Summary
في هذه المخطوطة، يتم توضيح الحقن تحت الملتحمة كطريقة صالحة لتوصيل النواقل لأنسجة العين في الفئران باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة تسريب/سحب وحقنة قابلة للإزالة محكمة الإغلاق مقترنة بإبر الحقن المجهري. نظام الحقن هذا قابل للتكيف أيضا مع طرق إدارة العين الأخرى.
Abstract
تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة التي تعد أهدافا جذابة لتوصيل الأدوية المحلية نظرا لسهولة الوصول إليها نسبيا عبر طرق إدارة متعددة. توفر الحقن تحت الملتحمة (SCJ) مزايا مقارنة بطرق الإدارة داخل العين الأخرى لأنها بسيطة وآمنة وعادة ما يتم إجراؤها في العيادات الخارجية. عادة ما تتطلب حقن SCJ في الحيوانات الصغيرة مساعدة مجهر التشغيل بسبب حجم العين. أظهرت الأعمال السابقة أن حقن SCJ لأنماط مصلية محددة مرتبطة بالفيروس الغدي (AAV) هو استراتيجية صالحة لتوصيل الجينات للنقل المستهدف لسطح العين وعضلة العين والقرنية والعصب البصري ، مما يوفر نهجا محتملا لعلاج العديد من أمراض العين.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن SCJ في نموذج الماوس باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة قابلة للبرمجة / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغاز إلى جانب إبر الحقن المجهري. نظام الحقن قابل للتكيف أيضا مع طرق الإدارة الأخرى داخل العين مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. على الرغم من وصف توصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لدراسات العلاج الجيني للعين ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول هنا لمجموعة متنوعة من حلول العيون في نماذج الحيوانات الصغيرة. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضا مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.
Introduction
تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة. في عام 2015، كان ما يقدر بنحو 36 مليون شخص يعانون من العمى القانوني في جميع أنحاء العالم، ويعاني أكثر من مليار شخص من مستوى معين على الأقل من ضعف البصر، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى توسيع نطاق جهود التخفيف على جميع المستويات1. تشمل الطرق الرئيسية لتوصيل أدوية العين كلا من الإدارة الموضعية والمحلية ، مثل قطرات العين أو الحقن تحت الملتحمة (SCJ) ، والحقن داخل الكاميرا ، داخل الجسم الزجاجي ، وتحت الشبكية. على الرغم من أن العلاج الموضعي غير الباضع هو طريقة التوصيل الأكثر شيوعا لأدوية العيون ويستخدم على نطاق واسع للعديد من اضطرابات الجزء الأمامي ، فإن وجود حواجز تشريحية للقرنية يمثل تحديا للتوافر البيولوجي والتوزيع الحيوي وفعالية المواد المدارة موضعيا ، مما يشير إلى أنه قد لا يكون أفضل طريق علاج مرشح للعديد من أمراض العين الداخلية. من المرجح أن يكون الحقن الموضعي في حجرة العين المحددة المتأثرة بالمرض نهجا أكثر فعالية واستهدافالتوصيل الدواء 2. ومع ذلك ، فإن الآثار الضارة الناتجة عن الحقن المتكررة يمكن أن تعقد استراتيجيات الإدارة. من الناحية المثالية ، يجب أن يحافظ العلاج على فعالية علاجية طويلة الأجل بعد إدارة واحدة. وبالتالي ، يعد العلاج الجيني خيارا واعدا لتقليل عدد الحقن المطلوبة وتوفير تعبير جيني محوري مستدام لعلاج مرض العين 3,4.
