Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

छोटे पशु मॉडल में एडेनो से जुड़े वायरस वैक्टर का उप-संयोजन प्रशासन

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63532
Automatic Translation
1,3, 2, 1,2
1Department of Ophthalmology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Gene Therapy Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

इस पांडुलिपि में, सबकॉन्जक्टिवल इंजेक्शन को चूहों में ओकुलर ऊतकों के लिए एक वैध वेक्टर डिलीवरी विधि के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें एक इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग किया जाता है जिसमें एक जलसेक / वापसी सिरिंज पंप और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज शामिल है। यह इंजेक्शन प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों के लिए भी अनुकूलनीय है।

Abstract

नेत्र रोगों में विरासत में मिले आनुवंशिक और अधिग्रहित विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है जो कई प्रशासन मार्गों के माध्यम से पहुंच की सापेक्ष आसानी के कारण स्थानीय दवा वितरण के लिए आकर्षक लक्ष्य हैं। सबकॉन्जंक्टिवल (एससीजे) इंजेक्शन अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों पर फायदे प्रदान करते हैं क्योंकि वे सरल, सुरक्षित होते हैं, और आमतौर पर बाह्य रोगी सेटिंग में किए जाते हैं। छोटे जानवरों में एससीजे इंजेक्शन को आमतौर पर आंख के आकार के कारण एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप की सहायता की आवश्यकता होती है। पिछले काम से पता चला है कि विशिष्ट एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) सीरोटाइप का एससीजे इंजेक्शन ओकुलर सतह, आंखों की मांसपेशियों, कॉर्निया और ऑप्टिक तंत्रिका के लक्षित पारगमन के लिए एक वैध जीन वितरण रणनीति है, जो कई ओकुलर रोगों के उपचार के लिए एक संभावित दृष्टिकोण प्रदान करता है।

यहां, एक माउस मॉडल में एससीजे इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें एक प्रोग्राम करने योग्य जलसेक / वापसी सिरिंज पंप (जो लगातार और सटीक इंजेक्शन गति और दबाव की अनुमति देता है) और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज शामिल है। इंजेक्शन प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों जैसे इंट्रास्ट्रोमल, इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और छोटे जानवरों में सबरेटिनल इंजेक्शन के लिए भी अनुकूलनीय है। यद्यपि ओकुलर जीन थेरेपी अध्ययनों के लिए एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर के वितरण का वर्णन किया गया है, यहां प्रोटोकॉल को छोटे पशु मॉडल में विभिन्न प्रकार के नेत्र समाधानों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। प्रशासन मार्ग में प्रमुख व्यावहारिक कदम, इंजेक्शन प्लेटफॉर्म के लिए सेटअप, इंजेक्शन की तैयारी, और प्रत्यक्ष अनुभव से युक्तियों पर विस्तार से चर्चा की जाएगी। इसके अलावा, वांछित ऊतकों को एएवी वितरण की पुष्टि के लिए सामान्य सत्यापन तकनीकों पर भी संक्षेप में चर्चा की जाएगी।

Introduction

नेत्र रोगों में आनुवंशिक और अधिग्रहित दोनों विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। 2015 में, अनुमानित 36 मिलियन लोग दुनिया भर में कानूनी रूप से अंधे थे, और 1 बिलियन से अधिक लोग कम से कम कुछ स्तर की दृश्य हानि से पीड़ित हैं, जो सभीस्तरों पर उन्मूलन प्रयासों को बढ़ाने की आवश्यकता पर प्रकाश डालते हैं। ओकुलर दवाओं को वितरित करने के मुख्य तरीकों में सामयिक और स्थानीय प्रशासन दोनों शामिल हैं, जैसे कि आई ड्रॉप या सबकॉन्जंक्टिवल (एससीजे), इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और सबरेटिनल इंजेक्शन। यद्यपि नॉनइनवेसिव सामयिक चिकित्सा नेत्र दवाओं के लिए सबसे आम वितरण विधि है और कई पूर्ववर्ती खंड विकारों के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग की जाती है, कॉर्नियल शारीरिक बाधाओं की उपस्थिति शीर्ष रूप से प्रशासित पदार्थों की जैव उपलब्धता, जैव वितरण और प्रभावकारिता के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है, यह सुझाव देते हुए कि यह आंतरिक आंखों के कई रोगों के लिए सबसे अच्छा उम्मीदवार उपचार मार्ग नहीं हो सकता है। रोग से प्रभावित विशिष्ट ओकुलर डिब्बे में स्थानीय इंजेक्शन एक अधिक प्रभावी और लक्षित दवावितरण दृष्टिकोण होने की संभावना है। हालांकि, बार-बार इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्रतिकूल प्रभाव प्रशासन रणनीतियों को जटिल कर सकते हैं। आदर्श रूप से, एक चिकित्सा को एकल प्रशासन के बाद दीर्घकालिक चिकित्सीय प्रभावकारिता बनाए रखनी चाहिए। इस प्रकार, जीन थेरेपी आवश्यक इंजेक्शन की संख्या को कम करने और ओकुलर रोग 3,4 के उपचार के लिए निरंतर ट्रांसजीन अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए एक आशाजनक विकल्प है।

