Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Summary

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Abstract

As doenças oculares incluem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos hereditários que são alvos atraentes para a administração local de medicamentos devido à sua relativa facilidade de acessibilidade através de várias vias de administração. As injeções subconjuntivais (SCJ) oferecem vantagens em relação a outras vias de administração intraocular, pois são simples, seguras e geralmente realizadas em ambiente ambulatorial. As injeções de SCJ em pequenos animais geralmente requerem a assistência de um microscópio cirúrgico devido ao tamanho do olho. Trabalhos anteriores demonstraram que a injeção de SCJ de sorotipos específicos de vírus adenoassociados (AAV) é uma estratégia válida de entrega de genes para transdução direcionada da superfície ocular, músculo ocular, córnea e nervo óptico, fornecendo uma abordagem potencial para o tratamento de muitas doenças oculares.

Neste documento, um protocolo detalhado é apresentado para injeções SCJ em um modelo de camundongo usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. O sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Embora a entrega de vetores virais adenoassociados para estudos de terapia gênica ocular seja descrita, o protocolo aqui também pode ser adaptado para uma variedade de soluções oftálmicas em pequenos modelos animais. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Além disso, técnicas comuns de validação para a confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados também serão brevemente discutidas.

Introduction

As doenças oculares abrangem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos. Em 2015, estima-se que 36 milhões de pessoas eram legalmente cegas em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas sofrem de pelo menos algum nível de deficiência visual, destacando a necessidade de ampliar os esforços de alívio em todos os níveis¹. Os principais métodos para a administração de medicamentos oculares incluem administração tópica e local, como colírios ou injeções subconjuntivais (SCJ), intracamerais, intravítreas e sub-retinianas. Embora a terapia tópica não invasiva seja o método de administração mais comum para drogas oftálmicas e seja amplamente u....

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. O uso de vetores AAV é um risco de biossegurança Nível 1. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear o AAV. Para o experimento aqui descrito, foi utilizado um vetor AAV recombinante embalado com o capsídeo do sorotipo 8 e codificando um promotor genérico de citomegalovírus ubíquo (CMV) controlando a expressão da proteína de fluorescência verde (GFP).

1. Manuseio e armazenamento de veto....

Results

A solução injetada no espaço subconjuntival apresenta-se como uma bolha dependendo do volume de injeção.
Neste experimento, 7 μL de AAV (7 × 10⁹ genomas virais (vg)/olho) misturados com fluoresceína na concentração final de 0,1% foram injetados com uma agulha de 36 G sob estereomicroscópio, e a velocidade/pressão de injeção foi mantida constante usando uma bomba de seringa programável a 1 μL/s. Uma bolha pode aparecer após a injeção (seta). Uma visão microscópica da administração do vetor A.......

Discussion

A terapia genética mediada por AAV tem um grande potencial para o tratamento de doenças oculares. A terapia genética ocular atual depende de duas vias principais de administração local, injeções intravítreas e sub-retinianas. Infelizmente, ambas as vias são invasivas e podem causar sérias complicações, incluindo descolamento de retina, formação de catarata e endoftalmite. Assim, a investigação de vias relativamente menos invasivas, como a injeção de SCJ, é de grande interesse.

Embora essa técn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agulhas NanoFil de 36 G World	Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill	/
Acepromazina	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anticorpo anti-GFP	AVES labs Inc.
Câmera digital	Cannon	Cannon EOS T5i
Kit de extração de DNA/RNA	Qiagen	80204
Fórceps	Fine Science Tools	F6521
Seringa Hamilton	Hamilton	7654-01
Tinta da Índia	StatLab	NC9903975
Solução de injeção de cloridrato de cetamina	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Filme resistente à umidade	Parafilm	807-6
Tubo de polietileno	Becton Dickinson e Empresa	427401
Proparacaína 0,1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Tonômetro de rebote	Tonovet	/
solução de fluoresceína de sódio	Sigma-Aldich	46960
Bomba padrão de infusão / retirada 11 Pico Plus Elite Bomba de seringa programável	Harvard Bioscience	70-4504
Microscopia estéreo	Leica	Mz6
Cloridrato de Tetracaína Solução Oftálmica 0,5%	Bausch e Lomb	Rx apenas
Pomada tópica	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448