoraksoner med svakere eGFP-uttrykk. Skala bar = 25 μm. Forkortelser: eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; ChAT = kolin acetyltransferase; HCT-555 = tetanustoksinbindende domene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Time-lapse bildeserier som representerer in vivo aksonal transport av signalende endosomer i levende motorneuroner i en HB9. GFP mus. (AD) Timelapse-bilder tatt hver 3 s som viser motornevronaksoner som uttrykker grønt fluorescerende protein (i) og inneholder HCT-555-positive signalende endosomer (ii), og flettingen (iii). Hver sirkel av samme farge identifiserer det samme bevegelige endosomet på tvers av forskjellige rammer. Retrograd bevegelse er fra høyre til venstre. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; HCT-555 = tetanustoksinbindende domene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: In vivo aksonal transport av mitokondrier i levende isjiasnervemotorneuroner av en ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: mus. (A-C) Representative bilder av tdTomato-positive motoraksoner (A), som inneholder CFP-positive mitokondrier (B), og flettingen (C). De innfelte bildene i-iii inneholder en høyere forstørrelse fra hvert panel. Den hvite pilen representerer en mistenkt node av Ranvier. Skalastenger = 25 (A-C) og 10 μm (i-iii). Forkortelser: ChAT = kolin acetyltransferase; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse-bildeserier som representerer samtidig in vivo aksonal transport av mitokondrier og signaliserer endosomer i levende isjiasnervemotorneuroner i en Mito.CFP-mus. (A-C) Timelapse-bilder tatt hver 3 s som viser aksonal transport av både mitokondrier (i) og signalerende endosomer (ii) innenfor samme isjiasnerveakson (iii). De gule trekantene identifiserer laster i anterograd bevegelse, de grønne sirklene/trekantene identifiserer retrograd bevegelige laster, og de oransje sirklene/trekantene identifiserer stasjonære laster. Anterograd bevegelse er fra venstre til høyre, mens retrograd bevegelse er i motsatt retning. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: HCT-555 = tetanustoksinbindende domene; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Denne protokollen beskriver trinn for å vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer og mitokondrier i intakte aksoner av musens isjiasnerve. Faktisk er det gitt et eksperimentelt oppsett som gjør det mulig for brukere å 1) skille motoriske fra sensoriske nevroner in vivo, in situ og ex vivo ved å bruke mus som uttrykker fluorescerende reporterproteiner selektivt uttrykt i motorneuroner; 2) vurdere in vivo aksonal transport av signalende endosomer spesielt i motornevronaksoner ved bruk av tre forskjellige transgene mus; 3) undersøke in vivo aksonal transport av mitokondrier spesielt i motor neuron axoner; og 4) samtidig vurdere in vivo transportdynamikk av signalende endosomer og mitokondrier innenfor samme akson. Denne tilnærmingen har stort potensial for å undersøke aksonal transport under basale forhold og kan brukes til å vurdere patologiske forstyrrelser i forskjellige sykdommer som påvirker perifere motoriske og sensoriske nerver.

Ved å bruke tidligere eksperimentelle paradigmer som grunnlag31,32, har vi her detaljerte nye, robuste måter å skille aksonal transport som forekommer i motoriske versus sensoriske nevroner ved hjelp av transgene reportermus. Ved hjelp av Mito.CFP-musen har denne tilnærmingen blitt videreutviklet for å vurdere mitokondriell transport in vivo ved å unngå intrasciatiske nerveinjeksjoner av TMRE36. Dette omgår mulige nevrale skader og forstyrrelser i aksonal transport forårsaket av den intranerve injeksjonen av sonden. Videre tillater denne protokollen visualisering av aksonal transport av flere organeller i motoraksoner som innerverer muskler med distinkte fysiologiske egenskaper (f.eks. hurtigtrekkende utmattende muskler vs. sakte rykninger tretthetsresistente muskler). Som sådan kan signalende endosom og / eller mitokondriell aksonal transportdynamikk vurderes i forskjellige undergrupper av α-motorneuroner44. Videre kan den aksonale transporten av disse organellene i patologiske omgivelser også vurderes gjennom kryssavl med musemodeller av forskjellige nevrodegenerative sykdommer 1,2,3.

Det aksonale transportverktøyet utvides kontinuerlig28,29, og ex vivo-protokoller er utviklet for å vurdere transportdynamikk ved hjelp av dyrkede museventrale horn explants49 eller skåret ut mus nervemuskelpreparater50. Videre har utviklingen av protokoller for å vurdere aksonal transport i indusert human pluripotent stamcelle (hiPSC)-avledet kortikal51 nevroner eller hiPSC-avledede spinalmotorneuroner52 muliggjort undersøkelse av humane nevroner med sykdomsfremkallende mutasjoner. Slike banebrytende protokoller i musevev og humane celler kan gi kritisk innsikt i nevronfunksjonen, legge til rette for ny pathomechanistisk oppdagelse i nevrodegenerative sykdomsmodeller, og brukes til å teste terapeutiske molekyler og strategier.

Flere kritiske trinn må følges for en vellykket implementering av disse teknikkene, og noen viktige notater er gitt i protokolldelen. De viktigste kravene til intravital avbildning er det inverterte konfokale mikroskopet med tilpasset sceneinnsats og utstyret for å opprettholde anestesi og optimal temperatur. Faktisk er det nødvendig med et spesialisert mobilbedøvelsessystem for 1) induksjon av anestesi, 2) disseksjon / vevsbehandling (dvs. eksponering av isjiasnerven) og 3) opprettholdelse av anestesi under intravital avbildning (som tidligere beskrevet i 31,32). Spesielt når du bruker høyere forstørrelsesmål (f.eks. 40x eller 63x), kan anestesidybden påvirke bildekvaliteten, da dypere anestesi induserer store "gaspy" pust som resulterer i hyppige skift i fokus. Slike store bevegelser vil utvilsomt påvirke transportanalyser etter bildebehandling (f.eks. sporing av laster ved hjelp av Fiji-pluginene TrackMate53 eller KymoAnalyzer54) ettersom pustebevegelsene produserer artefakter i time-lapse-videoer som kan gjøre dem uegnet for automatisert sporing eller kreve mer tidkrevende vurdering. Videre har vi også observert bildeartefakter forårsaket av pulserende arterier i isjiasnerven, som bare kan løses ved å velge et annet bildebehandlingsområde. Mikroskopet må være utstyrt med et miljøkammer som er i stand til å opprettholde konstant kroppstemperatur, da temperatur og pH påvirker aksonal transport55. Videre bør bruk av analgetika etter kirurgi unngås, da de kan endre transportdynamikk56. Hvis det eksperimentelle designet er langsgående og krever gjentatt avbildning (f.eks. 57), må disseksjonsprotokollene justeres hensiktsmessig for å være minimalt invasive og kan kreve ytterligere etisk / lisensgodkjenning.

Visse eksperimentelle hensyn må tas i betraktning. For det første involverer de fleste protokollene som er beskrevet her, bruk av transgene mus som har fluorescerende reporterproteiner i mitokondrier eller motorneuronaksoner. Hver av disse muselinjene skal avles og avbildes som hemi-/heterozygote. Unntakene er imidlertid ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato muselinjer som kan opprettholdes separat som homozygoter, med de resulterende hemizygote avkomene som muliggjør tdTomato-uttrykk i kolinerge nevroner etter Cre-loxP-rekombinasjon . Ved kryssavl av transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. Mito.CFP) med andre transgene hemi-/heterozygote mus (f.eks. ChAT.eGFP), må man nøye vurdere avlsstrategien, da det kan være tidkrevende å oppnå ønsket antall dobbeltmutantavkom. Videre, når man avler F1-generasjonen av ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus (dvs. ChAT.tdTomato) med ekstra transgene stammer (f.eks. Mito.CFP), bør man forvente enda færre mus som bærer de ønskede trippeltransgene. I tillegg må man også vurdere den potensielle fluoroforoverlappingen når man avler to-reportermus med nærliggende bølgelengdeegenskaper (f.eks. Mito-CFP-eksitasjon: 435 nm, utslipp: 485 nm, avlet med ChAT.eGFP-eksitasjon: 488 nm, utslipp: 510 nm), selv om det kan være mulig å overvinne dette problemet med spektral blanding58.

Denne teknikken har noen begrensninger som skal vurderes. I dette arbeidet og våre tidligere protokoller31,32 har vi vist hvordan flere genetisk kodede markører og forskjellige fargemetoder kan brukes til å merke og spore forskjellige organeller in vivo. Imidlertid er ikke alle prober egnet for denne eksperimentelle tilnærmingen. Vi vurderte injeksjoner i enten TA- eller soleusmuskel av koleratoksin beta-subenhet (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 timer før avbildning), en sonde som rutinemessig brukes til å merke motornevroncellelegemer i in vivo retrograde tracereksperimenter59,60. Imidlertid, når den ble injisert alene eller co-injisert med HCT-555, var CTB-488-merkingen dårlig til tross for bruk av konsentrasjoner som ligner de som brukes til vellykket retrograd motorneuronsporing. Dermed konkluderer vi med at til tross for at CTB er en utmerket in vitro-markør for signaliserende endosomer i nevronkulturer61, forblir HCT gullstandardsonden for å identifisere signalende endosomer in vivo i isjiasnerveaksoner.

Ved hjelp av forskjellige ruter testet vi også prober som rutinemessig brukes til merking av lysosomer, for eksempel LysoTracker grønn DND-26, og markører for aktive lysosomale hydrolaser, som BODIPY-FL-pepstatin A for Cathepsin D62 og Magic Red for Cathepsin B, men uten suksess. Vi prøvde intramuskulær tilførsel av BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg i TA ~4 timer før bildediagnostikk), samt intrasciatic nerveinjeksjon av 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) eller Magic Red (1/10) 30-60 min før bildediagnostikk. Til tross for at disse sondene fremhevet nerven, klarte vi ikke å finne tydelig merkede organeller. Sondene samlet seg rundt aksoner, sannsynligvis beholdt av Schwann-celler. Derfor kan den mislykkede merkingen av lysosomer skyldes mangelfull sondelevering i nevroner, selv om eksistensen av mer egnede konsentrasjoner ikke kan utelukkes. Gitt at TMRE-merking fungerer under lignende forhold (dvs. intrasciatic nerveinjeksjoner), kan merkingsintensiteten være fargeavhengig og må testes for hver markør uavhengig. Vi konkluderer imidlertid med at målretting av lysosomer in vivo med disse probene ikke er mulig ved konsentrasjonene angitt ovenfor.

Anestesimetoder kan endre distinkte fysiologiske avlesninger (f.eks. cochleafunksjon63 og kortikal elektrofysiologi64); Hvorvidt anestesi påvirker in vivo aksonal transport i isjiasnerven er imidlertid foreløpig ukjent. Gitt den reduserte nevromuskulære aktiviteten under isofluranindusert anestesi, er det mulig at transportkinetikken varierer sammenlignet med våken tilstand. Den eneste in vivo-studien som direkte har undersøkt dette, viste imidlertid at transport av tette kjernevesikler i thalamokortiske fremspring ikke skiller seg mellom bedøvede og våkne mus65. Videre, fordi forskjeller i transport mellom villtype og sykdomsmodellmus kan påvises under anestesi35,43, er det klart at isofluraneksponering ikke forhindrer identifisering av forstyrrelser i signalisering av endosom eller mitokondriell handel.

Denne protokollen har andre potensielle applikasjoner, som er beskrevet nedenfor. Oppdrett av de transgene musene som er skissert i denne protokollen (f.eks. Mito.CFP, ChAT.eGFP) med nevrodegenerative sykdomsmusmodeller 1,2,3 vil muliggjøre nevronundertype- og / eller lastspesifikke undersøkelser. Videre vil nylig utviklede mus Cre linjer66 også tillate visualisering av fluorescerende reporterproteiner i forskjellige sensoriske aksonpopulasjoner. For eksempel kan Rosa26.tdTomato mus krysses med et neuropeptid og reseptor-2-ekspresserende (Npy2r). Cre mus for å aktivere tdTomato fluorescens i myeliniserte A-fiber nociceptorer67. Videre kan temporal kontroll også oppnås ved å bruke induserbare Cre-systemer (f.eks. Tamoxifen)68. En annen potensiell applikasjon er avhengig av tilgjengeligheten av transgene mus som uttrykker fluorescerende reporterproteiner i Schwann-celler. Faktisk muliggjør S100-GFP69 og PLP-GFP70 mus in vivo og / eller in situ avbildning av Schwann-celler og har vært i forkant av forskningen involvert i Schwann-cellemigrasjon under periferneregenerering.

I tillegg til disse applikasjonene og komplementere Mito.CFP-musen er tilgjengeligheten av flere transgene muselinjer som uttrykker fluorescerende proteiner i forskjellige organeller, som mitokondrier og autofagosomer. For eksempel kan det være mulig å undersøke in vivo mitokondriell transport med mito::mKate2 mus71 eller fotokonverterbar mitoDendra mus57. Videre kan in vivo mitophagosomtransport være mulig ved bruk av den pH-sensitive mito-Keima-musen72 og mito-QC-musen73 for mitofagianalyser. Videre kan de lysosomale merkingsvanskene vi opplevde overvinnes ved å bruke mus som uttrykker LAMP1-GFP, med forbehold om at LAMP1 også er tilstede i endocytiske organeller som er forskjellige fra lysosomer74.

Oppsummert har vi gitt nye måter å vurdere in vivo aksonal transport av flere organeller i spesifikke perifere nerveaksoner fra forskjellige transgene mus. Samtidig avbildning av ulike organeller vil være spesielt viktig, gitt nyere funn av aksonale interaksjoner og samhandel med organeller som mitokondrier og endosomer75,76. Vi tror at de presenterte metodene vil være nyttige for å forbedre forståelsen av den basale fysiologien til aksoner in vivo og løsne viktige pathomechanisms som driver nevrodegenerasjon av perifere nerver.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for å dele ChAT-eGFP, ChAT.Cre og Rosa26.tdTomato mus, og Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for å dele HB9. GFP mus. Vi takker Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers og Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et Junior Non-Clinical Fellowship fra Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z og 223022 / Z / 21 / Z) (GS), en UK Dementia Research Institute Foundation Award (GS); og Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  2. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  3. De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
  4. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
  5. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  6. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  7. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
  8. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
  9. Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neuroscience. 321, 236-245 (2016).
  10. Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
  11. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
  13. Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
  14. Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
  15. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
  16. Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
  17. Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
  18. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  19. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  20. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
  21. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  22. Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
  23. Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
  24. Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
  25. Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
  26. Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
  27. Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
  28. Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
  29. Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
  30. Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
  31. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  32. Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
  33. Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
  34. Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
  35. Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
  36. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
  37. Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
  38. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
  39. Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
  40. Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
  41. Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
  42. Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
  43. Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
  44. Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
  45. Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
  46. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
  47. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
  48. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
  49. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
  50. Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
  51. Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
  52. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
  53. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  54. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  55. Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
  56. Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
  57. Bolea, I., Gan, W. -B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
  58. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
  59. Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
  60. Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
  61. Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
  62. Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
  63. Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
  64. Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  65. Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
  66. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  67. Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
  68. Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
  69. Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
  70. Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
  71. Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
  72. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  73. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  74. Cheng, X. -T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  75. Cioni, J. -M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
  76. Liao, Y. -C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 178
Utvidelse av verktøysettet for <em>in vivo-avbildning</em> av aksonal transport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos,… More

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter