Summary
本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。
Abstract
眼疾患には、広範囲の遺伝性遺伝性疾患および後天性疾患が含まれ、複数の投与経路を介したアクセスが比較的容易であるため、局所薬物送達の魅力的な標的です。結膜下注射(SCJ)は、簡単で安全であり、通常は外来で行われるため、他の眼内投与経路よりも優れています。小動物へのSCJ注射は、通常、目の大きさのために手術用顕微鏡の支援を必要とする。以前の研究では、特定のアデノ随伴ウイルス(AAV)血清型のSCJ注射が、眼表面、眼の筋肉、角膜、視神経の標的形質導入のための有効な遺伝子送達戦略であり、多くの眼疾患の治療に潜在的なアプローチを提供することが実証されています。
ここでは、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)とマイクロインジェクション針と結合された気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムを使用したマウスモデルでのSCJ注射の詳細なプロトコルが提示されます。注射システムは、小動物における間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路にも適応可能である。眼の遺伝子治療研究のためのアデノ随伴ウイルスベクターの送達が記載されているが、本明細書のプロトコルは、小動物モデルにおける様々な眼科溶液にも適合させることができる。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。さらに、所望の組織へのAAV送達確認のための一般的な検証技術についても簡単に説明します。
Introduction
眼疾患は、遺伝性疾患と後天性疾患の両方の広い範囲を網羅しています。2015年には、世界中で推定3,600万人が法的に失明し、10億人以上が少なくともある程度の視覚障害に苦しんでおり、すべてのレベルで緩和の取り組みを拡大する必要性が浮き彫りになりました1。眼薬を送達するための主な方法には、点眼薬または結膜下注射(SCJ)、皮内注射、硝子体内注射、および網膜下注射などの局所投与と局所投与の両方が含まれます。非侵襲的局所療法は眼科用薬物の最も一般的な送達方法であり、多くの前眼部障害に広く使用されていますが、角膜の解剖学的障壁の存在は、局所投与された物質のバイオアベイラビリティ、生体分布、および有効性に課題を提示し、それが多くの内眼疾患の最良の候補治療経路ではない可能性があることを示唆しています。疾患の影響を受ける特定の眼コンパートメントへの局所注射は、より効果的で標的を絞った薬物送達アプローチである可能性があります2。ただし、繰り返しの注射に起因する副作用は、投与戦略を複雑にする可能性があります。.理想的には、治療は単回投与後に長期的な治療効果を維持する必要があります。.したがって、遺伝子治療は、必要な注射の回数を最小限に抑え、眼疾患の治療のための持続的な導入遺伝子発現を提供するための有望な選択肢である3,4。
多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが遺伝子治療に利用可能です。ただし、AAVベクターは、その優れた安全性プロファイルのために高い関心を集めています。AAVは、1965年にAtchisonらによってアデノウイルス製剤の汚染物質として最初に発見された小さな一本鎖非エンベロープDNAウイルスです5,6AAVは、その後1980年代に遺伝子送達のための効率的なウイルスベクターとして設計され、眼疾患を含む多くの疾患に最適な遺伝子治療ベクターになりました。 過去数十年にわたって。これらの中で最も注目に値するのは、まれな後眼疾患であるレーバー先天性アマウロシスを治療するために米国食品医薬品局によって承認された最初の市販の遺伝子治療薬であるボレチゲンネパルボベックです。ボレチゲンネパルボベックは臨床開発の障壁をうまく克服しましたが、追加の眼遺伝子治療の商業化には課題が残っています。例えば、ボレチゲンネパルボベックは、網膜下注射を介して生存可能な網膜細胞を保持する患者に投与される。したがって、生存可能な網膜細胞を欠くより進行した形態の疾患を有する患者は、臨床的利益をもたらさないため、治療の資格がない。さらに、眼の炎症、白内障、網膜裂傷、黄斑症、および疼痛を含む、網膜下注射手順に関連する既知の合併症が観察された7,8。この手順に関連する他の懸念には、出血、網膜剥離、眼内炎、および眼組織の破壊による眼免疫特権状態の取り消しの可能性が含まれます9,10,11,12。したがって、SCJ注射などの侵襲性の低い遺伝子送達経路を探索する努力はますます重要になっている13、14、15、16、17。
結膜は、3〜5層の細胞を含み、前眼を内眼瞼に接続する薄い膜です。SCJ注射は、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜炎、後部ブドウ膜炎などの眼疾患の治療のために、眼の前部および/または後部の両方への眼科用薬物送達に臨床的に使用されます18,19。それらは比較的簡単に実行でき、外来患者の設定20での眼科用薬物送達に日常的に使用され、やや痛みがなく、眼の免疫特権を損なうことはなく、投与された薬物が視神経を含む大きな眼窩周囲領域に広がることを可能にします。したがって、SCJ注射はAAV遺伝子治療アプリケーションにとって魅力的な投与経路です。マウスにSCJ注射を介して投与された天然のAAV血清型は、安全性、形質導入効率、血清免疫原性、生体分布、および組織特異性について以前に特徴付けられています13、16、21。これらのデータは、SCJ投与による個々の眼組織への遺伝子送達が正式な可能性であることを示した。
この論文では、マウスモデルでAAVベクターを送達するためのSCJ注入のための簡単で適応可能なプロトコルについて説明します。このアプローチの再現性を確保するために、実体顕微鏡、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)、およびマイクロインジェクションニードルと組み合わせた気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムについて説明します。このシステムは、小動物の間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路に適応できます。さらに、フルオレセイン色素は、AAV注射部位の可視化を可能にするためにしばしば利用される。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。最後に、所望の組織へのAAV送達を確認するための一般的な検証技術について簡単に説明します。
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Protocol
すべての動物の手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理および使用委員会の規則に従って実行されました。AAVベクターの使用は、バイオセーフティレベル1のバイオハザードリスクです。AAVを取り扱うときは、白衣、手袋、ゴーグルなどの適切な個人用保護具を着用してください。本明細書に記載の実験のために、血清型8キャプシドをパッケージ化し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を制御する一般的なユビキタスサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターをコードする組換えAAVベクターを利用した。
1. AAVベクターの取り扱いと保存
- ウイルスを-80°Cの冷凍庫に、シリコン処理または低保持のマイクロ遠心チューブに100 μLアリコートで保存します。
- 使用前にすべてのベクターストック溶液を氷上で解凍します。
注:フルオレセインナトリウム溶液(最終濃度0.1〜2%)などの色素は、注入された溶液を視覚化するためにAAVベクターと混合されることがよくあります。さらに、注入された溶液を視覚化することで、気泡を検出し、注入後のAAV分布や漏れを監視することができます。
2.結膜下注射(SCJ)
- 注入システムを組み立てます。
- 注入システムを組み立てるには、実体顕微鏡とシリンジポンプをバイオセーフティキャビネットに配置します。
注:高精度で注入を行うには、輸液ポンプが必要です。ここでは、0.5μLから60mLの範囲の容量のシリンジ用のタイトグリップと安全なシリンジクランプを含む、標準的な注入/引き出しプログラム可能なシリンジポンプが使用されています( 材料の表を参照)。このポンプはまた、1.28 pl/minから88.28 ml/minまでの高精度でスムーズな流量で強化された流量性能を提供します。 - ポリエチレンチューブを約50cmの長さに切断します( 材料の表を参照)。
- 36 Gの針のハブの端をチューブの端の1つに挿入します。
注意: ニードルハブの端をチューブに~3mmスライドさせて、漏れが発生しないようにします。36Gの針は、その後のSCJ注射に使用されます。32Gから36Gの範囲の針は、SCJ注射に最も一般的に使用されるサイズです。このステップを支援するために止血剤を使用することは、鋭利な怪我の潜在的なリスクを回避するために強く推奨されます。 - 使い捨ての3mLシリンジに滅菌水を入れます。この使い捨てシリンジを針の反対側のチューブの側面に挿入し、チューブ/針全体に水を洗い流します。70%アルコールでこの手順を繰り返します。
- 手順2.1.4をさらに3回繰り返し、滅菌水と70%アルコールを交互にフラッシュして、チューブを消毒し、チューブ全体に漏れ、詰まり、または損傷が観察されないことを確認します。
- 使い捨ての3 mLシリンジを使用してチューブに滅菌水を満たし、チューブを使い捨てシリンジに取り付けたままにします。
- ベンチの表面にパラフィルムを置き、滅菌水(~1 mL)のプールを追加します。針に接続されているチューブの部分を滅菌水のプールに沈めます。使い捨てシリンジを反対側の端のチューブ開口部から引き出して、シリンジを取り外したときにチューブ/ニードルシステムに空気が入らないようにします。針に接続されているチューブの部分を水たまりに沈めたままにします。
注意: 層流フードで手順2.1.4から2.1.7を実行します。 - 10 μLのハミルトンシリンジ/ニードルに滅菌水を入れ、シリンジ内の空気を避けます。ハミルトンシリンジのチューブと針の先端をパラフィルム上の滅菌水のプールに沈めて、ハミルトンシリンジ/ニードルをチューブの残りの開放端に接続します。
- ポンプ画面の 高速リバース ボタンを押して、プッシャーブロックをシリンジのおおよその長さに移動します。ブラケットclを緩めますampノブを緩めて、プッシャーとシリンジホルダーブロックの保持ブラケットを緩めます。ハミルトンシリンジをシリンジホルダーブロックにロードし、製造元の指示に従ってシリンジを固定します。
注意: シリンジを固定するには、シリンジバレルclする必要がありますamp シリンジバレルに対してしっかりと固定する必要があります。ただし、特にガラス注射器を使用する場合は、締めすぎないでください。シリンジプランジャーは、プッシャーブロック保持ブラケットで固定する必要があります。 - ポンプ設定画面でパラメータを調整します。
- [強制]ボタンを押して、力のレベルを30%に設定します。変更を受け入れて設定画面に戻ります。
- クイックスタートボタンを押して、方法を選択します|注入/撤退。
- シリンジには、ハミルトン1700、ガラス、10 μLを選択します。注入と撤退率と注入量を選択します。
注意: 力のレベル は、シリンジのタイプ/材料/容量/メーカーに応じて設定されます。各シリンジの推奨力については、工場メーカーの指示を参照してください。本実験で用いた注入速度は200nL/sであり、SCJ注射は比較的安全であり、注射による眼圧上昇(IOP)の誘発の懸念は少ない。針への逆流を避け、動物間の注射の一貫性を維持するために、特定の用途では注入速度を遅くすることが望ましいことがよくあります。
- ハミルトンシリンジから水を排出しますが、チューブと注射針は水でいっぱいのままにします。 リバース ボタンを押してハミルトンシリンジを少し引き戻し、チューブ/ニードルに小さな気泡を導入します。
注:気泡は、チューブ内の水と治療薬(この場合はAAV)の間のバリアとして機能し、投与された用量の精度を保証します。 - 注射針をウイルスストックのアリコートに入れてウイルスを回収します。ウイルスとチューブ内の水の間に目に見える気泡が残っていることを確認してください。
注:AAVベクターはプラスチックチューブや金属針に結合し、ウイルスの喪失や不正確な投与計画につながる可能性があります。したがって、AAVの厳密さ、再現性、および正確な線量を確保するために、その後AAVと接触する表面をプレコーティングすることをお勧めします。チューブ/ニードルシステムをウイルスでコーティングするには、ウイルスベクター溶液をチューブ/ニードルに引き込み、室温で10分間インキュベートして、ニードルおよび/またはチューブの壁に結合するウイルスを飽和させます。ウイルスを破棄します。
- 注入システムを組み立てるには、実体顕微鏡とシリンジポンプをバイオセーフティキャビネットに配置します。
- ウイルスインジェクション
- 吸入麻酔(イソフルラン)またはケタミン/キシラジン/アセプロマジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します。.しっかりとしたつま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の手術面を確認します。
注:少なくとも6週齢の雌および/または雄のC57BL / 6JまたはBALB / cマウスを使用してください。.ケタミン/キシラジン/アセプロマジンの用量は次のとおりです:70 mg / kgのケタミン、7 mg / kgのキシラジン、および1.5 mg / kgのアセプロマジン。. - 注射を受ける目に局所麻酔をかけます。
注:局所麻酔には、0.1%塩酸プロパラカインおよび/または塩酸テトラカイン点眼液(0.5%)を使用してください。. - 乾燥や怪我を防ぐために、注射を受けないもう一方の目に局所軟膏を塗ります。
- マウスを顕微鏡ステージに配置し、実体顕微鏡下でマウスの目を露出させます。
- まぶたに2本の指を置き、マウスの目から少し引き離して、まぶたと強膜をつなぐ内膜である結膜を露出させます。
- 鉗子で結膜をつかみます。
- まぶたを放し、利き手を使って斜角を上に向けて針を持ちます。
- 針を結膜に挿入します。ベベルが結膜で完全に覆われるまで針を挿入します。地球に対して針を置きます。
注:結膜は透明な膜であるため、針先/斜角は簡単に見えます。 - フットスイッチを使用して スタート ボタンを押して注入を開始します。
注意: 空気の動きとハミルトンプランジャーは同期しています。遅延は、注入システム内の過剰な空気、またはチューブ、針、および/またはシリンジコンポーネント間の接続が緩んでいる可能性があります。 - 注射が終了したら、針を結膜から引き抜く前に針を10秒間保持して、逆流の可能性を減らします。
注:SCJ注射の部位にブレブが現れるのはよくあることです。このようなブレブは通常、注射後数時間以内に完全に解消します。 - 眼の乾燥/損傷を防ぐためにマウスの目に局所潤滑剤ゲルを一滴置き、次にマウスを加熱パッドに置いて回復させます。
- 涙液産生、IOP、細隙灯検査などの眼内検査を角膜フルオレセイン染色と併せて行い、注射後の眼の異常を評価します。
注:涙液の生成はフェノールレッドスレッドテストによって測定され、眼圧計はマウスの目のIOPを調べるためによく使用されます。硝子体内注射などの一部の眼内注射は、IOPの大幅な増加をもたらす可能性があると報告されています。しかしながら、SCJ注射後のIOP変化は明らかではない13、22、23、24。
- 吸入麻酔(イソフルラン)またはケタミン/キシラジン/アセプロマジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します。.しっかりとしたつま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の手術面を確認します。
- 結膜下注射後のAAV生体分布および形質導入効率試験
- SCJを介して送達されるAAVベクターのウイルスゲノムの生体分布および/または形質導入プロファイルを調べるには、AVMA承認の方法でマウスを安楽死させます。
注:この実験では、マウスを注射後8週間で屠殺した。 - 標的眼コンパートメントでの生体分布および導入遺伝子発現のために、まぶた、角膜、結膜、眼筋、網膜、視神経などの関心のある関連組織を解剖します。すべての組織をフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。 全身のAAVの生体分布を調べるには、顎下リンパ節や肝臓などの臓器を採取し、-80°Cで瞬間凍結して保存します。
- DNA/RNA抽出キットを使用して、同じサンプルからgDNAとRNAを収集し、導入遺伝子発現とAAVの生体分布をそれぞれ調べます。ベクターの生体分布のみが必要な場合は、DNA抽出キットを使用してgDNAを抽出します。
- ベクター導入遺伝子特異的プライマー/プローブを使用して、標準的なqPCRおよびRT-qPCRを実行し、AAVベクターの生体分布およびcDNAの存在量を測定します13,25。
- 組織学分析では、目を固定し、パラフィンに埋め込み、5μmの厚さで切片化します。標準的な免疫蛍光染色を行い、導入遺伝子発現を明らかにした26。
- SCJを介して送達されるAAVベクターのウイルスゲノムの生体分布および/または形質導入プロファイルを調べるには、AVMA承認の方法でマウスを安楽死させます。
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Representative Results
結膜下腔に注入された溶液は、注入量に応じてブレブとして現れる。
本実験では、フルオレセインと最終濃度0.1%で混合したAAV(7 ×10 9 ウイルスゲノム(vg)/眼)7 μLを実体顕微鏡下で36 G針で注入し、プログラム可能なシリンジポンプを用いて注入速度/圧力を1 μL/sで一定に保ちました。注射時にブレブが現れることがあります(矢印)。マウスSCJ区画へのAAVベクター投与の顕微鏡図を 図1に示す。
結膜下腔に注入された物質は、眼球全体に拡散し、眼周囲組織全体に分布しています。
SCJ注射を介して投与されたAAVの分布を定義するために、麻酔後、7μLの希釈インドインクを生後10か月齢のマウスの結膜下腔に注入しました。SCJ注射中または注入後に出血、漏れ、または逆流は検出されませんでした。注射の30分後、眼および周囲の組織を採取し、続いてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色して、インドインクの分布を視覚化した。図2に描かれている代表的な矢状切片は、インドインクの分散が主に外眼筋、強膜の外表面、および眼周囲の緩い結合組織に隣接して発生したことを示しています(図2)。
自己補完性AAV8は、SCJに続いて角膜および眼周囲筋を正常に形質導入します。
注射後8週間での自己相補的AAV8の形質導入プロファイルを決定するために、1:500の希釈率で抗GFP抗体を使用した免疫蛍光染色により、全球断面におけるGFPの存在量を調べました。画像は蛍光顕微鏡下で撮影しました(図3)。これらの結果から、SCJ注射によるAAVベクターは、眼後方の眼周囲筋と角膜を効率的に導入することが明らかになりました。
SCJ注射後の明確な眼球区画における豊富なベクターゲノムおよび導入遺伝子発現
ベクターの生体分布と導入遺伝子発現を定量的に解析するために、肝臓や心臓などの異なる眼のコンパートメントや臓器のベクターゲノムコピー数をqPCRで調べ(図4A)、導入遺伝子の発現をqRT-PCRで調べました(図4B)。これらの結果は、AAV8のSCJ注射が眼瞼、結膜、角膜、視神経に導入遺伝子発現をもたらすことを示唆しています。
図1:マウスSCJ空間へのAAVベクター投与の顕微鏡図。 処置中のブレブの形成を可視化できるように、1%フルオレセインをAAVベクター調製物に直接添加した。画像は実体顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを用いて撮影した。(a)非注射眼の代表像;(b)注射された眼の代表像。矢印は、フルオレセインを含むAAV溶液をSCJ空間に注入したことを示す。略語:AAV =アデノ随伴ウイルス;SCJ =結膜下。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス眼におけるSCJ注入後のインドインク分布のH&E染色(矢印)。 インドのインクを注入した目の矢状部分が提示されます。指示部位に7μLのインドインクを注入した。*、注射部位。スケールバー= 500μm。略語:SCJ =結膜下;H&E = ヘマトキシリンとエオシン;C =角膜;I =アイリス;L =レンズ;R =網膜;E =まぶた;H =ハーデリアン腺;M =筋肉。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:SCJ注入後の自己相補的AAV8の代表的なGFP組織像。 SCJ注射後の角膜(A)および眼の筋肉(B)のトランスダクション。GFP発現(緑色)は、抗GFP抗体を用いたパラフィン包埋組織切片における免疫染色によって可視化した。核はDAPI(青色)で染色した。スケールバー= 100μm(目の筋肉)、20μm(角膜)。略語:GFP =緑色蛍光タンパク質;AAV =アデノ随伴ウイルス;SCJ =結膜下;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ベクターの生体分布と導入遺伝子発現の定量的解析。(A)SCJ後の眼球区画(眼瞼、結膜、角膜、視神経、網膜)およびその他の臓器(肝臓および心臓)におけるベクター生体分布は、宿主ゲノムDNAのベクターゲノムコピー数/μgとして提示されます。(B)qRT-PCRによって決定されたGFPの存在量は、ベクターcDNAコピー番号/宿主転写物として提示されます。この数字は 13から変更されています。略語:SCJ =結膜下;qRT-PCR = 定量的転写 PCR;GFP =緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
AAVを介した遺伝子治療は、眼疾患の治療に大きな可能性を秘めています。現在の眼科遺伝子治療は、硝子体内注射と網膜下注射の2つの主要な局所投与経路に依存しています。残念ながら、どちらの経路も侵襲的であり、網膜剥離、白内障形成、眼内炎などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。したがって、SCJ注射などの比較的侵襲性の低い経路の調査は非常に興味深いものです。
この手法は比較的簡単で侵襲性が大幅に低くなりますが、AAV送達には強調しなければならないいくつかの重要な側面があります。AAVベクターは、複数回の凍結融解サイクルを回避し、ウイルス力価の低下を防ぐために、シリコン処理または低保持マイクロ遠心チューブ内の所望の容量(ここでは100 μL)のアリコートで-80°Cで保存することをお勧めします。この実験で使用したベクターは、力価を有意に失うことなく、-80°Cで~6年間保存されました。さらに、ビヒクル組成物は、ベクターの安定性に影響を及ぼし得る。この実験では、ウイルスビヒクルは350mM NaCl+5%D-ソルビトールを含むPBSであった。本試験で使用したウイルスの力価は5.1 × 109 vg/μL(qPCRで測定)であり、合計7 × 109 vg /眼を投与した。ただし、標的組織および導入遺伝子に応じて、1 ×10 8-1 × 10 10 vg /眼の範囲が適切である。
SCJ注射は、投与量(マウスの場合は1〜100μL)に関して比較的制限が少ない。しかし、体積の違いはAAVの生体分布と形質導入に関与していると考えられており、結膜瘢痕モデルを作成するためにより大きな注入量が使用されたと報告されています27。1つの重要な態様は、結膜の血管性であり、これは、AAVベクターの実質的な全身クリアランスをもたらし得、したがって、AAVベクターに対する中和抗体の生成をもたらす。進行中の研究は、AAV治療ベクターの全身クリアランスを減らすための潜在的な戦略を積極的に研究しています。
さらに、SCJ注射後の in vivo 分布は、この注射経路の潜在的な適用にとって重要な考慮事項です。現在のプロトコルでは、分布は、複数の時点またはリアルタイムでではなく、1つの時点で染料(インドインク)を使用して検査されます。これらのデータは、AAVベクター溶液が注入直後にどのように広がるかを示すいくつかの指標を提供するが、AAVベクターおよび他の物質の分布および速度論的特性は、時間とともに有意に変化する可能性がある。AAVベクターの生体分布はqPCRによって異なる眼のコンパートメントで検出されたが、実験エンドポイントでの上記の方法のセクションで述べたように、理想的には、眼全体の治療試薬の輸送をリアルタイムで監視できる技術が使用されるであろう。ただし、これは実際には難しいことがよくあります。最後に、SCJ注射後のマウスで観察されたAAV形質導入プロファイルは、マウスの目と人間の目の明らかなサイズ、解剖学的、および生理学的な違いにより、人間の目で異なる場合があります。
網膜疾患も遺伝子治療の主要な標的です28。したがって、SCJ注射を介して投与されたAAVが網膜組織に到達できるかどうかの決定は、さらなる検討に値する13、17、29。以前の研究では、SCJ注射を介して投与されたナノ粒子が網膜内に到達できることが実証されています。ただし、具体的な人身売買経路は不明です。インドインクの分布データ(図2)は、溶液の大部分が眼周囲結合組織に広がることを示しており、AAVが強膜、脈絡膜、および網膜色素性上皮を貫通することにより、眼周囲透過を介して網膜内に到達する可能性があることを示しています。
図3Aに提示された角膜形質導入データは、SCJ空間に注入されたAAVが強膜および角膜を貫通できることを示唆している。このことはさらに、SCJ注射を介したAAV投与が、網膜30において所望の効果を達成するために有意に高い用量が必要とされるかもしれないが、前房または後房および硝子体に到達し得ることを示唆している。それにもかかわらず、SCJ注射は最も単純な眼投与経路の1つであり、辺縁系幹細胞欠損症などの眼表面疾患、ドライアイ疾患、および/または眼咽頭筋ジストロフィーなどの眼筋疾患を含むがこれらに限定されない複数の眼疾患を治療するためのAAV送達に大きな期待を寄せています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、この研究で使用されたscAAV8-GFPベクターを提供してくれたノースカロライナ大学のベクターコア、CGIBD組織学コア、およびこの研究の臨床評価の側面を支援してくれたブライアンC.ギルガー博士の研究室に感謝します。この研究は、ファイザー-NC Biotech特別ポスドクフェローシップと、American Society of Gene & Cell TherapyおよびCystic Fibrosis Foundationのキャリア開発賞の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしもAmerican Society of Gene & Cell TherapyまたはCystic Fibrosis Foundationの公式見解を表すものではありません。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
India ink | StatLab | NC9903975 | |
Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
Rebound tonometer | Tonovet | / | |
Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
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