जीन थेरेपी के लिए कई वायरल और नॉनवायरल वैक्टर उपलब्ध हैं; हालांकि, एएवी वैक्टर अपने उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफ़ाइल के कारण उच्च रुचि रखते हैं। एएवी एक छोटा, एकल-फंसे हुए, गैर-आवरण वाला डीएनए वायरस है जिसे शुरू में 1965 में एटचिसन एट अल द्वारा एडेनोवायरस तैयारी के संदूषक के रूप में खोजा गया था। पिछले कुछ दशकों में। इनमें से सबसे उल्लेखनीय पहली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीन थेरेपी दवा है, वोरेटिजीन नेपार्वोवेक, जिसे यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन द्वारा लेबर के जन्मजात अमौरोसिस, एक दुर्लभ पश्चवर्ती आंख की बीमारी के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया था। यद्यपि वोरेटिजीन नेपार्वोवेक ने नैदानिक विकास के लिए बाधाओं को सफलतापूर्वक दूर कर लिया है, अतिरिक्त ओकुलर जीन थेरेपी के व्यावसायीकरण के लिए चुनौतियां बनी हुई हैं। उदाहरण के लिए, वोरेटिजीन नेपार्वोवेक उन रोगियों को प्रशासित किया जाता है जो सबरेटिनल इंजेक्शन के माध्यम से व्यवहार्य रेटिना कोशिकाओं को बनाए रखते हैं। इस प्रकार, रोग के अधिक उन्नत रूपों वाले रोगी जिनके पास व्यवहार्य रेटिना कोशिकाओं की कमी होती है, वे उपचार के लिए पात्र नहीं होते हैं, क्योंकि यह कोई नैदानिक लाभ प्रदान नहीं करेगा। इसके अलावा, सबरेटिनल इंजेक्शन प्रक्रिया से जुड़ी ज्ञात जटिलताओं को देखा गया, जिसमें आंखों की सूजन, मोतियाबिंद, रेटिना फाड़, मैकुलोपैथी और दर्द 7,8 शामिल हैं। इस प्रक्रिया से संबंधित अन्य चिंताओं में रक्तस्राव, रेटिना डिटेचमेंट, एंडोफथाल्मिटिस, और आंखों के ऊतक विनाश के माध्यम से ओकुलर प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त स्थिति का निरसन 9,10,11,12 शामिल है। इस प्रकार, एससीजे इंजेक्शन जैसे कम आक्रामक जीन वितरण मार्गों का पता लगाने के प्रयास तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं 13,14,15,16,17।

नेत्रश्लेष्मला एक पतली झिल्ली है जिसमें कोशिकाओं की 3-5 परतें होती हैं और पूर्ववर्ती आंख को आंतरिक पलक से जोड़ती हैं। एससीजे इंजेक्शन का उपयोग नेत्र संबंधी रोगों जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन, ग्लूकोमा, रेटिनाइटिस और पश्चवर्ती यूवाइटिस18,19 के उपचार के लिए आंख के पूर्ववर्ती और / या पीछे के दोनों खंडों में नेत्र दवा वितरण के लिए चिकित्सकीय रूप से किया जाता है। वे प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं, बाह्य रोगी सेटिंग20 में नेत्र दवा वितरण के लिए नियमित रूप से नियोजित, कुछ हद तक दर्द रहित, ओकुलर प्रतिरक्षा विशेषाधिकार से समझौता नहीं करते हैं, और प्रशासित दवाओं को एक बड़े पेरिऑर्बिटल क्षेत्र के माध्यम से फैलने की अनुमति देते हैं जिसमें ऑप्टिक तंत्रिका शामिल है। इसलिए, एससीजे इंजेक्शन एएवी जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए प्रशासन का एक आकर्षक मार्ग है। चूहों में एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित प्राकृतिक एएवी सीरोटाइप को पहले सुरक्षा, पारगमन दक्षता, सीरम इम्युनोजेनेसिटी, जैव वितरण और ऊतक विशिष्टता 13,16,21 के लिए विशेषता दी गई है। इन आंकड़ों से पता चला है कि एससीजे प्रशासन के माध्यम से व्यक्तिगत ओकुलर ऊतकों को जीन वितरण एक औपचारिक संभावना है।

यह पेपर माउस मॉडल में एएवी वैक्टर देने के लिए एससीजे इंजेक्शन के लिए एक सरल और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, एक इंजेक्शन प्रणाली जिसमें एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, एक प्रोग्रामेबल इन्फ्यूजन / वापसी सिरिंज पंप (जो लगातार और सटीक इंजेक्शन गति और दबाव की अनुमति देता है), और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित एक गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज का वर्णन किया गया है। यह प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों जैसे इंट्रास्ट्रोमल, इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और छोटे जानवरों में सबरेटिनल इंजेक्शन के लिए अनुकूलनीय है। इसके अलावा, एएवी इंजेक्शन साइट के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए अक्सर एक फ्लोरेसिन डाई का उपयोग किया जाता है। प्रशासन मार्ग में प्रमुख व्यावहारिक कदम, इंजेक्शन प्लेटफॉर्म के लिए सेटअप, इंजेक्शन की तैयारी, और प्रत्यक्ष अनुभव से युक्तियों पर विस्तार से चर्चा की जाएगी। अंत में, वांछित ऊतकों को एएवी वितरण की पुष्टि के लिए सामान्य सत्यापन तकनीकों पर संक्षेप में चर्चा की जाएगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के नियमों के अनुसार किया गया था। एएवी वैक्टर का उपयोग एक जैव सुरक्षा स्तर 1 जैव जोखिम है। एएवी को संभालते समय लैब कोट, दस्ताने और चश्मे सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। यहां वर्णित प्रयोग के लिए, सीरोटाइप 8 कैप्सिड के साथ पैक किए गए एक पुनः संयोजक एएवी वेक्टर और हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले एक सामान्य सर्वव्यापी साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर को एन्कोडिंग का उपयोग किया गया था।

1. एएवी वेक्टर हैंडलिंग और स्टोरेज

  1. सिलिकॉनीकृत या कम अवधारण माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 100 μL एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वायरस स्टोर करें।
  2. उपयोग से पहले बर्फ पर सभी वेक्टर स्टॉक समाधानों को पिघलाएं।
    नोट: सोडियम फ्लोरेसिन समाधान (0.1-2% की अंतिम एकाग्रता पर) जैसे रंगों को अक्सर इंजेक्शन समाधान की कल्पना करने के लिए एएवी वैक्टर के साथ मिलाया जाता है। इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन समाधानों का विज़ुअलाइज़ेशन हवा के बुलबुले का पता लगाने और इंजेक्शन के बाद एएवी वितरण और / या रिसाव की निगरानी करने में मदद करता है।

2. सबकोंजक्टिवल (एससीजे) इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन प्रणाली को इकट्ठा करें।
    1. इंजेक्शन प्रणाली को इकट्ठा करने के लिए, एक बायोसेफ्टी कैबिनेट में एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और एक सिरिंज पंप रखें।
      नोट: उच्च परिशुद्धता के साथ इंजेक्शन करने के लिए एक जलसेक पंप की आवश्यकता होती है। इसमें, एक मानक इन्फ्यूज /निकासी प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें), जिसमें 0.5 μL से 60 mL तक की मात्रा में सिरिंज के लिए एक तंग पकड़ और एक सुरक्षित सिरिंज क्लैंप शामिल है। यह पंप उच्च सटीकता और चिकनी प्रवाह दर के साथ 1.28 पीएल / मिनट से 88.28 मिलीलीटर / मिनट तक बढ़ा हुआ प्रवाह प्रदर्शन भी प्रदान करता है।
    2. पॉलीथीन ट्यूबिंग को लगभग 50 सेमी की लंबाई तक काटें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. टयूबिंग के सिरों में से एक में 36 जी सुई के हब छोर को डालें।
      नोट: सुई हब को ~ 3 मिमी के लिए ट्यूब में स्लाइड करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई रिसाव नहीं होता है। 36 जी सुई का उपयोग बाद में एससीजे इंजेक्शन के लिए किया जाता है। एससीजे इंजेक्शन के लिए 32 जी और 36 जी के बीच की सुइयां सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले आकार हैं। शार्प्स चोट के संभावित जोखिम से बचने के लिए इस कदम की सहायता के लिए हेमोस्टैट का उपयोग अत्यधिक अनुशंसित है।
    4. बाँझ पानी के साथ एक डिस्पोजेबल 3 एमएल सिरिंज भरें; इस डिस्पोजेबल सिरिंज को सुई के सामने ट्यूब के किनारे डालें और पूरे ट्यूबिंग / सुई में पानी को फ्लश करें। इस चरण को 70% अल्कोहल के साथ दोहराएं।
    5. चरण 2.1.4 को तीन बार दोहराएं, बाँझ पानी और 70% अल्कोहल के साथ बारी-बारी से फ्लश करें, ताकि ट्यूबिंग को कीटाणुरहित किया जा सके और यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूरे ट्यूबिंग में कोई रिसाव, क्लोग या क्षति नहीं देखी जाती है।
    6. बाँझ पानी के साथ ट्यूबिंग को भरने के लिए डिस्पोजेबल 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और डिस्पोजेबल सिरिंज से जुड़ी ट्यूबिंग को छोड़ दें।
    7. बेंच की सतह पर पैराफिल्म का एक टुकड़ा रखें और इसमें बाँझ पानी का एक पूल जोड़ें (~ 1 एमएल)। सुई से जुड़े टयूबिंग के हिस्से को बाँझ पानी के पूल में डुबोएं। डिस्पोजेबल सिरिंज को विपरीत छोर पर ट्यूब खोलने से बाहर निकालें ताकि सिरिंज को हटाने पर किसी भी हवा को ट्यूबिंग / सुई प्रणाली में प्रवेश करने से रोका जा सके। सुई से जुड़े टयूबिंग के हिस्से को पानी के पूल में डूबा छोड़ दें।
      नोट: लैमिनार हुड में प्रक्रियाओं 2.1.4 से 2.1.7 का प्रदर्शन करें।
    8. बाँझ पानी के साथ 10 μL हैमिल्टन सिरिंज / सुई भरें और सिरिंज में हवा से बचें। हैमिल्टन सिरिंज/सुई को हैमिल्टन सिरिंज के टयूबिंग और सुई सिरे को पैराफिल्म पर बाँझ पानी के पूल में डुबोकर ट्यूबिंग के शेष खुले छोर से कनेक्ट करें।
    9. पुशर ब्लॉक को सिरिंज की अनुमानित लंबाई तक ले जाने के लिए पंप स्क्रीन पर तेज़ रिवर्स बटन दबाएं। पुशर और सिरिंज धारक ब्लॉकों पर बनाए रखने वाले कोष्ठक को ढीला करने के लिए ब्रैकेट क्लैंपिंग नॉब्स को खोल दें। हैमिल्टन सिरिंज को सिरिंज धारक ब्लॉक पर लोड करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सिरिंज को सुरक्षित करें।
      नोट: सिरिंज को सुरक्षित करने के लिए, सिरिंज बैरल क्लैंप सिरिंज बैरल के खिलाफ तंग होना चाहिए; हालांकि, अधिक न करें, खासकर जब ग्लास सिरिंज का उपयोग करें। सिरिंज प्लंजर को पुशर ब्लॉक रिटेनिंग ब्रैकेट द्वारा सुरक्षित किया जाना चाहिए।
    10. पंप सेटिंग्स स्क्रीन में पैरामीटर समायोजित करें।
      1. बल बटन दबाएं, और बल स्तर को 30% पर सेट करें। सेटिंग्स स्क्रीन पर वापस जाने के लिए परिवर्तन स्वीकार करें।
      2. त्वरित प्रारंभ बटन दबाएँ और विधि | का चयन करें हटाएं/वापस लें।
      3. सिरिंज के लिए, हैमिल्टन 1700, ग्लास, 10 μL का चयन करें। जलसेक का चयन करें और वापस लेने की दर और इंजेक्शन की मात्रा।
        नोट: बल स्तर सिरिंज प्रकार / सामग्री / क्षमता / निर्माताओं के आधार पर निर्धारित किया गया है; प्रत्येक सिरिंज के लिए सुझाए गए बल के लिए कारखाने निर्माता निर्देश देखें। एससीजे इंजेक्शन अपेक्षाकृत सुरक्षित हैं, और इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ऊंचा इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) के प्रेरण के लिए चिंता कम है। सुई में रिफ्लक्स से बचने और जानवरों के बीच इंजेक्शन में स्थिरता बनाए रखने के लिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए धीमी इंजेक्शन गति अक्सर वांछनीय होती है।
    11. हैमिल्टन सिरिंज से पानी निकालें लेकिन ट्यूबिंग और इंजेक्शन सुई को पानी से भरा छोड़ दें। ट्यूबिंग /सुई में एक छोटा हवा बुलबुला पेश करने के लिए रिवर्स बटन दबाकर हैमिल्टन सिरिंज पर थोड़ा पीछे खींचें।
      नोट: एयर बबल ट्यूब में पानी और चिकित्सीय दवा (इस मामले में, एएवी) के बीच एक बाधा के रूप में काम करेगा, प्रशासित खुराक की सटीकता सुनिश्चित करेगा।
    12. इंजेक्शन सुई को वायरस स्टॉक के एलिकोट में रखकर वायरस को वापस लें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग में वायरस और पानी के बीच एक दृश्यमान हवा का बुलबुला बना रहे।
      नोट: एएवी वैक्टर प्लास्टिक ट्यूबिंग और धातु की सुई से जुड़ सकते हैं, जिससे वायरस और / या गलत खुराक आहार का नुकसान हो सकता है। इस प्रकार, कठोरता, प्रजनन क्षमता और एएवी की सटीक खुराक सुनिश्चित करने के लिए, बाद में एएवी के संपर्क में आने वाली सतहों को प्रीकोटिंग करने की सिफारिश की जाती है। ट्यूबिंग/सुई प्रणाली को वायरस के साथ कोट करने के लिए, वायरल वेक्टर समाधान को ट्यूबिंग/सुई में खींचें और इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि सुई की दीवार और/या टयूबिंग से वायरस की संतृप्ति हो सके। वायरस को छोड़ दें।
  2. वायरस इंजेक्शन
    1. माउस को इनहेल्ड एनेस्थीसिया (आइसोफ्लुरेन) या केटामाइन / ज़ाइलाज़िन / एसेप्रोमाज़िन के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज करें। दृढ़ पैर की अंगुली पिन के जवाब की कमी से संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान की पुष्टि करें।
      नोट: महिला और / या पुरुष C57BL / 6J या BALB / c चूहों का उपयोग करें जो कम से कम 6 सप्ताह पुराने हैं। केटामाइन / ज़ाइलाज़िन / एसप्रोमाज़िन खुराक निम्नानुसार हैं: 70 मिलीग्राम / किग्रा पर केटामाइन, 7 मिलीग्राम / किग्रा पर ज़ाइलाज़िन, और 1.5 मिलीग्राम / किग्रा पर एसेप्रोमाज़िन।
    2. इंजेक्शन प्राप्त करने वाली आंख पर सामयिक संज्ञाहरण लागू करें।
      नोट: सामयिक संज्ञाहरण के लिए 0.1% प्रोपेराकेन हाइड्रोक्लोराइड और / या टेट्राकेन हाइड्रोक्लोराइड ऑप्थेल्मिक समाधान (0.5%) का उपयोग करें।
    3. दूसरी आंख पर सामयिक मरहम लागू करें जिसे सूखापन और चोट को रोकने के लिए इंजेक्शन नहीं मिलेगा।
    4. माउस को माइक्रोस्कोपिक स्टेज पर रखें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे माउस आंख को उजागर करें।
    5. पलक पर दो उंगलियां रखें और नेत्रश्लेष्मला को उजागर करने के लिए इसे माउस की आंख से थोड़ा दूर खींचें, जो पलक को श्वेतपटल से जोड़ने वाली आंतरिक झिल्ली है।
    6. नेत्रश्लेष्मला को बल के साथ पकड़ें।
    7. पलक छोड़ दें और प्रमुख हाथ का उपयोग करके बेवेल को ऊपर की ओर मुंह करके सुई को पकड़ें।
    8. सुई को नेत्रश्लेष्मला में डालें। सुई डालें जब तक कि बेवेल पूरी तरह से नेत्रश्लेष्मला झिल्ली द्वारा कवर न हो जाए। सुई को ग्लोब पर रखो।
      नोट: चूंकि नेत्रश्लेष्मला एक स्पष्ट झिल्ली है, सुई की नोक / बेवेल आसानी से दिखाई देती है।
    9. फुटस्विच का उपयोग करके स्टार्ट बटन दबाकर इंजेक्शन शुरू करें।
      नोट: हवा और हैमिल्टन प्लंजर की गति सिंक्रनाइज़ की जाती है; कोई भी देरी इंजेक्शन प्रणाली में अतिरिक्त हवा या संभवतः ट्यूबिंग, सुई और / या सिरिंज घटकों के बीच एक ढीले संबंध को इंगित करती है।
    10. इंजेक्शन समाप्त होने के बाद, बैकफ्लो की संभावना को कम करने के लिए नेत्रश्लेष्मला से सुई को वापस लेने से पहले सुई को 10 सेकंड तक रखें।
      नोट: एससीजे इंजेक्शन की साइट पर एक ब्लीब दिखाई देना आम है। इस तरह के ब्लीब्स आमतौर पर इंजेक्शन के बाद कुछ घंटों के भीतर पूरी तरह से हल हो जाते हैं।
    11. ओकुलर सूखापन / चोट को रोकने के लिए माउस की आंखों पर सामयिक स्नेहक जेल की एक बूंद डालें, और फिर माउस को ठीक होने के लिए हीटिंग पैड पर रखें।
    12. इंजेक्शन के बाद ओकुलर असामान्यताओं का आकलन करने के लिए कॉर्नियल फ्लोरेसिन स्टेनिंग के साथ संयोजन में आंसू उत्पादन, आईओपी और स्लिट-लैंप परीक्षा जैसे ओकुलर परीक्षाएं करें।
      नोट: आंसू उत्पादन को फिनोल रेड थ्रेड परीक्षण द्वारा मापा जाता है, और एक टोनोमीटर का उपयोग अक्सर माउस आंख के आईओपी की जांच करने के लिए किया जाता है। यह बताया गया है कि कुछ इंट्राओकुलर इंजेक्शन, जैसे कि इंट्राविट्रल इंजेक्शन, आईओपी में महत्वपूर्ण वृद्धि कर सकते हैं; हालांकि, एससीजे इंजेक्शन के बाद आईओपी परिवर्तन स्पष्ट नहीं हैं 13,22,23,24।
  3. सबकॉन्जक्टिवल इंजेक्शन के बाद एएवी जैव वितरण और पारगमन दक्षता परीक्षा
    1. एससीजे के माध्यम से वितरित एएवी वैक्टर के वायरल जीनोम जैव वितरण और / या पारगमन प्रोफ़ाइल की जांच करने के लिए, एवीएमए अनुमोदित विधि द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें।
      नोट: इस प्रयोग में, चूहों को इंजेक्शन के 8 सप्ताह बाद बलिदान किया गया था।
    2. लक्षित ओकुलर डिब्बों में जैव वितरण और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के लिए, पलकें, कॉर्निया, नेत्रश्लेष्मला, आंख की मांसपेशी, रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका जैसे रुचि के प्रासंगिक ऊतक को विच्छेदित करें। फ्लैश-फ्रीज सभी ऊतकों और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पूरे शरीर के एएवी जैव वितरण की जांच करने के लिए, सबमैंडिबुलर लिम्फ नोड्स और यकृत जैसे अंगों को इकट्ठा करें, और फ्लैश-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके, क्रमशः ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और एएवी जैव वितरण की जांच करने के लिए एक ही नमूने से जीडीएनए और आरएनए एकत्र करें। यदि केवल वेक्टर जैव वितरण वांछित है, तो जीडीएनए निकालने के लिए डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें।
    4. वेक्टर ट्रांसजीन-विशिष्ट प्राइमरों / प्रोब13,25 का उपयोग करके एएवी वेक्टर जैव वितरण और सीडीएनए बहुतायत निर्धारित करने के लिए मानक क्यूपीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर का प्रदर्शन करें।
    5. हिस्टोलॉजी विश्लेषण के लिए, आंखों को ठीक करें, उन्हें पैराफिन में एम्बेड करें, और उन्हें 5 μm की मोटाई पर वर्गीकृत करें। ट्रांसजेन अभिव्यक्ति26 को प्रकट करने के लिए मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इंजेक्शन की मात्रा के आधार पर सबकॉन्जक्टिवल स्पेस में इंजेक्ट किया गया समाधान एक ब्लीब के रूप में प्रस्तुत होता है।
इस प्रयोग में, 0.1% की अंतिम सांद्रता पर फ्लोरेसिन के साथ मिश्रित एएवी के 7 μL (7 × 109 वायरल जीनोम (vg)/eye) को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 36 G सुई के साथ इंजेक्ट किया गया था, और इंजेक्शन की गति / दबाव को 1 μL / s पर प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप का उपयोग करके स्थिर रखा गया था। इंजेक्शन (तीर) पर एक ब्लीब दिखाई दे सकता है। मुराइन एससीजे डिब्बे के लिए एएवी वेक्टर प्रशासन का एक सूक्ष्म दृश्य चित्र 1 में दिखाया गया है।

सबकॉन्जक्टिवल स्पेस में इंजेक्ट किए गए पदार्थ आंख के ग्लोब के चारों ओर फैलते हैं और पूरे पेरिओकुलर ऊतकों में वितरित होते हैं।
एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित एएवी के वितरण को परिभाषित करने के लिए, एनेस्थेटाइजेशन के बाद 10 महीने के माउस के उप-संयोजन स्थान में 7 μL पतला भारत स्याही इंजेक्ट की गई थी। एससीजे इंजेक्शन के दौरान या बाद में कोई रक्तस्राव, रिसाव या बैकफ्लो का पता नहीं चला था। इंजेक्शन के तीस मिनट बाद, ओकुलर और आसपास के ऊतकों को काटा गया और बाद में भारत की स्याही के वितरण की कल्पना करने के लिए हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) से दाग दिया गया। चित्र 2 में दर्शाए गए प्रतिनिधि खंडों से पता चलता है कि भारत की स्याही का फैलाव मुख्य रूप से श्वेतपटल की बाहरी सतह में एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों और पेरिओकुलर ढीले संयोजी ऊतकों के निकट होता है (चित्र 2)।

स्व-पूरक एएवी 8 एससीजे के बाद कॉर्निया और पेरीओकुलर मांसपेशियों को सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस करता है।
इंजेक्शन के आठ सप्ताह बाद स्व-पूरक एएवी 8 के पारगमन प्रोफ़ाइल को निर्धारित करने के लिए, पूरे विश्व के क्रॉस-सेक्शन में जीएफपी बहुतायत की जांच 1:500 के कमजोर पड़ने पर एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से की गई थी। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत लिया गया था। इन परिणामों से पता चला कि एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित एएवी वैक्टर कुशलतापूर्वक आंख और कॉर्निया के पीछे की पेरीओकुलर मांसपेशियों को ट्रांसड्यूस करते हैं।

एससीजे इंजेक्शन के बाद अलग-अलग आंखों के डिब्बों में प्रचुर मात्रा में वेक्टर जीनोम और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति
वेक्टर बायोडिस्ट्रिब्यूशन और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए, अलग-अलग आंखों के डिब्बों और यकृत और हृदय जैसे अंगों में वेक्टर जीनोम कॉपी संख्याओं की जांच क्यूपीसीआर (चित्रा 4 ए) द्वारा की गई थी, जबकि ट्रांसजेन अभिव्यक्ति का परीक्षण क्यूआरटी-पीसीआर (चित्रा 4 बी) द्वारा किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि एएवी 8 के एससीजे इंजेक्शन के परिणामस्वरूप पलक, नेत्रश्लेष्मला, कॉर्निया और ऑप्टिक तंत्रिका में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति होती है।

Figure 1
चित्रा 1: मुराइन एससीजे अंतरिक्ष में एएवी वेक्टर प्रशासन का सूक्ष्म दृश्य। प्रक्रिया के दौरान एक ब्लीब के गठन के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए, 1% फ्लोरेसिन को सीधे एएवी वेक्टर तैयारी में जोड़ा गया था। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से जुड़े डिजिटल कैमरे का उपयोग करके छवियां ली गईं। (ए) एक गैर-इंजेक्शन आंख की प्रतिनिधि छवि; (बी) एक इंजेक्शन आंख की प्रतिनिधि छवि। तीर एससीजे अंतरिक्ष में फ्लोरेसिन युक्त इंजेक्शन एएवी समाधान को इंगित करता है। संक्षेप: एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; SCJ = उपसंश्लेषणीय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: माउस आंख में एससीजे इंजेक्शन के बाद भारत स्याही वितरण (तीर) का एच एंड ई धुंधला होना। भारत की स्याही से इंजेक्शन वाली आंख के कई हिस्से प्रस्तुत किए गए हैं; संकेतित स्थल पर 7 लीटर भारतीय स्याही इंजेक्ट की गई थी। *, इंजेक्शन साइट. स्केल बार = 500 μm. संक्षेप: एससीजे = उपसंयोजक्तिवल; एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन; सी = कॉर्निया; आई = आईरिस; एल = लेंस; आर = रेटिना; ई = पलक; एच = हार्डेरियन ग्रंथि; एम = मांसपेशी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एससीजे इंजेक्शन के बाद स्व-पूरक एएवी 8 की प्रतिनिधि जीएफपी हिस्टोलॉजी छवियां। एससीजे इंजेक्शन के बाद कॉर्निया (ए) और आंखों की मांसपेशियों (बी) का पारगमन। जीएफपी अभिव्यक्ति (हरे) को एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों में इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से देखा गया था। नाभिक को DAPI (नीले) से दाग दिया गया था। स्केल बार = 100 μm (आंख की मांसपेशी), 20 μm (कॉर्निया)। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस; एससीजे = उप-संयुग्मक; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वेक्टर जैव वितरण और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण। (ए) एससीजे के बाद आंखों के डिब्बों (पलक, नेत्रश्लेष्मला, कॉर्निया, ऑप्टिक तंत्रिका और रेटिना) और अन्य अंगों (यकृत और हृदय) में वेक्टर जैव वितरण को मेजबान जीनोम डीएनए के वेक्टर जीनोम कॉपी नंबर / (बी) क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित जीएफपी बहुतायत को वेक्टर सीडीएनए कॉपी नंबर / होस्ट ट्रांसक्रिप्ट के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। यह आंकड़ा 13 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: एससीजे = उपसंयोजक्तिवल; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रेवरे-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी ओकुलर रोगों के उपचार के लिए बहुत क्षमता रखती है। वर्तमान ओकुलर जीन थेरेपी दो प्रमुख स्थानीय प्रशासन मार्गों, इंट्राविट्रल और सबरेटिनल इंजेक्शन पर निर्भर करती है। दुर्भाग्य से, दोनों मार्ग आक्रामक हैं और रेटिना डिटेचमेंट, मोतियाबिंद गठन और एंडोफथाल्मिटिस सहित गंभीर जटिलताओं का कारण बन सकते हैं। इस प्रकार, एससीजे इंजेक्शन जैसे अपेक्षाकृत कम आक्रामक मार्गों की जांच बहुत रुचि रखती है।

यद्यपि यह तकनीक अपेक्षाकृत सीधी और काफी कम आक्रामक है, एएवी वितरण के कई महत्वपूर्ण पहलू हैं जिन्हें उजागर किया जाना चाहिए। यह अनुशंसा की जाती है कि एएवी वेक्टर को सिलिकॉनीकृत या कम-प्रतिधारण माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में वांछित मात्रा (यहां 100 μL) के एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए ताकि कई फ्रीज-पिघलाव चक्रों से बचा जा सके और वायरल टिटर में कमी को रोका जा सके। इस प्रयोग में उपयोग किए गए वेक्टर को टिटर के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना ~ 6 वर्षों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। इसके अतिरिक्त, वाहन संरचना वेक्टर की स्थिरता को प्रभावित कर सकती है। इस प्रयोग में, वायरस वाहन 350 एमएम एनएसीएल + 5% डी-सोर्बिटोल के साथ पीबीएस था। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए वायरस का टिटर 5.1 × 109 वीजी / μL (क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित) था, और कुल 7 × 109 वीजी / आंख प्रशासित किया गया था। हालांकि, लक्षित ऊतक और ट्रांसजीन के आधार पर 1 × 108-1 ×10 10 वीजी / आंख की सीमा उपयुक्त है।

एससीजे इंजेक्शन प्रशासित मात्रा (माउस के लिए 1-100 μL) के संबंध में अपेक्षाकृत कम प्रतिबंधात्मक हैं। हालांकि, मात्रा अंतर को एएवी जैव वितरण और पारगमन में एक भूमिका निभाने के लिए माना जाता है, और बड़े इंजेक्शन वॉल्यूम का उपयोग कथित तौर पर नेत्रश्लेष्मला स्कारिंग मॉडल27 बनाने के लिए किया गया है। एक महत्वपूर्ण पहलू नेत्रश्लेष्मला की संवहनी प्रकृति है, जिससे एएवी वेक्टर की पर्याप्त प्रणालीगत निकासी हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप एएवी वेक्टर के लिए एंटीबॉडी को बेअसर करने की पीढ़ी होती है। चल रहे शोध सक्रिय रूप से एएवी चिकित्सीय वैक्टर की प्रणालीगत निकासी को कम करने के लिए संभावित रणनीतियों का अध्ययन कर रहे हैं।

इसके अलावा, एससीजे इंजेक्शन के बाद विवो वितरण में इस इंजेक्शन मार्ग के संभावित अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, वितरण की जांच कई समय बिंदुओं या वास्तविक समय में के बजाय एक समय बिंदु पर डाई (भारत स्याही) का उपयोग करके की जाती है। यद्यपि ये डेटा कुछ संकेत प्रदान करते हैं कि इंजेक्शन के तुरंत बाद एएवी वेक्टर समाधान कैसे फैलता है, एएवी वेक्टर और अन्य पदार्थों के वितरण और गतिज गुण समय के साथ काफी भिन्न हो सकते हैं। यद्यपि एएवी वेक्टर के जैव वितरण को क्यूपीसीआर द्वारा विभिन्न आंखों के डिब्बों में पाया गया था, जैसा कि प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर उपरोक्त विधियों के अनुभाग में उल्लेख किया गया है, आदर्श रूप से, एक तकनीक जो वास्तविक समय में आंख भर में चिकित्सीय अभिकर्मकों की तस्करी की निगरानी कर सकती है, का उपयोग किया जाएगा; हालांकि, यह अक्सर व्यवहार में चुनौतीपूर्ण होता है। अंत में, एससीजे इंजेक्शन के बाद चूहों में देखा गया एएवी ट्रांसडक्शन प्रोफाइल माउस आंख और मानव आंख के बीच स्पष्ट आकार, शारीरिक और शारीरिक अंतर के कारण मानव आंखों में भिन्न हो सकता है।

रेटिना रोग भी जीन थेरेपी का एक प्रमुख लक्ष्य हैं; इस प्रकार, एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित एएवी रेटिना ऊतकों तक पहुंच सकता है या नहीं, इसका निर्धारणआगे की परीक्षा के लायक है 13,17,29। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित नैनोकण आंतरिक रेटिना तक पहुंच सकते हैं। हालांकि, विशिष्ट तस्करी मार्ग स्पष्ट नहीं हैं। इंडिया इंक के वितरण डेटा (चित्रा 2) से पता चलता है कि अधिकांश समाधान पेरिओकुलर संयोजी ऊतकों में फैलता है, यह दर्शाता है कि एएवी स्क्लेरा, कोरॉयड और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम को भेदकर पेरिओकुलर पारगम्यता के माध्यम से आंतरिक रेटिना तक पहुंच सकता है।

चित्रा 3 ए में प्रस्तुत कॉर्नियल ट्रांसडक्शन डेटा से पता चलता है कि एससीजे अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया एएवी स्क्लेरा और कॉर्निया में प्रवेश कर सकता है। इससे आगे पता चलता है कि एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से एएवी प्रशासन पूर्ववर्ती कक्ष या यहां तक कि पीछे और विट्रियस कक्षों तक पहुंच सकता है, हालांकि रेटिना30 में वांछनीय प्रभाव प्राप्त करने के लिए काफी अधिक खुराक की आवश्यकता हो सकती है। फिर भी, एससीजे इंजेक्शन सबसे सरल ओकुलर प्रशासन मार्गों में से एक है और कई ओकुलर रोगों के इलाज के लिए एएवी डिलीवरी के लिए बहुत वादा करता है, जिसमें ओकुलर सतह रोगों जैसे लिम्बल स्टेम सेल की कमी, सूखी आंख की बीमारी और / या ओकुलर मांसपेशियों के रोग, जैसे कि ओकुलोफरीन्जियल मस्कुलर डिस्ट्रॉफी शामिल हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एससीएएवी 8-जीएफपी वैक्टर प्रदान करने के लिए उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में वेक्टर कोर, सीजीआईबीडी हिस्टोलॉजी कोर और इस अध्ययन के नैदानिक मूल्यांकन पहलुओं के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ ब्रायन सी गिलगर की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को फाइजर-एनसी बायोटेक डिस्टिंग्विश्ड पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप और अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन से कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी या सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
36 G NanoFil Needles World Precision Instruments NF36BV-2
AAV vector   University of North Carolina at Chapel Hill   /
Acepromazine Henry Schein NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody AVES labs Inc.
Digital camera Cannon Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit Qiagen 80204
 Forceps Fine Science Tools F6521
Hamilton syringe Hamilton 7654-01
India ink StatLab NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution Henry Schein NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film Parafilm 807-6
Polyethylene tubing Becton Dickinson and Company 427401
Proparacaine 0.1% Bausch Health US NDC 24208-730-06
Rebound tonometer Tonovet /
Sodium fluorescein solution Sigma-Aldich 46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump Harvard Bioscience 70-4504
Stereo microscopye Leica Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% Bausch and Lomb Rx only
Topical ointment GenTeal NDC 0078-0429-47
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads ZONE-QUICK PO6448

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
  2. Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
  3. Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
  4. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
  7. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  8. Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
  9. Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
  10. Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
  11. Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
  12. Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
  13. Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
  14. Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
  15. Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
  16. Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
  17. Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
  18. Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
  19. Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
  20. Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
  21. Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
  22. de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
  23. Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
  24. Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
  25. Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
  26. Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
  27. Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
  28. Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
  29. Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
  30. Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).

Tags

मेडिसिन इश्यू 181 सबकॉन्जंक्टिवल इंजेक्शन जीन थेरेपी वायरस एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) आंख कॉर्निया माउस
छोटे पशु मॉडल में एडेनो से जुड़े वायरस वैक्टर का उप-संयोजन प्रशासन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bower, J. J., Song, Z., Song, L.… More

Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models. J. Vis. Exp. (181), e63532, doi:10.3791/63532 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter