Summary
Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.
Abstract
Oküler hastalıklar, çoklu uygulama yolları üzerinden göreceli olarak erişilebilirliklerinin kolaylığı nedeniyle lokal ilaç dağıtımı için cazip hedefler olan çok çeşitli kalıtsal genetik ve edinsel bozuklukları içerir. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyonlar, basit, güvenli ve genellikle ayakta tedavi ortamında gerçekleştirildikleri için diğer göz içi uygulama yollarına göre avantajlar sunar. Küçük hayvanlarda SCJ enjeksiyonları genellikle gözün büyüklüğü nedeniyle ameliyat mikroskobunun yardımını gerektirir. Önceki çalışmalar, spesifik adeno ilişkili virüs (AAV) serotiplerinin SCJ enjeksiyonunun, oküler yüzeyin, göz kasının ve optik sinirin hedeflenen transdüksiyonu için geçerli bir gen dağıtım stratejisi olduğunu ve birçok oküler hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım sağladığını göstermiştir.
Burada, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompasından (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncına izin veren) ve mikroenjeksiyon iğneleriyle birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak bir fare modelinde SCJ enjeksiyonları için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Enjeksiyon sistemi, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir. Oküler gen terapisi çalışmaları için adeno ilişkili viral vektörlerin verilmesi tarif edilmesine rağmen, buradaki protokol küçük hayvan modellerinde çeşitli oftalmik çözeltiler için de uyarlanabilir. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Ek olarak, istenen dokulara AAV doğum onayı için yaygın doğrulama teknikleri de kısaca tartışılacaktır.
Introduction
Oküler hastalıklar hem genetik hem de edinsel bozuklukların geniş bir yelpazesini kapsar. 2015 yılında, dünya çapında tahmini 36 milyon insan yasal olarak kördü ve 1 milyardan fazla insan en azından bir miktar görme bozukluğundan muzdaripti ve bu da hafifletme çabalarını her seviyede ölçeklendirme ihtiyacını vurguladı1. Oküler ilaçların verilmesi için ana yöntemler, göz damlası veya subkonjonktival (SCJ), intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi hem topikal hem de lokal uygulamayı içerir. Noninvaziv topikal tedavi oftalmik ilaçlar için en yaygın dağıtım yöntemi olmasına ve birçok ön segment bozukluğunda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kornea anatomik bariyerlerinin varlığı, topikal olarak uygulanan maddelerin biyoyararlanımı, biyodağılımı ve etkinliği için bir zorluk teşkil etmekte ve bu da iç gözün birçok hastalığı için en iyi aday tedavi yolu olmayabileceğini düşündürmektedir. Hastalıktan etkilenen spesifik oküler kompartmana lokal enjeksiyonun daha etkili ve hedefe yönelik bir ilaç dağıtım yaklaşımı olması muhtemeldir2. Bununla birlikte, tekrarlanan enjeksiyonlardan kaynaklanan olumsuz etkiler uygulama stratejilerini karmaşıklaştırabilir. İdeal olarak, bir terapi tek bir uygulamayı takiben uzun süreli terapötik etkinliği korumalıdır. Bu nedenle, gen tedavisi, gerekli enjeksiyon sayısını en aza indirmek ve oküler hastalığın tedavisi için sürekli transgen ekspresyonu sağlamak için umut verici bir seçenektir 3,4.