تتوفر العديد من النواقل الفيروسية وغير الفيروسية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، فإن ناقلات AAV ذات أهمية كبيرة بسبب ملف تعريف السلامة الممتاز. AAV هو فيروس DNA صغير ، تقطعت به السبل ، غير مغلف تم اكتشافه في البداية كملوث لإعداد الفيروس الغدي في عام 1965 بواسطة Atchison et al.5,6 تم تصميم AAV لاحقا كناقل فيروسي فعال لتوصيل الجينات في 1980s وأصبح ناقل العلاج الجيني المفضل للعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات العين ، على مدى العقود القليلة الماضية. أبرزها هو أول دواء للعلاج الجيني متاح تجاريا ، voretigene neparvovec ، والذي تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج داء ليبر الخلقي ، وهو مرض نادر في العين الخلفية. على الرغم من أن voretigene neparvovec قد تغلب بنجاح على الحواجز التي تحول دون التطوير السريري ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات أمام تسويق علاجات جينية إضافية للعين. على سبيل المثال ، يتم إعطاء voretigene neparvovec للمرضى الذين يحتفظون بخلايا شبكية قابلة للحياة عن طريق الحقن تحت الشبكية. وبالتالي ، فإن المرضى الذين يعانون من أشكال أكثر تقدما من المرض والذين يفتقرون إلى خلايا شبكية قابلة للحياة غير مؤهلين للعلاج ، لأنه لن يوفر أي فائدة سريرية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مضاعفات معروفة مرتبطة بإجراء الحقن تحت الشبكية ، بما في ذلك التهاب العين ، إعتام عدسة العين ، تمزق الشبكية ، اعتلال البقعة ، والألم 7,8. تشمل المخاوف الأخرى المتعلقة بهذا الإجراء إمكانية حدوث نزيف ، وانفصال الشبكية ، والتهاب باطن المقلة ، وإلغاء حالة امتياز المناعة العينية من خلال تدمير أنسجة العين9،10،11،12. وبالتالي ، أصبحت الجهود المبذولة لاستكشاف طرق توصيل الجينات الأقل توغلا مثل حقن SCJ ذات أهمية متزايدة13،14،15،16،17.
الملتحمة عبارة عن غشاء رقيق يحتوي على 3-5 طبقات من الخلايا ويربط العين الأمامية بالجفن الداخلي. تستخدم حقن SCJ سريريا لتوصيل أدوية العيون إلى كل من الأجزاء الأمامية و / أو الخلفية من العين لعلاج أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والزرق ، والتهاب الشبكية ، والتهاب القزحية الخلفي18,19. إنها بسيطة نسبيا في الأداء ، وتستخدم بشكل روتيني لتوصيل أدوية العيون في العيادات الخارجية20 ، غير مؤلمة إلى حد ما ، ولا تضر بامتياز المناعة العينية ، وتسمح للأدوية المعطاة بالانتشار عبر منطقة كبيرة حول الحجاج تشمل العصب البصري. وبالتالي ، فإن حقن SCJ هي طريقة جذابة للإعطاء لتطبيقات العلاج الجيني AAV. تم سابقا وصف الأنماط المصلية الطبيعية AAV التي يتم إعطاؤها عن طريق حقن SCJ في الفئران من أجل السلامة وكفاءة النقل ومناعة المصل والتوزيع الحيوي وخصوصية الأنسجة13،16،21. أظهرت هذه البيانات أن توصيل الجينات إلى أنسجة العين الفردية عن طريق إدارة SCJ هو احتمال رسمي.
تصف هذه الورقة بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكيف لحقن SCJ لتقديم متجهات AAV في نموذج ماوس. لضمان استنساخ هذا النهج ، تم وصف نظام حقن يتكون من مجهر مجسم ، ومضخة حقنة قابلة للبرمجة بالتسريب / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) ، وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغلق مقترنة بإبر الحقن المجهري. هذا النظام قابل للتكيف مع طرق الإدارة داخل العين الأخرى مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم استخدام صبغة الفلوريسئين للسماح بتصور موقع حقن AAV. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. أخيرا ، ستتم مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. استخدام نواقل AAV هو خطر بيولوجي من المستوى 1 للسلامة البيولوجية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية عند التعامل مع AAV. بالنسبة للتجربة الموصوفة هنا ، تم استخدام ناقل AAV مؤتلف معبأ مع قفيصة النمط المصلي 8 وترميز محفز عام للفيروس المضخم للخلايا في كل مكان (CMV) يتحكم في التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP).
1. معالجة ناقلات AAV وتخزينها
- قم بتخزين الفيروس في مجمد -80 درجة مئوية في حصص 100 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة من السيليكون أو منخفضة الاحتفاظ.
- قم بإذابة جميع محاليل مخزون المتجهات على الجليد قبل الاستخدام.
ملاحظة: غالبا ما يتم خلط الأصباغ مثل محلول فلوريسئين الصوديوم (بتركيز نهائي 0.1-2٪) مع ناقلات AAV لتصور المحلول المحقون. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد تصور المحاليل المحقونة في اكتشاف فقاعات الهواء ومراقبة توزيع AAV و / أو التسرب بعد الحقن.
2. حقن تحت الملتحمة (SCJ)
- تجميع نظام الحقن.
- لتجميع نظام الحقن ، ضع مجهرا مجسما ومضخة حقنة في خزانة السلامة البيولوجية.
ملاحظة: هناك حاجة إلى مضخة ضخ لإجراء الحقن بدقة عالية. هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة قياسية قابلة للبرمجة (انظر جدول المواد) ، والتي تتضمن قبضة محكمة ومشبك حقنة آمن للمحاقن يتراوح حجمها من 0.5 ميكرولتر إلى 60 مل. توفر هذه المضخة أيضا أداء تدفق محسن بدقة عالية ومعدلات تدفق سلسة من 1.28 بيكولتر / دقيقة إلى 88.28 مل / دقيقة. - قطع أنابيب البولي ايثيلين بطول حوالي 50 سم (انظر جدول المواد).
- أدخل طرف المحور لإبرة 36 G في أحد طرفي الأنبوب.
ملاحظة: حرك نهاية محور الإبرة في الأنبوب لمدة ~ 3 مم لضمان عدم حدوث تسرب. يتم استخدام إبرة 36 G لحقن SCJ اللاحق. الإبر التي تتراوح بين 32 جم و 36 جم هي الأحجام الأكثر استخداما لحقن SCJ. يوصى بشدة باستخدام مرقئ للمساعدة في هذه الخطوة لتجنب المخاطر المحتملة لإصابة الأدوات الحادة. - املأ حقنة 3 مل يمكن التخلص منها بالماء المعقم ؛ أدخل هذه المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة في جانب الأنبوب المقابل للإبرة واغسل الماء في جميع أنحاء الأنبوب / الإبرة. كرر هذه الخطوة مع 70٪ كحول.
- كرر الخطوة 2.1.4 ثلاث مرات أخرى ، بالتناوب مع الشطف بالماء المعقم و 70٪ كحول ، لتطهير الأنبوب وضمان عدم ملاحظة أي تسرب أو انسداد أو تلف في جميع أنحاء الأنبوب.
- استخدم المحقنة سعة 3 مل التي تستخدم لمرة واحدة لملء الأنبوب بالماء المعقم واترك الأنبوب متصلا بالمحقنة التي تستخدم لمرة واحدة.
- ضع قطعة من البارافيلم على سطح المقعد وأضف بركة من الماء المعقم إليها (~ 1 مل). اغمر جزء الأنبوب المتصل بالإبرة في بركة الماء المعقم. اسحب المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة من فتحة الأنبوب في الطرف المقابل لمنع أي هواء من دخول نظام الأنابيب / الإبرة عند إزالة المحقنة. اترك جزء الأنبوب متصلا بالإبرة المغمورة في بركة الماء.
ملاحظة: قم بتنفيذ الإجراءات من 2.1.4 إلى 2.1.7 في غطاء رقائقي. - املأ حقنة / إبرة هاملتون سعة 10 ميكرولتر بالماء المعقم وتجنب الهواء في المحقنة. قم بتوصيل حقنة / إبرة هاملتون بالطرف المفتوح المتبقي من الأنبوب عن طريق غمر الأنبوب وطرف الإبرة في حقنة هاملتون في بركة المياه المعقمة على البارافيلم.
- اضغط على الزر العكسي السريع على شاشة المضخة لتحريك كتلة الدفع إلى الطول التقريبي للمحقنة. قم بفك مقابض تثبيت الدعامة لفك الأقواس المحتجزة على الدافع وكتل حامل المحقنة. قم بتحميل حقنة هاملتون على كتلة حامل المحقنة وقم بتأمين المحقنة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: لتأمين المحقنة ، يجب أن يكون مشبك برميل المحقنة محكما ضد برميل المحقنة ؛ ومع ذلك ، لا تفرط في التشديد ، خاصة عند استخدام المحاقن الزجاجية. يجب تأمين مكبس المحقنة بواسطة قوس الاحتفاظ بكتلة دافع. - اضبط المعلمات في شاشة إعدادات المضخة.
- اضغط على زر القوة ، واضبط مستوى القوة على 30٪. اقبل التغييرات للعودة إلى شاشة الإعدادات .
- اضغط على زر البدء السريع وحدد الطريقة | لبث / سحب.
- بالنسبة للمحقنة ، حدد Hamilton 1700 ، زجاج ، 10 ميكرولتر. حدد معدل التسريب والسحب وحجم الحقن.
ملاحظة: يتم ضبط مستوى القوة وفقا لنوع المحقنة / المادة / السعة / الشركات المصنعة ؛ راجع تعليمات الشركة المصنعة للمصنع لمعرفة القوة المقترحة لكل حقنة. كانت سرعة الحقن المستخدمة في هذه التجربة 200 nL / s. حقن SCJ آمنة نسبيا ، وهناك قلق أقل لتحريض ضغط العين المرتفع (IOP) الناتج عن الحقن. غالبا ما تكون سرعة الحقن البطيئة مرغوبة لبعض التطبيقات لتجنب الارتداد إلى الإبرة والحفاظ على الاتساق في الحقن بين الحيوانات.
- أخرج الماء من حقنة هاملتون ولكن اترك الأنبوب وإبرة الحقن مليئة بالماء. اسحب حقنة هاملتون قليلا عن طريق الضغط على الزر العكسي لإدخال فقاعة هواء صغيرة في الأنبوب / الإبرة.
ملاحظة: ستكون فقاعة الهواء بمثابة حاجز بين الماء في الأنبوب والدواء العلاجي (في هذه الحالة ، AAV) ، مما يضمن دقة الجرعة المعطاة. - سحب الفيروس عن طريق وضع إبرة الحقن في حصص من مخزون الفيروس. تأكد من بقاء فقاعة هواء مرئية بين الفيروس والماء في الأنبوب.
ملاحظة: يمكن أن ترتبط ناقلات AAV بالأنابيب البلاستيكية والإبرة المعدنية ، مما يؤدي إلى فقدان الفيروس و / أو أنظمة الجرعات غير الدقيقة. وبالتالي ، لضمان الدقة والتكرار وجرعة دقيقة من AAV ، يوصى بالطلاء المسبق للأسطح التي تتلامس لاحقا مع AAV. لتغليف نظام الأنبوب / الإبرة بالفيروس ، ارسم محلول الناقل الفيروسي في الأنبوب / الإبرة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بتشبع ارتباط الفيروس بجدار الإبرة و / أو الأنبوب. تخلص من الفيروس.
- لتجميع نظام الحقن ، ضع مجهرا مجسما ومضخة حقنة في خزانة السلامة البيولوجية.
- حقن الفيروس
- تخدير الفأر بالتخدير المستنشق (إيزوفلوران) أو الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / الزيلازين / الأسيبرومازين. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم الثابت.
ملاحظة: استخدم إناث و / أو ذكور الفئران C57BL / 6J أو BALB / c التي يبلغ عمرها 6 أسابيع على الأقل. جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأسيبرومازين هي كما يلي: الكيتامين عند 70 ملغم / كغم ، الزيلازين عند 7 ملغ / كغ ، والأسيبرومازين عند 1.5 ملغ / كغ. - تطبيق التخدير الموضعي على العين التي ستتلقى الحقن.
ملاحظة: استخدم 0.1٪ بروباراكائين هيدروكلوريد و / أو محلول تتراكائين هيدروكلوريد للعيون (0.5٪) للتخدير الموضعي. - ضع مرهما موضعيا على العين الأخرى التي لن تتلقى حقنة لمنع الجفاف والإصابة.
- ضع الماوس على المسرح المجهري وفضح عين الفأر تحت المجهر المجسم.
- ضع إصبعين على الجفن واسحبه قليلا بعيدا عن عين الفأر لكشف الملتحمة ، وهي الغشاء الداخلي الذي يربط الجفن بالصلبة.
- الاستيلاء على الملتحمة مع ملقط.
- حرر الجفن وأمسك الإبرة بحيث تكون الشطبة متجهة لأعلى باستخدام اليد المهيمنة.
- أدخل الإبرة في الملتحمة. أدخل الإبرة حتى يتم تغطية شطبة بالكامل بواسطة غشاء الملتحمة. ضع الإبرة على الكرة الأرضية.
ملاحظة: نظرا لأن الملتحمة عبارة عن غشاء شفاف ، فإن طرف الإبرة / شطبة يمكن رؤيته بسهولة. - ابدأ الحقن بالضغط على زر البدء باستخدام مفتاح القدم.
ملاحظة: تتم مزامنة حركة الهواء ومكبس هاملتون ؛ يشير أي تأخير إلى وجود هواء زائد في نظام الحقن أو ربما اتصال فضفاض بين مكونات الأنبوب و / أو الإبرة و / أو المحقنة. - بعد الانتهاء من الحقن ، ثبت الإبرة في مكانها لمدة 10 ثوان قبل سحب الإبرة من الملتحمة لتقليل فرص التدفق العكسي.
ملاحظة: من الشائع أن تظهر فقاعة في موقع حقن SCJ. عادة ما يتم حل هذه الفقاعات تماما في غضون ساعات قليلة بعد الحقن. - ضع قطرة من جل التشحيم الموضعي على عيني الفأر لمنع جفاف / إصابة العين ، ثم ضع الماوس على وسادة تدفئة للتعافي.
- قم بإجراء فحوصات العين مثل إنتاج الدموع ، IOP ، وفحص المصباح الشقي بالتزامن مع تلطيخ القرنية بالفلوريسئين لتقييم تشوهات العين بعد الحقن.
ملاحظة: يتم قياس إنتاج الدموع عن طريق اختبار خيط الفينول الأحمر ، وغالبا ما يستخدم مقياس توتر العين لفحص IOP لعين الفأر. وتفيد التقارير أن بعض الحقن داخل العين، مثل الحقن داخل الجسم الزجاجي، قد تؤدي إلى زيادة كبيرة في IOP. ومع ذلك ، فإن تغييرات IOP بعد حقن SCJ ليست واضحة13،22،23،24.
- تخدير الفأر بالتخدير المستنشق (إيزوفلوران) أو الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / الزيلازين / الأسيبرومازين. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم الثابت.
- AAV التوزيع الحيوي وفحص كفاءة النقل بعد الحقن تحت الملتحمة
- للتحقيق في التوزيع الحيوي للجينوم الفيروسي و / أو ملف تعريف النقل لنواقل AAV التي يتم تسليمها عبر SCJ ، قم بالقتل الرحيم للفئران بالطريقة المعتمدة من AVMA.
ملاحظة: في هذه التجربة ، تم التضحية بالفئران بعد 8 أسابيع من الحقن. - للتوزيع الحيوي والتعبير عن الجينات المحورة في مقصورات العين المستهدفة ، قم بتشريح الأنسجة ذات الصلة ذات الأهمية مثل الجفون والقرنية والملتحمة وعضلة العين والشبكية والعصب البصري. قم بتجميد جميع المناديل الورقية وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. لفحص التوزيع الحيوي لكامل الجسم AAV ، قم بجمع الأعضاء مثل الغدد الليمفاوية تحت الفك السفلي والكبد ، وقم بتجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
- باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، اجمع gDNA و RNA من نفس العينة لفحص التعبير الجيني المحوري والتوزيع الحيوي AAV ، على التوالي. إذا كان التوزيع الحيوي للناقل فقط مطلوبا ، فاستخدم مجموعة استخراج الحمض النووي لاستخراج gDNA.
- قم بإجراء qPCR القياسي و RT-qPCR لتحديد التوزيع الحيوي لنvector AAV ووفرة cDNA باستخدام بادئات / مجسات خاصة بالجينات المحورة 13,25.
- لتحليل الأنسجة ، قم بإصلاح العينين ، وتضمينهما في البارافين ، وقسمهما بسمك 5 ميكرومتر. إجراء تلطيخ المناعي القياسي للكشف عن التعبير الجينيالمحورة 26.
- للتحقيق في التوزيع الحيوي للجينوم الفيروسي و / أو ملف تعريف النقل لنواقل AAV التي يتم تسليمها عبر SCJ ، قم بالقتل الرحيم للفئران بالطريقة المعتمدة من AVMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر المحلول المحقون في الفضاء تحت الملتحمة على شكل فقاعة اعتمادا على حجم الحقن.
في هذه التجربة ، تم حقن 7 ميكرولتر من AAV (7 × 109 جينومات فيروسية (vg) / عين) مختلطة مع الفلوريسئين بتركيز نهائي قدره 0.1٪ بإبرة 36 G تحت مجهر مجسم ، وتم الحفاظ على سرعة الحقن / الضغط ثابتا باستخدام مضخة حقنة قابلة للبرمجة عند 1 ميكرولتر / ثانية. يمكن أن تظهر الفقاعة عند الحقن (السهم). يظهر في الشكل 1 منظر مجهري لإدارة ناقل AAV إلى حجرة SCJ للفئران.
تنتشر المواد المحقونة في الفضاء تحت الملتحمة في جميع أنحاء العالم للعين ويتم توزيعها في جميع أنحاء الأنسجة المحيطة بالعين.
لتحديد توزيع AAV الذي يتم إعطاؤه عن طريق حقن SCJ ، تم حقن 7 ميكرولتر من الحبر الهندي المخفف في الفضاء تحت الملتحمة لفأر يبلغ من العمر 10 أشهر بعد التخدير. لم يتم الكشف عن أي نزيف أو تسرب أو ارتجاع أثناء أو بعد حقن SCJ. بعد ثلاثين دقيقة من الحقن ، تم حصاد أنسجة العين والأنسجة المحيطة بها ثم تلطيخها بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) لتصور توزيع الحبر الهندي. توضح المقاطع السهمية التمثيلية الموضحة في الشكل 2 أن تشتت الحبر الهندي حدث بشكل أساسي بجوار العضلات خارج العين ، في السطح الخارجي للصلبة ، والأنسجة الضامة الرخوة حول العين (الشكل 2).
يعمل AAV8 التكميلي الذاتي بنجاح على تحويل القرنية والعضلات المحيطة بالعين بعد SCJ.
لتحديد ملف تعريف النقل ل AAV8 المكمل ذاتيا في ثمانية أسابيع بعد الحقن ، تم فحص وفرة GFP في المقاطع العرضية للكرة الأرضية بأكملها عن طريق تلطيخ التألق المناعي باستخدام جسم مضاد مضاد ل GFP بتخفيف 1: 500. تم التقاط الصور تحت المجهر الفلوري (الشكل 3). كشفت هذه النتائج أن نواقل AAV التي تدار عن طريق حقن SCJ تنقل بكفاءة عضلات العين الخلفية إلى العين والقرنية.
وفرة جينوم ناقل وتعبير الجينات المحورة في مقصورات العين المتميزة بعد حقن SCJ
لتحليل التوزيع الحيوي للناقل والتعبير الجيني المحوري ، تم فحص أرقام نسخ جينوم المتجهات في مقصورات وأعضاء متميزة للعين مثل الكبد والقلب بواسطة qPCR (الشكل 4A) ، بينما تم اختبار التعبير الجيني المحوري بواسطة qRT-PCR (الشكل 4B). تشير هذه النتائج إلى أن حقن SCJ ل AAV8 يؤدي إلى التعبير الجيني المحورة في الجفن والملتحمة والقرنية والعصب البصري.
الشكل 1: منظر مجهري لإدارة ناقل AAV في فضاء SCJ للفئران. للسماح بتصور تكوين فقاعة أثناء الإجراء ، تمت إضافة 1٪ فلوريسئين مباشرة إلى إعداد ناقل AAV. تم التقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية متصلة بمجهر مجسم. (أ) صورة تمثيلية لعين غير محقونة ؛ ب: صورة تمثيلية لعين محقونة. يشير السهم إلى محلول AAV المحقون الذي يحتوي على الفلوريسئين في مساحة SCJ. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط ب Adeno ؛ SCJ = تحت الملتحمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تلطيخ H&E لتوزيع الحبر الهندي (السهم) بعد حقن SCJ في عين الماوس. يتم تقديم المقاطع السهمية للعين المحقونة بالحبر الهندي. تم حقن 7 ميكرولتر من الحبر الهندي في الموقع المشار إليه. * ، موقع الحقن. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الاختصارات: SCJ = تحت الملتحمة ؛ H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. C = القرنية. أنا = القزحية. L = عدسة. R = شبكية العين. E = الجفن. H = غدة هارديريان. م = العضلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صور الأنسجة التمثيلية ل GFP ل AAV8 التكميلي الذاتي بعد حقن SCJ. نقل القرنية (A) وعضلات العين (B) بعد حقن SCJ. تم تصور تعبير GFP (الأخضر) عن طريق التلوين المناعي في أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين مع جسم مضاد ل GFP. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر (عضلة العين) ، 20 ميكرومتر (القرنية). الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ AAV = الفيروس المرتبط بالغدي ؛ SCJ = تحت الملتحمة ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التحليل الكمي للتوزيع الحيوي للناقلات والتعبير عن الجينات المحورة. (أ) يتم تقديم التوزيع الحيوي للناقلات في مقصورات العين (الجفن والملتحمة والقرنية والعصب البصري والشبكية) والأعضاء الأخرى (الكبد والقلب) بعد SCJ كرقم نسخة جينوم ناقل / ميكروغرام من الحمض النووي لجينوم المضيف. (ب) يتم تقديم وفرة GFP التي تحددها qRT-PCR كرقم نسخة cDNA متجه / نسخة مضيف. تم تعديل هذا الرقم من 13. الاختصارات: SCJ = تحت الملتحمة ؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحمل العلاج الجيني بوساطة AAV إمكانات كبيرة لعلاج أمراض العين. يعتمد العلاج الجيني العيني الحالي على طريقين رئيسيين للإدارة المحلية ، الحقن داخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية. لسوء الحظ ، كلا الطريقين غازيان ويمكن أن يسببان مضاعفات خطيرة ، بما في ذلك انفصال الشبكية وتشكيل إعتام عدسة العين والتهاب باطن المقلة . وبالتالي ، فإن التحقيق في الطرق الأقل توغلا نسبيا ، مثل حقن SCJ ، له أهمية كبيرة.
على الرغم من أن هذه التقنية واضحة نسبيا وأقل توغلا بشكل ملحوظ ، إلا أن هناك العديد من الجوانب المهمة لتسليم AAV التي يجب تسليط الضوء عليها. يوصى بتخزين ناقل AAV عند -80 درجة مئوية في حصص من الحجم المطلوب (100 ميكرولتر هنا) في أنابيب طرد مركزي دقيقة من السيليكون أو منخفضة الاحتفاظ لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة ومنع انخفاض العيار الفيروسي. تم تخزين المتجه المستخدم في هذه التجربة عند -80 درجة مئوية لمدة ~ 6 سنوات دون خسارة كبيرة في العيار. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر تكوين السيارة على استقرار المتجه. في هذه التجربة ، كانت مركبة الفيروس PBS مع 350 mM NaCl + 5٪ D-sorbitol. كان عيار الفيروس المستخدم في هذه الدراسة 5.1 × 10 9 vg / μL (تم تحديده بواسطة qPCR) ، وتم إعطاء ما مجموعه 7 × 109 vg / eye. ومع ذلك ، فإن مجموعة من 1 × 108-1 × 1010 vg / eye مناسبة ، اعتمادا على الأنسجة المستهدفة والجينات المحورة.
تعتبر حقن SCJ أقل تقييدا نسبيا فيما يتعلق بالحجم المعطى (1-100 ميكرولتر للماوس). ومع ذلك ، يعتقد أن الاختلافات في الحجم تلعب دورا في التوزيع الحيوي والنقل AAV ، وقد تم استخدام أحجام حقن أكبر لإنشاء نموذج تندب الملتحمة27. أحد الجوانب المهمة هو الطبيعة الوعائية للملتحمة ، والتي قد تؤدي إلى إزالة جهازية كبيرة لناقل AAV ، مما يؤدي إلى توليد أجسام مضادة معادلة لناقل AAV. تدرس الأبحاث الجارية بنشاط الاستراتيجيات المحتملة للحد من الإزالة النظامية للنواقل العلاجية AAV.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد التوزيع في الجسم الحي بعد حقن SCJ اعتبارا حاسما للتطبيق المحتمل لمسار الحقن هذا. في البروتوكول الحالي ، يتم فحص التوزيع باستخدام صبغة (حبر الهند) في نقطة زمنية واحدة بدلا من نقاط زمنية متعددة أو في الوقت الفعلي. على الرغم من أن هذه البيانات توفر بعض المؤشرات على كيفية انتشار محلول ناقل AAV مباشرة بعد الحقن ، إلا أن التوزيع والخصائص الحركية لناقل AAV والمواد الأخرى قد تختلف اختلافا كبيرا بمرور الوقت. على الرغم من أن التوزيع البيولوجي لناقل AAV قد تم اكتشافه في مقصورات مختلفة للعين بواسطة qPCR ، كما هو مذكور في قسم الطرق أعلاه عند نقطة النهاية التجريبية ، من الناحية المثالية ، سيتم استخدام تقنية يمكنها مراقبة الاتجار بالكواشف العلاجية في جميع أنحاء العين في الوقت الفعلي ؛ ومع ذلك ، غالبا ما يكون هذا تحديا في الممارسة العملية. أخيرا ، قد يختلف ملف تعريف نقل AAV الذي لوحظ في الفئران بعد حقن SCJ في عيون الإنسان بسبب الحجم الواضح والاختلافات التشريحية والفسيولوجية بين عين الفأر والعين البشرية.
أمراض الشبكية هي أيضا هدف رئيسي للعلاج الجيني28. وبالتالي ، فإن تحديد ما إذا كان AAV الذي يتم إعطاؤه عن طريق حقن SCJ يمكن أن يصل إلى أنسجة الشبكية يستحق مزيدا من الفحص13،17،29. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الجسيمات النانوية التي تدار عن طريق حقن SCJ يمكن أن تصل إلى شبكية العين الداخلية. ومع ذلك ، فإن مسارات الاتجار المحددة غير واضحة. توضح بيانات توزيع الحبر الهندي (الشكل 2) أن معظم المحلول ينتشر في الأنسجة الضامة حول العين ، مما يشير إلى أن AAV قد يصل إلى شبكية العين الداخلية من خلال التخلل حول العين عن طريق اختراق الصلبة والمشيمية والظهارة المصطبغة في شبكية العين.
تشير بيانات نقل القرنية المقدمة في الشكل 3A إلى أن AAV المحقون في مساحة SCJ يمكن أن يخترق الصلبة والقرنية. يشير هذا أيضا إلى أن إعطاء AAV عن طريق حقن SCJ قد يصل إلى الغرفة الأمامية أو حتى الغرف الخلفية والزجاجية ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى جرعة أعلى بكثير لتحقيق التأثيرات المرغوبة في شبكية العين30. ومع ذلك ، فإن حقن SCJ هو أحد أبسط طرق إدارة العين ويبشر بتسليم AAV لعلاج أمراض العين المتعددة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر أمراض سطح العين مثل نقص الخلايا الجذعية الداكنة ، وأمراض جفاف العين ، و / أو أمراض عضلات العين ، مثل ضمور العضلات العيني البلعومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون Vector Core في جامعة نورث كارولينا على توفير ناقلات scAAV8-GFP المستخدمة في هذه الدراسة ، و CGIBD Coistology Core ، ومختبر الدكتور Brian C. Gilger لمساعدتهم في جوانب التقييم السريري لهذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه المتميزة في Pfizer-NC Biotech وجائزة التطوير الوظيفي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي ومؤسسة التليف الكيسي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو مؤسسة التليف الكيسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