Gen tedavisi için çok sayıda viral ve viral olmayan vektör mevcuttur; Bununla birlikte, AAV vektörleri mükemmel güvenlik profilleri nedeniyle yüksek ilgi görmektedir. AAV, başlangıçta 1965 yılında Atchison ve ark. tarafından bir adenovirüs preparatının kirleticisi olarak keşfedilen küçük, tek sarmallı, zarfsız bir DNA virüsüdür.5,6 AAV daha sonra 1980'lerde gen iletimi için etkili bir viral vektör olarak tasarlanmış ve oküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok hastalık için tercih edilen gen terapisi vektörü haline gelmiştir. son birkaç on yılda. Bunlardan en önemlisi, nadir görülen bir arka göz hastalığı olan Leber'in Konjenital Amaurosis'ini tedavi etmek için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan ilk ticari olarak temin edilebilen gen terapisi ilacı voretigene neparvovec'tir. Voretigene neparvovec, klinik gelişimin önündeki engelleri başarıyla aşmış olsa da, ek oküler gen tedavilerinin ticarileştirilmesi için zorluklar devam etmektedir. Örneğin, voretigene neparvovec, subretinal enjeksiyon yoluyla canlı retinal hücreleri tutan hastalara uygulanır. Bu nedenle, canlı retinal hücrelerden yoksun olan hastalığın daha ileri formlarına sahip hastalar, klinik fayda sağlamayacağı için tedavi için uygun değildir. Ek olarak, göz iltihabı, katarakt, retina yırtılması, makülopati ve ağrı dahil olmak üzere subretinal enjeksiyon prosedürü ile ilişkili bilinen komplikasyonlar gözlenmiştir 7,8. Bu prosedürle ilgili diğer endişeler arasında kanama, retina dekolmanı, endoftalmi ve gözdokusu yıkımı yoluyla oküler immün ayrıcalıklı durumun iptal edilmesi olasılığı 9,10,11,12 sayılabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi daha az invaziv gen dağıtım yollarını keşfetme çabaları giderek daha önemli hale gelmiştir 13,14,15,16,17.
Konjonktiva, 3-5 kat hücre içeren ve ön gözü iç göz kapağına bağlayan ince bir zardır. SCJ enjeksiyonları klinik olarak yaşa bağlı makula dejenerasyonu, glokom, retinit ve posterior üveit gibi oküler hastalıkların tedavisinde gözün hem ön hem de / veya arka segmentlerine oftalmik ilaç verilmesi için kullanılır18,19. Uygulanması nispeten basittir, ayaktantedavi ortamında oftalmik ilaç dağıtımı için rutin olarak kullanılırlar, biraz ağrısızdırlar, oküler immün ayrıcalıktan ödün vermezler ve uygulanan ilaçların optik siniri kapsayan geniş bir periorbital bölgeye yayılmasına izin verirler. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonları AAV gen terapisi uygulamaları için cazip bir uygulama yoludur. Farelerde SCJ enjeksiyonu ile uygulanan doğal AAV serotipleri daha önce güvenlik, transdüksiyon etkinliği, serum immünojenisitesi, biyodağılım ve doku özgüllüğü 13,16,21 ile karakterize edilmiştir. Bu veriler, SCJ uygulaması yoluyla bireysel oküler dokulara gen iletiminin resmi bir olasılık olduğunu göstermiştir.
Bu yazıda, bir fare modelinde AAV vektörleri sunmak için SCJ enjeksiyonu için basit ve uyarlanabilir bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bir stereomikroskop, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompası (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncı sağlayan) ve mikroenjeksiyon iğneleri ile birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Bu sistem, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için uyarlanabilir. Ek olarak, AAV enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine izin vermek için sıklıkla bir floresein boyası kullanılır. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Son olarak, istenen dokulara AAV iletiminin doğrulanması için yaygın validasyon teknikleri kısaca tartışılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. AAV vektörlerinin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 biyolojik tehlike riskidir. AAV'yi kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Burada açıklanan deney için, serotip 8 kapsid ile paketlenmiş ve yeşil floresan proteininin (GFP) ekspresyonunu kontrol eden jenerik bir ubiquitous sitomegalovirüs (CMV) promotörünü kodlayan bir rekombinant AAV vektörü kullanılmıştır.
1. AAV vektör işleme ve depolama
- Virüsü -80 °C'lik bir dondurucuda, silikonize veya düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüplerinde 100 μL alikotlarda saklayın.
- Kullanmadan önce tüm vektör stok çözümlerini buz üzerinde çözün.
NOT: Sodyum floresein çözeltisi (% 0.1-2'lik bir son konsantrasyonda) gibi boyalar, enjekte edilen çözeltiyi görselleştirmek için genellikle AAV vektörleri ile karıştırılır. Ek olarak, enjekte edilen çözeltilerin görselleştirilmesi, hava kabarcıklarının tespit edilmesine ve enjeksiyondan sonra AAV dağılımının ve / veya sızıntının izlenmesine yardımcı olur.
2. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyon
- Enjeksiyon sistemini monte edin.
- Enjeksiyon sistemini monte etmek için, bir biyogüvenlik kabinine bir stereomikroskop ve bir şırınga pompası yerleştirin.
NOT: Enjeksiyonları yüksek hassasiyetle gerçekleştirmek için bir infüzyon pompası gereklidir. Burada, 0,5 μL ila 60 mL arasında değişen hacimlerde şırıngalar için sıkı bir kavrama ve güvenli bir şırınga kelepçesi içeren Standart bir İnfüze / Geri Çekme Programlanabilir Şırınga Pompası kullanılmıştır ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu pompa aynı zamanda 1,28 pl/dk'dan 88,28 ml/dk'ya kadar yüksek doğruluk ve pürüzsüz akış hızları ile gelişmiş akış performansı sunar. - Polietilen boruyu yaklaşık 50 cm uzunluğa kadar kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 36 G'lik bir iğnenin göbek ucunu borunun uçlarından birine yerleştirin.
NOT: Sızıntı olmadığından emin olmak için iğne göbeği ucunu ~ 3 mm boyunca boruya kaydırın. 36 G iğne, sonraki SCJ enjeksiyonu için kullanılır. 32 G ile 36 G arasında değişen iğneler, SCJ enjeksiyonları için en yaygın kullanılan boyutlardır. Bu adıma yardımcı olmak için bir hemostat kullanılması, potansiyel keskin yaralanma riskini önlemek için şiddetle tavsiye edilir. - Tek kullanımlık 3 mL'lik bir şırıngayı steril suyla doldurun; Bu tek kullanımlık şırıngayı tüpün iğnenin karşısındaki tarafına yerleştirin ve suyu boru/iğne boyunca yıkayın. Bu adımı% 70 alkolle tekrarlayın.
- Boruyu dezenfekte etmek ve boru boyunca sızıntı, tıkanma veya hasar gözlenmemesini sağlamak için 2.1.4 adımını steril su ve% 70 alkol ile dönüşümlü olarak üç kez daha tekrarlayın.
- Boruyu steril suyla doldurmak için tek kullanımlık 3 mL şırıngayı kullanın ve boruyu tek kullanımlık şırıngaya bağlı bırakın.
- Tezgah yüzeyine bir parça parafilm yerleştirin ve üzerine bir steril su havuzu ekleyin (~ 1 mL). İğneye bağlı borunun bir kısmını steril su havuzuna batırın. Şırınganın çıkarılmasından sonra herhangi bir havanın boru/iğne sistemine girmesini önlemek için tek kullanımlık şırıngayı karşı uçtaki tüp açıklığından dışarı çekin. Borunun iğneye bağlı kısmını su havuzuna batırılmış halde bırakın.
NOT: Laminer başlıkta 2.1.4 ila 2.1.7 arasındaki prosedürleri uygulayın. - 10 μL Hamilton şırınga/iğnesini steril suyla doldurun ve şırıngadaki havayı önleyin. Hamilton şırıngasının tüpünü ve iğne ucunu parafilm üzerindeki steril su havuzuna batırarak Hamilton şırıngasını / iğnesini borunun kalan açık ucuna bağlayın.
- İtici bloğu şırınganın yaklaşık uzunluğuna taşımak için pompa ekranındaki hızlı geri vites düğmesine basın. İtici ve şırınga tutucu bloklar üzerindeki tutucu braketleri gevşetmek için braket sıkıştırma düğmelerini sökün. Hamilton şırıngasını şırınga tutucu bloğuna yükleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek şırıngayı sabitleyin.
NOT: Şırıngayı sabitlemek için, şırınga namlu kelepçesi şırınga namlusuna sıkıca tutturulmalıdır; Bununla birlikte, özellikle cam şırıngaları kullanırken aşırı sıkmayın. Şırınga pistonu, itici blok tutma braketi ile sabitlenmelidir. - Pompa ayarları ekranından parametreleri ayarlayın.
- Kuvvet düğmesine basın ve kuvvet seviyesini %30 olarak ayarlayın. Ayarlar ekranına geri dönmek için değişiklikleri kabul edin.
- Hızlı başlat düğmesine basın ve Yöntem | Demleyin/çekin.
- Şırınga için Hamilton 1700, cam, 10 μL'yi seçin. İnfüzyon ve geri çekilme hızını ve enjeksiyon hacmini seçin.
NOT: Kuvvet seviyesi , şırınga tipine / malzemesine / kapasitesine / üreticilerine bağlı olarak ayarlanır; Her şırınga için önerilen kuvvet için fabrika üreticisinin talimatlarına bakın. Bu deneyde kullanılan enjeksiyon hızı 200 nL / s idi. SCJ enjeksiyonları nispeten güvenlidir ve enjeksiyondan kaynaklanan yüksek göz içi basıncının (IOP) indüksiyonu için daha az endişe vardır. İğneye reflüyü önlemek ve hayvanlar arasındaki enjeksiyonlarda tutarlılığı korumak için bazı uygulamalar için daha yavaş bir enjeksiyon hızı genellikle arzu edilir.
- Suyu Hamilton şırıngasından çıkarın, ancak boru ve enjeksiyon iğnesini suyla dolu bırakın. Boruya/iğneye küçük bir hava kabarcığı sokmak için Geri düğmesine basarak Hamilton şırıngasını hafifçe geri çekin.
NOT: Hava kabarcığı, tüpteki su ile terapötik ilaç (bu durumda, AAV) arasında bir bariyer görevi görecek ve uygulanan dozun doğruluğunu sağlayacaktır. - Enjeksiyon iğnesini virüs stoğunun bir aliquot'una yerleştirerek virüsü geri çekin. Virüs ile tüpteki su arasında görünür bir hava kabarcığı kaldığından emin olun.
NOT: AAV vektörleri plastik boru ve metal iğneye bağlanabilir, bu da virüs kaybına ve / veya yanlış dozaj rejimlerine neden olabilir. Bu nedenle, titizlik, tekrarlanabilirlik ve doğru bir AAV dozu sağlamak için, daha sonra AAV ile temas eden yüzeylerin önceden kaplanması önerilir. Tüp/iğne sistemini virüsle kaplamak için, viral vektör solüsyonunu tüp/iğnenin içine çekin ve iğne ve/veya tüpün duvarına virüs bağlanmasının doygunluğuna izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Virüsü atın.
- Enjeksiyon sistemini monte etmek için, bir biyogüvenlik kabinine bir stereomikroskop ve bir şırınga pompası yerleştirin.
- Virüs enjeksiyonu
- Fareyi inhale anestezi (izofluran) veya intraperitoneal ketamin / ksilazin / asepromazin enjeksiyonu ile anestezi yapın. Anestezinin cerrahi düzlemini, sert ayak parmağı sıkışmalarına yanıt eksikliği ile onaylayın.
NOT: En az 6 haftalık dişi ve/veya erkek C57BL/6J veya BALB/c fareleri kullanın. Ketamin / ksilazin / asepromazin dozları aşağıdaki gibidir: 70 mg / kg'da ketamin, 7 mg / kg'da ksilazin ve 1.5 mg / kg'da asepromazin. - Enjeksiyonu alacak göze topikal anestezi uygulayın.
NOT: Topikal anestezi için %0.1 proparakain hidroklorür ve/veya tetrakain hidroklorür oftalmik solüsyon (%0.5) kullanın. - Kuruluk ve yaralanmayı önlemek için enjeksiyon almayacak diğer göze topikal merhem uygulayın.
- Fareyi mikroskobik sahneye yerleştirin ve fare gözünü stereomikroskop altında ortaya çıkarın.
- İki parmağınızı göz kapağına yerleştirin ve göz kapağını skleraya bağlayan iç zar olan konjonktivayı ortaya çıkarmak için farenin gözünden hafifçe çekin.
- Konjonktivayı forseps ile tutun.
- Göz kapağını serbest bırakın ve iğneyi baskın eli kullanarak eğim yukarı bakacak şekilde tutun.
- İğneyi konjonktivaya yerleştirin. İğneyi, konik konjonktiva zarı tarafından tamamen kaplanana kadar yerleştirin. İğneyi dünyaya yaslayın.
NOT: Konjonktiva şeffaf bir membran olduğundan, iğne ucu / eğimi kolayca görülebilir. - Ayak pedalını kullanarak Başlat düğmesine basarak enjeksiyonu başlatın.
NOT: Havanın hareketi ve Hamilton pistonu senkronize edilir; herhangi bir gecikme, enjeksiyon sistemindeki aşırı havayı veya muhtemelen boru, iğne ve / veya şırınga bileşenleri arasında gevşek bir bağlantıyı gösterir. - Enjeksiyon bittikten sonra, geri akış olasılığını azaltmak için iğneyi konjonktivadan çekmeden önce iğneyi 10 s yerinde tutun.
NOT: SCJ enjeksiyonunun yapıldığı yerde bir bleb'in görünmesi yaygındır. Bu tür lekeler normalde enjeksiyondan sonraki birkaç saat içinde tamamen çözülür. - Oküler kuruluk/yaralanmayı önlemek için topikal yağlayıcı jeli farenin gözlerine bir damla koyun ve ardından iyileşmek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Enjeksiyon sonrası oküler anormallikleri değerlendirmek için gözyaşı üretimi, GİB ve yarık lamba muayenesi gibi oküler muayeneleri kornea floresein boyama ile birlikte yapın.
NOT: Gözyaşı üretimi bir Fenol Kırmızı İplik testi ile ölçülür ve fare gözünün IOP'sini incelemek için genellikle bir tonometre kullanılır. İntravitreal enjeksiyonlar gibi bazı göz içi enjeksiyonların GİB'de anlamlı bir artışa neden olabileceği bildirilmektedir; Bununla birlikte, SCJ enjeksiyonundan sonra GİB değişiklikleri belirgin değildir 13,22,23,24.
- Fareyi inhale anestezi (izofluran) veya intraperitoneal ketamin / ksilazin / asepromazin enjeksiyonu ile anestezi yapın. Anestezinin cerrahi düzlemini, sert ayak parmağı sıkışmalarına yanıt eksikliği ile onaylayın.
- Subkonjonktival enjeksiyon sonrası AAV biyodağılım ve transdüksiyon etkinliği incelemesi
- SCJ ile iletilen AAV vektörlerinin viral genom biyodağılımını ve / veya transdüksiyon profilini araştırmak için, fareleri AVMA onaylı yöntemle ötenazileştirin.
NOT: Bu deneyde, fareler enjeksiyondan 8 hafta sonra kurban edildi. - Hedeflenen oküler kompartmanlarda biyodağılım ve transgen ekspresyonu için, göz kapakları, kornea, konjonktiva, göz kası, retina ve optik sinir gibi ilgili dokuları diseke edin. Tüm dokuları flaşla dondurun ve -80 °C'de saklayın. Tüm vücut AAV biyodağılımını incelemek için, submandibuler lenf düğümleri ve karaciğer gibi organları toplayın ve flaş dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Bir DNA / RNA ekstraksiyon kiti kullanarak, sırasıyla transgen ekspresyonunu ve AAV biyodağılımını incelemek için aynı örnekten gDNA ve RNA toplayın. Sadece vektör biyodağılımı isteniyorsa, gDNA'yı çıkarmak için bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın.
- AAV vektör biyodağılımını ve cDNA bolluğunu belirlemek için vektör transgenine özgü primerler/problar13,25 kullanarak standart qPCR ve RT-qPCR gerçekleştirin.
- Histoloji analizi için gözleri sabitleyin, parafine gömün ve 5 μm kalınlığında kesin. Transgen ekspresyonu26'yı ortaya çıkarmak için standart immünofloresan boyama işlemini gerçekleştirin.
- SCJ ile iletilen AAV vektörlerinin viral genom biyodağılımını ve / veya transdüksiyon profilini araştırmak için, fareleri AVMA onaylı yöntemle ötenazileştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Subkonjonktival boşluğa enjekte edilen çözelti, enjeksiyon hacmine bağlı olarak bir bleb olarak ortaya çıkar.
Bu deneyde,% 0.1'lik son konsantrasyonda floresein ile karıştırılmış 7 μL AAV (7 × 109 viral genom (vg) / göz), stereomikroskop altında 36 G'lik bir iğne ile enjekte edildi ve enjeksiyon hızı / basıncı, 1 μL / s'de programlanabilir bir şırınga pompası kullanılarak sabit tutuldu. Enjeksiyon sırasında bir bleb görünebilir (ok). Murin SCJ bölmesine AAV vektör uygulamasının mikroskobik bir görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.
Subkonjonktival boşluğa enjekte edilen maddeler gözün küresi etrafına yayılır ve perioküler dokular boyunca dağılır.
SCJ enjeksiyonu yoluyla uygulanan AAV'nin dağılımını tanımlamak için, anesteziden sonra 10 aylık bir farenin subkonjonktival boşluğuna 7 μL seyreltilmiş Hindistan mürekkebi enjekte edildi. SCJ enjeksiyonu sırasında veya sonrasında kanama, sızıntı veya geri akış tespit edilmedi. Enjeksiyondan otuz dakika sonra, oküler ve çevresindeki dokular toplandı ve daha sonra Hindistan mürekkebinin dağılımını görselleştirmek için Hematoksilin ve Eozin (H & E) ile boyandı. Şekil 2'de tasvir edilen temsili sagital bölümler, Hindistan mürekkebinin dağılımının esas olarak ekstraoküler kaslara, skleranın dış yüzeyine ve perioküler gevşek bağ dokularına bitişik olarak gerçekleştiğini göstermektedir (Şekil 2).
Kendini tamamlayan AAV8, SCJ'yi takiben kornea ve perioküler kasları başarıyla dönüştürür.
Enjeksiyondan sekiz hafta sonra kendi kendini tamamlayan AAV8'in transdüksiyon profilini belirlemek için, tüm dünya kesitlerindeki GFP bolluğu, 1:500'lük bir seyreltmede bir anti-GFP antikoru kullanılarak immünofloresan boyama yoluyla incelendi. Görüntüler floresan mikroskop altında çekildi (Şekil 3). Bu sonuçlar, SCJ enjeksiyonu yoluyla uygulanan AAV vektörlerinin, perioküler kasları posterior olarak göze ve korneaya etkili bir şekilde dönüştürdüğünü ortaya koymuştur.
SCJ enjeksiyonunu takiben farklı göz bölmelerinde bol vektör genomu ve transgen ekspresyonu
Vektör biyodağılımını ve transgen ekspresyonunu kantitatif olarak analiz etmek için, farklı göz bölmelerindeki ve karaciğer ve kalp gibi organlardaki vektör genom kopya numaraları qPCR (Şekil 4A), transgen ekspresyonu qRT-PCR ile test edildi (Şekil 4B). Bu sonuçlar, AAV8'in SCJ enjeksiyonunun göz kapağında, konjonktivada, korneada ve optik sinirde transgen ekspresyonu ile sonuçlandığını göstermektedir.
Resim 1: AAV vektörünün murin SCJ uzayına uygulanmasının mikroskobik görünümü. İşlem sırasında bir bleb oluşumunun görselleştirilmesine izin vermek için, AAV vektör preparatına% 1 floresein doğrudan eklenmiştir. Görüntüler stereomikroskopa bağlı bir dijital kamera kullanılarak çekildi. (A) Enjekte edilmemiş bir gözün temsili görüntüsü; (B) enjekte edilen gözün temsili görüntüsü. Ok, SCJ boşluğunda floresein içeren enjekte edilen AAV çözeltisini gösterir. Kısaltmalar: AAV = Adeno ilişkili virüs; SCJ = subkonjonktival. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare gözüne SCJ enjeksiyonundan sonra Hindistan mürekkep dağılımının (ok) H&E boyaması. Hindistan mürekkebi enjekte edilen bir gözün Sagital bölümleri sunulmuştur; Belirtilen bölgeye 7 μL Hindistan mürekkebi enjekte edildi. *, Enjeksiyon bölgesi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltmalar: SCJ = subkonjonktival; H&E = hematoksilin ve eozin; C = kornea; I = iris; L = lens; R = Retina; E = göz kapağı; H = Harderian bezi; M = kas. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SCJ enjeksiyonundan sonra kendini tamamlayan AAV8'in temsili GFP histoloji görüntüleri. SCJ enjeksiyonunu takiben kornea (A) ve göz kaslarının (B) transdüksiyonu. GFP ekspresyonu (yeşil), bir anti-GFP antikoru ile parafin gömülü doku kesitlerinde immün boyama yoluyla görselleştirildi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 100 μm (göz kası), 20 μm (kornea). Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; AAV = adeno ilişkili virüs; SCJ = subkonjonktival; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vektör biyodağılımının ve transgen ekspresyonunun kantitatif analizi. (A) SCJ'yi takiben göz bölmelerinde (göz kapağı, konjonktiva, kornea, optik sinir ve retina) ve diğer organlarda (karaciğer ve kalp) vektör biyodağılımı, konakçı genom DNA'sının vektör genom kopya numarası / μg olarak sunulur. (B) QRT-PCR tarafından belirlenen GFP bolluğu, vektör cDNA kopya numarası/konakçı transkripti olarak sunulur. Bu rakam 13'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: SCJ = subkonjonktival; qRT-PCR = kantitatif revere-transkripsiyon PCR; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV aracılı gen tedavisi, oküler hastalıkların tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. Günümüzde oküler gen tedavisi intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar olmak üzere iki ana lokal uygulama yoluna dayanmaktadır. Ne yazık ki, her iki yol da invazivdir ve retina dekolmanı, katarakt oluşumu ve endoftalmi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi nispeten daha az invaziv yolların araştırılması büyük ilgi çekicidir.
Bu teknik nispeten basit ve önemli ölçüde daha az invaziv olmasına rağmen, AAV dağıtımının vurgulanması gereken birkaç önemli yönü vardır. AAV vektörünün, çoklu donma-çözülme döngülerini önlemek ve viral titrede bir azalmayı önlemek için silikonize veya düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüplerinde istenen hacimdeki alikotlarda -80 ° C'de (burada 100 μL) saklanması önerilir. Bu deneyde kullanılan vektör, önemli bir titre kaybı olmadan ~ 6 yıl boyunca -80 ° C'de saklandı. Ek olarak, araç bileşimi vektörün stabilitesini etkileyebilir. Bu deneyde, virüs aracı 350 mM NaCl +% 5 D-sorbitol ile PBS idi. Bu çalışmada kullanılan virüsün titresi 5.1 × 10 9 vg/μL (qPCR ile belirlendi) idi ve toplam 7 × 109 vg/göz uygulandı. Ancak hedeflenen dokuya ve transgene bağlı olarak 1 × 108-1 ×10 vg/göz aralığı uygundur.
SCJ enjeksiyonları, uygulanan hacim açısından nispeten daha az kısıtlayıcıdır (fare için 1-100 μL). Bununla birlikte, hacim farklılıklarının AAV biyodağılımında ve transdüksiyonunda rol oynadığı düşünülmektedir ve konjonktival skar modeli27 oluşturmak için daha büyük enjeksiyon hacimlerinin kullanıldığı bildirilmektedir. Önemli bir husus, konjonktivanın vasküler doğasıdır, bu da AAV vektörünün önemli sistemik klerensine yol açabilir, böylece AAV vektörüne nötralize edici antikorların üretilmesine neden olabilir. Devam eden araştırmalar, AAV terapötik vektörlerinin sistemik klirensini azaltmak için potansiyel stratejileri aktif olarak incelemektedir.
Ek olarak, SCJ enjeksiyonunu takiben in vivo dağılım, bu enjeksiyon yolunun potansiyel uygulaması için kritik bir husustur. Mevcut protokolde, dağılım birden fazla zaman noktası yerine bir zaman noktasında veya gerçek zamanlı olarak bir boya (Hindistan mürekkebi) kullanılarak incelenir. Bu veriler, AAV vektör çözeltisinin enjeksiyondan hemen sonra nasıl yayıldığına dair bazı göstergeler sağlasa da, AAV vektörünün ve diğer maddelerin dağılımı ve kinetik özellikleri zamanla önemli ölçüde değişebilir. AAV vektörünün biyodağılımı qPCR ile farklı göz bölmelerinde tespit edilmesine rağmen, deneysel bitiş noktasında yukarıdaki yöntemler bölümünde belirtildiği gibi, ideal olarak, terapötik reaktiflerin göz boyunca gerçek zamanlı olarak ticaretini izleyebilecek bir teknik kullanılacaktır; ancak, bu genellikle pratikte zordur. Son olarak, SCJ enjeksiyonunu takiben farelerde gözlenen AAV transdüksiyon profili, fare gözü ile insan gözü arasındaki belirgin boyut, anatomik ve fizyolojik farklılıklar nedeniyle insan gözlerinde farklılık gösterebilir.
Retina hastalıkları da gen tedavisinin önemli bir hedefidir28; Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu ile uygulanan AAV'nin retina dokularına ulaşıp ulaşamayacağının belirlenmesi daha ileri incelemeye değerdir13,17,29. Önceki çalışmalar, SCJ enjeksiyonları yoluyla uygulanan nanopartiküllerin iç retinaya ulaşabileceğini göstermiştir. Ancak, belirli trafik işlemleri yolları belirsizdir. Hindistan mürekkebinin dağılım verileri (Şekil 2), çözeltinin çoğunun perioküler bağ dokularına yayıldığını ve AAV'nin sklera, koroid ve retinal pigmentli epitele nüfuz ederek perioküler permeasyon yoluyla iç retinaya ulaşabileceğini göstermektedir.
Şekil 3A'da sunulan kornea transdüksiyon verileri, SCJ boşluğuna enjekte edilen AAV'nin sklera ve korneaya nüfuz edebileceğini düşündürmektedir. Bu ayrıca, SCJ enjeksiyonu yoluyla AAV uygulamasının ön kamaraya veya hatta arka ve vitreus odalarına ulaşabileceğini, ancak retina30'da istenen etkileri elde etmek için önemli ölçüde daha yüksek bir dozun gerekli olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, SCJ enjeksiyonu en basit oküler uygulama yollarından biridir ve limbal kök hücre eksikliği, kuru göz hastalığı ve / veya okülofaringeal kas distrofisi gibi oküler kasların hastalıkları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çoklu oküler hastalıkların tedavisinde AAV doğumu için büyük umut vaat etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan scAAV8-GFP vektörlerini, CGIBD Histoloji Çekirdeğini ve Dr. Brian C. Gilger'in laboratuvarını bu çalışmanın klinik değerlendirme yönleriyle ilgili yardımları için sağladıkları için Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Vector Core'a teşekkür eder. Bu çalışma, Pfizer-NC Biotech Seçkin Doktora Sonrası Bursu ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği ve Kistik Fibroz Vakfı'ndan Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Kistik Fibroz Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
