Summary
In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.
Abstract
Oogziekten omvatten een breed scala aan erfelijke genetische en verworven aandoeningen die aantrekkelijke doelwitten zijn voor lokale medicijnafgifte vanwege hun relatieve gemakkelijke toegankelijkheid via meerdere toedieningsroutes. Subconjunctivale (SCJ) injecties bieden voordelen ten opzichte van andere intraoculaire toedieningsroutes omdat ze eenvoudig, veilig en meestal worden uitgevoerd in een poliklinische setting. SCJ-injecties bij kleine dieren vereisen meestal de hulp van een operatiemicroscoop vanwege de grootte van het oog. Eerder werk heeft aangetoond dat SCJ-injectie van specifieke adeno-geassocieerde virus (AAV) serotypen een geldige genafgiftestrategie is voor gerichte transductie van het oculaire oppervlak, de oogspier, het hoornvlies en de oogzenuw, wat een potentiële aanpak biedt voor de behandeling van veel oogziekten.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor SCJ-injecties in een muismodel met behulp van een injectiesysteem dat bestaat uit een programmeerbare infusie- / opzuigspuitpomp (die een consistente en nauwkeurige injectiesnelheid en -druk mogelijk maakt) en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Het injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes zoals intrastromale, intracamerale, intravitreale en subretinale injecties bij kleine dieren. Hoewel de levering van adeno-geassocieerde virale vectoren voor oculaire gentherapiestudies wordt beschreven, kan het protocol hierin ook worden aangepast voor een verscheidenheid aan oogheelkundige oplossingen in modellen voor kleine dieren. De belangrijkste praktische stappen in de toedieningsroute, de installatie van het injectieplatform, de voorbereiding van de injectie en tips uit directe ervaring zullen in detail worden besproken. Daarnaast zullen ook algemene validatietechnieken voor AAV-leveringsbevestiging aan de gewenste weefsels kort worden besproken.
Introduction
Oogziekten omvatten een breed scala aan zowel genetische als verworven aandoeningen. In 2015 waren wereldwijd naar schatting 36 miljoen mensen juridisch blind en meer dan 1 miljard mensen lijden aan ten minste een zekere mate van visuele beperking, wat de noodzaak benadrukt om de verlichtingsinspanningen op alle niveausop te schalen 1. De belangrijkste methoden voor het toedienen van oculaire medicijnen omvatten zowel topische als lokale toediening, zoals oogdruppels of subconjunctivale (SCJ), intracamerale, intravitreale en subretinale injecties. Hoewel niet-invasieve topische therapie de meest voorkomende toedieningsmethode is voor oogheelkundige geneesmiddelen en op grote schaal wordt gebruikt voor veel anterieure segmentaandoeningen, vormt de aanwezigheid van cornea-anatomische barrières een uitdaging voor de biologische beschikbaarheid, biodistributie en werkzaamheid van topisch toegediende stoffen, wat suggereert dat het misschien niet de beste kandidaat-behandelingsroute is voor veel ziekten van het binnenste oog. Lokale injectie in het specifieke oculaire compartiment dat door de ziekte is aangetast, is waarschijnlijk een effectievere en gerichtere aanpak voor medicijnafgifte2. Bijwerkingen als gevolg van herhaalde injecties kunnen toedieningsstrategieën echter bemoeilijken. Idealiter zou een therapie de therapeutische werkzaamheid op lange termijn moeten behouden na een enkele toediening. Gentherapie is dus een veelbelovende optie om het aantal vereiste injecties te minimaliseren en duurzame transgene expressie te bieden voor de behandeling van oogziekte 3,4.
Talrijke virale en niet-virale vectoren zijn beschikbaar voor gentherapie; AAV-vectoren zijn echter van groot belang vanwege hun uitstekende veiligheidsprofiel. AAV is een klein, enkelstrengs, niet-omhuld DNA-virus dat aanvankelijk werd ontdekt als een verontreiniging van een adenoviruspreparaat in 1965 door Atchison et al.5,6 AAV werd vervolgens ontworpen als een efficiënte virale vector voor genafgifte in de jaren 1980 en is de gentherapievector bij uitstek geworden voor vele ziekten, waaronder oogaandoeningen, in de afgelopen decennia. De meest opvallende hiervan is het eerste commercieel beschikbare gentherapiegeneesmiddel, voretigene neparvovec, dat werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration voor de behandeling van Leber's Congenitale Amaurosis, een zeldzame posterieure oogziekte. Hoewel voretigene neparvovec met succes barrières voor klinische ontwikkeling heeft overwonnen, blijven er uitdagingen voor de commercialisering van aanvullende oculaire gentherapieën. Voretigene neparvovec wordt bijvoorbeeld toegediend aan patiënten die levensvatbare retinale cellen behouden via subretinale injectie. Patiënten met meer geavanceerde vormen van de ziekte die geen levensvatbare retinale cellen hebben, komen dus niet in aanmerking voor behandeling, omdat dit geen klinisch voordeel zou opleveren. Bovendien werden bekende complicaties geassocieerd met de subretinale injectieprocedure waargenomen, waaronder oogontsteking, cataract, retinale scheuren, maculopathie en pijn 7,8. Andere zorgen met betrekking tot deze procedure zijn de mogelijkheid van bloeding, netvliesloslating, endoftalmitis en intrekking van de oculaire immuunprivilegestatus door oogweefselvernietiging 9,10,11,12. Inspanningen om minder invasieve genafgifteroutes zoals SCJ-injectie te verkennen, zijn dus steeds belangrijker geworden 13,14,15,16,17.
Het bindvlies is een dun membraan dat 3-5 lagen cellen bevat en het voorste oog verbindt met het binnenste ooglid. SCJ-injecties worden klinisch gebruikt voor de toediening van oogheelkundige geneesmiddelen aan zowel de voorste als/of achterste segmenten van het oog voor de behandeling van oogziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, glaucoom, retinitis en posterieure uveïtis18,19. Ze zijn relatief eenvoudig uit te voeren, routinematig gebruikt voor de toediening van oogheelkundige geneesmiddelen in een poliklinische setting20, enigszins pijnloos, brengen het oculaire immuunprivilege niet in gevaar en laten toegediende geneesmiddelen zich verspreiden door een groot periorbitaal gebied dat de oogzenuw omvat. Vandaar dat SCJ-injecties een aantrekkelijke toedieningsweg zijn voor AAV-gentherapietoepassingen. Natuurlijke AAV-serotypen toegediend via SCJ-injectie bij muizen zijn eerder gekarakteriseerd voor veiligheid, transductie-efficiëntie, serumimmunogeniciteit, biodistributie en weefselspecificiteit 13,16,21. Deze gegevens toonden aan dat genafgifte aan individuele oculaire weefsels via SCJ-toediening een formele mogelijkheid is.
Dit artikel beschrijft een eenvoudig en aanpasbaar protocol voor SCJ-injectie om AAV-vectoren in een muismodel af te leveren. Om de reproduceerbaarheid van deze aanpak te waarborgen, wordt een injectiesysteem beschreven dat bestaat uit een stereomicroscoop, een programmeerbare infusie-/opzuigspuitpomp (die een consistente en nauwkeurige injectiesnelheid en -druk mogelijk maakt) en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit systeem is aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes zoals intrastromale, intracamerale, intravitreale en subretinale injecties bij kleine dieren. Bovendien wordt een fluoresceïnekleurstof vaak gebruikt om visualisatie van de AAV-injectieplaats mogelijk te maken. De belangrijkste praktische stappen in de toedieningsroute, de installatie van het injectieplatform, de voorbereiding van de injectie en tips uit directe ervaring zullen in detail worden besproken. Ten slotte zullen gemeenschappelijke validatietechnieken voor bevestiging van AAV-levering aan de gewenste weefsels kort worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. Het gebruik van AAV-vectoren is een biorisico van bioveiligheidsniveau 1. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een bril bij het hanteren van AAV. Voor het hierin beschreven experiment werd een recombinante AAV-vector gebruikt, verpakt met het serotype 8-kapsel en coderend voor een generieke alomtegenwoordige cytomegalovirus (CMV) -promotor die de expressie van groen fluorescentie-eiwit (GFP) regelt.
1. AAV vector handling en opslag
- Bewaar het virus in een vriezer van -80 °C in aliquots van 100 μL in gesiliconiseerde of microcentrifugebuizen met lage retentie.
- Ontdooi alle vector stock oplossingen op ijs voor gebruik.
OPMERKING: Kleurstoffen zoals natriumfluoresceïneoplossing (bij een eindconcentratie van 0,1-2%) worden vaak gemengd met de AAV-vectoren om de geïnjecteerde oplossing te visualiseren. Bovendien helpt visualisatie van geïnjecteerde oplossingen bij het detecteren van luchtbellen en het bewaken van AAV-distributie en / of lekkage na injectie.
2. Subconjunctivale (SCJ) injectie
- Monteer het injectiesysteem.
- Om het injectiesysteem samen te stellen, plaatst u een stereomicroscoop en een spuitpomp in een bioveiligheidskast.
OPMERKING: Een infuuspomp is nodig om injecties met hoge precisie uit te voeren. Hierin wordt een standaard infuse / draw programmeerbare spuitpomp gebruikt (zie de tabel met materialen), die een strakke grip en een veilige spuitklem bevat voor spuiten variërend in volume van 0,5 μL tot 60 ml. Deze pomp biedt ook verbeterde debietprestaties met een hoge nauwkeurigheid en soepele stroomsnelheden van 1,28 pl/min tot 88,28 ml/min. - Snijd de polyethyleenbuis tot een lengte van ongeveer 50 cm (zie de tabel met materialen).
- Steek het naafuiteinde van een naald van 36 G in een van de uiteinden van de buis.
OPMERKING: Schuif het uiteinde van de naaldnaaf gedurende ~ 3 mm in de buis om ervoor te zorgen dat er geen lekkage optreedt. De naald van 36 G wordt gebruikt voor de volgende SCJ-injectie. Naalden variërend tussen 32 G en 36 G zijn de meest gebruikte maten voor SCJ-injecties. Het gebruik van een hemostaat om deze stap te ondersteunen wordt ten zeerste aanbevolen om het potentiële risico op scherp letsel te voorkomen. - Vul een wegwerpspuit van 3 ml met steriel water; steek deze wegwerpspuit in de zijkant van de buis tegenover de naald en spoel het water door de slang/naald. Herhaal deze stap met 70% alcohol.
- Herhaal stap 2.1.4 nog drie keer, afwisselend met steriel water en 70% alcohol, om de slang te desinfecteren en ervoor te zorgen dat er geen lekken, verstoppingen of schade in de hele slang worden waargenomen.
- Gebruik de wegwerpspuit van 3 ml om de slang te vullen met steriel water en laat de slang aan de wegwerpspuit zitten.
- Plaats een stuk parafilm op het bankoppervlak en voeg er een plas steriel water aan toe (~ 1 ml). Dompel het deel van de buis dat op de naald is aangesloten onder in de plas steriel water. Trek de wegwerpspuit uit de buisopening aan het andere uiteinde om te voorkomen dat er lucht in het slang/naaldsysteem komt bij het verwijderen van de spuit. Laat het deel van de buis dat is aangesloten op de naald ondergedompeld in de plas water.
OPMERKING: Voer procedures 2.1.4 tot 2.1.7 uit in een laminaire kap. - Vul een Hamilton spuit/naald van 10 μL met steriel water en vermijd lucht in de spuit. Sluit de Hamilton spuit/naald aan op het resterende open uiteinde van de slang door de slang en de naaldpunt van de Hamilton-spuit onder te dompelen in de plas steriel water op de parafilm.
- Druk op de snelomkeerknop op het pompscherm om het drukblok naar de geschatte lengte van de spuit te verplaatsen. Schroef de klemknoppen van de beugel los om de bevestigingsbeugels op de duwer en de spuithouderblokken los te maken. Plaats de Hamilton-spuit op het houderblok van de spuit en bevestig de spuit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Om de spuit vast te zetten, moet de cilinderklem van de spuit strak tegen het spuitvat zitten; echter niet te strak aanspannen, vooral niet bij het gebruik van glazen spuiten. De zuiger van de spuit moet worden vastgezet door de bevestigingsbeugel van het duwblok. - Pas de parameters aan in het scherm met pompinstellingen.
- Druk op de forceerknop en stel het krachtniveau in op 30%. Accepteer de wijzigingen om terug te gaan naar het instellingenscherm .
- Druk op de snelstartknop en selecteer Methode | Infunderen/terugtrekken.
- Selecteer voor de spuit Hamilton 1700, glas, 10 μL. Selecteer de infusie- en treksnelheid en het injectievolume.
OPMERKING: Het krachtniveau wordt ingesteld afhankelijk van het type spuit/materiaal/capaciteit/fabrikanten; zie de instructies van de fabrieksfabrikant voor de voorgestelde kracht voor elke spuit. De injectiesnelheid die in dit experiment werd gebruikt, was 200 nL /s. SCJ-injecties zijn relatief veilig en er is minder bezorgdheid over de inductie van verhoogde intraoculaire druk (IOP) als gevolg van de injectie. Een lagere injectiesnelheid is vaak wenselijk voor bepaalde toepassingen om reflux in de naald te voorkomen en consistentie in injecties bij dieren te behouden.
- Werp het water uit de Hamilton spuit, maar laat de slang en injectienaald vol met water. Trek de Hamilton-spuit iets terug door op de omgekeerde knop te drukken om een kleine luchtbel in de slang / naald te brengen.
OPMERKING: De luchtbel zal dienen als een barrière tussen het water in de buis en het therapeutische medicijn (in dit geval AAV), waardoor de nauwkeurigheid van de toegediende dosis wordt gewaarborgd. - Trek het virus op door de injectienaald in een aliquot van de virusvoorraad te plaatsen. Zorg ervoor dat er een zichtbare luchtbel achterblijft tussen het virus en het water in de slang.
OPMERKING: AAV-vectoren kunnen binden aan de plastic buis en metalen naald, wat leidt tot een verlies van virus- en / of onnauwkeurige doseringsregimes. Om strengheid, reproduceerbaarheid en een nauwkeurige dosis AAV te garanderen, wordt het dus aanbevolen om de oppervlakken die vervolgens in contact komen met de AAV vooraf te coaten. Om het slang/naaldsysteem met het virus te bedekken, trekt u de virale vectoroplossing in de slang/naald en incubeert u deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om verzadiging van de virusbinding aan de wand van de naald en/of slang mogelijk te maken. Gooi het virus weg.
- Om het injectiesysteem samen te stellen, plaatst u een stereomicroscoop en een spuitpomp in een bioveiligheidskast.
- Virusinjectie
- Verdoof de muis met geïnhaleerde anesthesie (isofluraan) of intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine/acepromazine. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door een gebrek aan reactie op stevige teenknijpen.
OPMERKING: Gebruik vrouwelijke en/of mannelijke C57BL/6J- of BALB/c-muizen die minstens 6 weken oud zijn. Ketamine/xylazine/acepromazine doses zijn als volgt: ketamine bij 70 mg/kg, xylazine bij 7 mg/kg en acepromazine bij 1,5 mg/kg. - Breng plaatselijke anesthesie aan op het oog dat de injectie zal ontvangen.
OPMERKING: Gebruik 0,1% proparacaïnehydrochloride en/of tetracaïnehydrochloride oftalmische oplossing (0,5%) voor plaatselijke anesthesie. - Breng actuele zalf aan op het andere oog dat geen injectie krijgt om droogheid en letsel te voorkomen.
- Plaats de muis op het microscopische podium en belicht het muisoog onder de stereomicroscoop.
- Plaats twee vingers op het ooglid en trek het iets weg van het oog van de muis om het bindvlies bloot te leggen, het binnenmembraan dat het ooglid met de sclera verbindt.
- Pak het bindvlies vast met een tang.
- Laat het ooglid los en houd de naald met de schuine kant naar boven gericht met behulp van de dominante hand.
- Steek de naald in het bindvlies. Steek de naald in totdat de schuine kant volledig bedekt is door het conjunctivale membraan. Leg de naald tegen de bol.
OPMERKING: Omdat het bindvlies een helder membraan is, is de punt van de naald / schuine kant gemakkelijk zichtbaar. - Start de injectie door op de Startknop te drukken met de voetschakelaar.
OPMERKING: De beweging van de lucht en de Hamilton-zuiger zijn gesynchroniseerd; elke vertraging duidt op overtollige lucht in het injectiesysteem of mogelijk een losse verbinding tussen de onderdelen van de slang, naald en/of spuit. - Nadat de injectie is voltooid, houdt u de naald 10 s op zijn plaats voordat u de naald uit het bindvlies trekt om de kans op terugstroom te verkleinen.
OPMERKING: Het is gebruikelijk dat een bleb verschijnt op de plaats van de SCJ-injectie. Dergelijke blebs verdwijnen normaal gesproken volledig binnen een paar uur na injectie. - Plaats een druppel van de actuele glijmiddelgel op de ogen van de muis om oogdroogheid / letsel te voorkomen en plaats de muis vervolgens op een verwarmingskussen om te herstellen.
- Voer oculaire onderzoeken uit zoals scheurproductie, IOP en spleetlamponderzoek in combinatie met corneafluorosceïnekleuring om oculaire abnormiteiten na de injectie te beoordelen.
OPMERKING: De traanproductie wordt gemeten door een Phenol Red Thread-test en een tonometer wordt vaak gebruikt om de IOP van het muizenoog te onderzoeken. Er wordt gemeld dat sommige intraoculaire injecties, zoals intravitreale injecties, kunnen leiden tot een significante toename van IOP; IOP-veranderingen na SCJ-injectie zijn echter niet duidelijk 13,22,23,24.
- Verdoof de muis met geïnhaleerde anesthesie (isofluraan) of intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine/acepromazine. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door een gebrek aan reactie op stevige teenknijpen.
- AAV biodistributie en transductie efficiëntie onderzoek na subconjunctivale injectie
- Om het virale genoombiodistributie- en / of transductieprofiel van AAV-vectoren te onderzoeken die via SCJ worden geleverd, euthanaseert u de muizen met een door AVMA goedgekeurde methode.
OPMERKING: In dit experiment werden de muizen 8 weken na de injectie geofferd. - Voor biodistributie en transgene expressie in gerichte oculaire compartimenten, ontleed het relevante weefsel van belang, zoals de oogleden, hoornvlies, bindvlies, oogspier, netvlies en oogzenuw. Flash-freeze alle weefsels en bewaar bij -80 °C. Om de AAV-biodistributie van het hele lichaam te onderzoeken, verzamelt u organen zoals de submandibulaire lymfeklieren en lever en bevriest u ze en slaat u ze op bij -80 °C.
- Verzamel met behulp van een DNA / RNA-extractiekit gDNA en RNA uit hetzelfde monster om respectievelijk transgene expressie en AAV-biodistributie te onderzoeken. Als alleen vectorbiodistributie gewenst is, gebruik dan een DNA-extractiekit om gDNA te extraheren.
- Voer standaard qPCR en RT-qPCR uit om de AAV-vectorbiodistributie en cDNA-abundantie te bepalen met behulp van vectortransgene-specifieke primers / probes13,25.
- Voor histologische analyse fixeert u de ogen, integreert u ze in paraffine en snijdt u ze door op een dikte van 5 μm. Voer standaard immunofluorescentiekleuring uit om transgenexpressie te onthullen26.
- Om het virale genoombiodistributie- en / of transductieprofiel van AAV-vectoren te onderzoeken die via SCJ worden geleverd, euthanaseert u de muizen met een door AVMA goedgekeurde methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oplossing geïnjecteerd in de subconjunctivale ruimte presenteert zich als een bleb, afhankelijk van het injectievolume.
In dit experiment werd 7 μL AAV (7 × 109 virale genomen (vg)/oog) gemengd met fluoresceïne in een uiteindelijke concentratie van 0,1% geïnjecteerd met een naald van 36 G onder een stereomicroscoop, en de injectiesnelheid/druk werd constant gehouden met behulp van een programmeerbare spuitpomp op 1 μL/s. Een bleb kan verschijnen bij injectie (pijl). Een microscopisch beeld van AAV-vectortoediening aan het muriene SCJ-compartiment is weergegeven in figuur 1.
Stoffen die in de subconjunctivale ruimte worden geïnjecteerd, verspreiden zich rond de aardbol van het oog en worden verdeeld over de perioculaire weefsels.
Om de verdeling van AAV toegediend via SCJ-injectie te bepalen, werd 7 μL verdunde India-inkt geïnjecteerd in de subconjunctivale ruimte van een 10 maanden oude muis na anesthesie. Er werd geen bloeding, lekkage of terugstroom gedetecteerd tijdens of na de SCJ-injectie. Dertig minuten na de injectie werden de oculaire en omliggende weefsels geoogst en vervolgens gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H &E) om de verdeling van India-inkt te visualiseren. De representatieve sagittale secties in figuur 2 tonen aan dat de dispersie van Indiase inkt voornamelijk plaatsvond naast de extraoculaire spieren, in het buitenoppervlak van de sclera, en de perioculaire losse bindweefsels (figuur 2).
Zelfcomplementariërende AAV8 transduceert met succes het hoornvlies en de perioculaire spieren na SCJ.
Om het transductieprofiel van zelfcomplementarische AAV8 acht weken na injectie te bepalen, werd de GFP-abundantie in doorsneden van de hele wereld onderzocht via immunofluorescentiekleuring met behulp van een anti-GFP-antilichaam bij een verdunning van 1:500. De beelden werden genomen onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 3). Deze resultaten toonden aan dat AAV-vectoren toegediend via SCJ-injectie de perioculaire spieren efficiënt transduceren naar het oog en het hoornvlies.
Overvloedige vectorgenoom- en transgene expressie in verschillende oogcompartimenten na SCJ-injectie
Om de vectorbiodistributie en transgene expressie kwantitatief te analyseren, werden vectorgenoomkopienummers in verschillende oogcompartimenten en organen zoals de lever en het hart onderzocht met qPCR (figuur 4A), terwijl de transgene expressie werd getest met qRT-PCR (figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat SCJ-injectie van AAV8 resulteert in transgene expressie in het ooglid, bindvlies, hoornvlies en oogzenuw.
Figuur 1: Microscopisch beeld van AAV-vectortoediening in de muriene SCJ-ruimte. Om de vorming van een bleb tijdens de procedure te kunnen visualiseren, werd 1% fluoresceïne direct toegevoegd aan het AAV-vectorpreparaat. Beelden werden gemaakt met behulp van een digitale camera bevestigd aan een stereomicroscoop. (A) Representatief beeld van een niet-geïnjecteerd oog; B) representatief beeld van een geïnjecteerd oog. De pijl geeft de geïnjecteerde AAV-oplossing met fluoresceïne in de SCJ-ruimte aan. Afkortingen: AAV = Adeno-geassocieerd virus; SCJ = subconjunctivaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: H&E-kleuring van India-inktverdeling (pijl) na SCJ-injectie in het muizenoog. Sagittale delen van een oog geïnjecteerd met India-inkt worden gepresenteerd; 7 μL Indiase inkt werd geïnjecteerd op de aangegeven plaats. *, Injectieplaats. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: SCJ = subconjunctival; H&E = hematoxyline en eosine; C = hoornvlies; I = iris; L = lens; R = Netvlies; E = ooglid; H = Hardere klier; M = spier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve GFP-histologiebeelden van zelfcomplementarisch AAV8 na SCJ-injectie. Transductie van het hoornvlies (A) en de oogspieren (B) na SCJ-injectie. GFP-expressie (groen) werd gevisualiseerd via immunostaining in paraffine-ingebedde weefselsecties met een anti-GFP-antilichaam. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 100 μm (oogspier), 20 μm (hoornvlies). Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; AAV = adeno-geassocieerd virus; SCJ = subconjunctivaal; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantitatieve analyse van vectorbiodistributie en transgene expressie. (A) Vectorbiodistributie in oogcompartimenten (ooglid, bindvlies, hoornvlies, oogzenuw en netvlies) en andere organen (lever en hart) na SCJ wordt gepresenteerd als vectorgenoomkopienummer / μg van gastheergenoom-DNA. (B) GFP-abundantie bepaald door qRT-PCR wordt gepresenteerd als vector cDNA-kopienummer/hosttranscript. Dit cijfer is gewijzigd van 13. Afkortingen: SCJ = subconjunctival; qRT-PCR = kwantitatieve revere-transcriptie PCR; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV-gemedieerde gentherapie heeft een groot potentieel voor de behandeling van oogziekten. De huidige oculaire gentherapie is gebaseerd op twee belangrijke lokale toedieningsroutes, intravitreale en subretinale injecties. Helaas zijn beide routes invasief en kunnen ze ernstige complicaties veroorzaken, waaronder netvliesloslating, cataractvorming en endoftalmitis. Het onderzoek naar relatief minder invasieve routes, zoals SCJ-injectie, is dus van groot belang.
Hoewel deze techniek relatief eenvoudig en aanzienlijk minder invasief is, zijn er verschillende belangrijke aspecten van AAV-levering die moeten worden benadrukt. Het wordt aanbevolen om de AAV-vector te bewaren bij -80 °C in aliquots van het gewenste volume (100 μL hier) in gesiliconiseerde of low-retention microcentrifugebuizen om meerdere vries-dooicycli te voorkomen en een vermindering van virale titer te voorkomen. De vector die in dit experiment werd gebruikt, werd gedurende ~6 jaar bij -80 °C bewaard zonder een significant verlies van titer. Bovendien kan de samenstelling van het voertuig de stabiliteit van de vector beïnvloeden. In dit experiment was het virusvoertuig PBS met 350 mM NaCl + 5% D-sorbitol. De titer van het virus dat in deze studie werd gebruikt, was 5,1 × 109 vg/μL (bepaald door qPCR) en in totaal werd 7 × 109 vg/oog toegediend. Een bereik van 1 × 108-1 × 1010 vg/oog is echter geschikt, afhankelijk van het beoogde weefsel en het transgen.
SCJ-injecties zijn relatief minder beperkend met betrekking tot het toegediende volume (1-100 μL voor een muis). Er wordt echter gedacht dat volumeverschillen een rol spelen bij AAV-biodistributie en -transductie, en grotere injectievolumes zijn naar verluidt gebruikt om een conjunctivaal littekenmodel27 te creëren. Een belangrijk aspect is de vasculaire aard van het bindvlies, wat kan leiden tot een aanzienlijke systemische klaring van de AAV-vector, wat resulteert in het genereren van neutraliserende antilichamen tegen de AAV-vector. Lopend onderzoek bestudeert actief potentiële strategieën om de systemische klaring van AAV-therapeutische vectoren te verminderen.
Bovendien is de in vivo distributie na SCJ-injectie een kritische overweging voor de mogelijke toepassing van deze injectieroute. In het huidige protocol wordt de verdeling onderzocht met behulp van een kleurstof (India-inkt) op één tijdstip in plaats van meerdere tijdstippen of in realtime. Hoewel deze gegevens een indicatie geven van hoe de AAV-vectoroplossing zich onmiddellijk na de injectie verspreidt, kunnen de verdeling en kinetische eigenschappen van de AAV-vector en andere stoffen in de loop van de tijd aanzienlijk variëren. Hoewel de biodistributie van de AAV-vector in verschillende oogcompartimenten werd gedetecteerd door qPCR, zoals vermeld in de bovenstaande methodesectie op het experimentele eindpunt, zou idealiter een techniek worden gebruikt die de handel in de therapeutische reagentia in het hele oog in realtime zou kunnen volgen; dit is echter in de praktijk vaak een uitdaging. Ten slotte kan het AAV-transductieprofiel dat wordt waargenomen bij muizen na SCJ-injectie verschillen in menselijke ogen vanwege de voor de hand liggende grootte, anatomische en fysiologische verschillen tussen een muizenoog en een menselijk oog.
Retinale ziekten zijn ook een belangrijk doelwit van gentherapie28; dus de bepaling of AAV toegediend via SCJ-injectie de retinale weefsels kan bereiken, is nader onderzoek waard 13,17,29. Eerdere studies hebben aangetoond dat nanodeeltjes toegediend via SCJ-injecties het binnenste netvlies kunnen bereiken. De specifieke smokkelroutes zijn echter onduidelijk. De distributiegegevens van Indiase inkt (figuur 2) tonen aan dat het grootste deel van de oplossing zich verspreidt in de perioculaire bindweefsels, wat aangeeft dat AAV het binnenste netvlies kan bereiken door perioculaire permeatie door het sclera, choroïde en retinaal gepigmenteerd epitheel te penetreren.
De corneatransductiegegevens in figuur 3A suggereren dat AAV geïnjecteerd in de SCJ-ruimte de sclera en het hoornvlies kan binnendringen. Dit suggereert verder dat AAV-toediening via SCJ-injectie de voorste kamer of zelfs de achterste en glasvochtkamers kan bereiken, hoewel een significant hogere dosis nodig kan zijn om wenselijke effecten in het netvlies te bereiken30. Niettemin is SCJ-injectie een van de eenvoudigste oculaire toedieningswegen en houdt het een grote belofte in voor AAV-levering om meerdere oogziekten te behandelen, inclusief maar niet beperkt tot oculaire oppervlakteziekten zoals limbale stamceldeficiëntie, droge ogen en / of ziekten van de oculaire spieren, zoals oculofaryngeale spierdystrofie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de Vector Core aan de Universiteit van North Carolina voor het verstrekken van de scAAV8-GFP-vectoren die in deze studie worden gebruikt, de CGIBD Histology Core en het laboratorium van Dr. Brian C. Gilger voor hun hulp bij de klinische beoordelingsaspecten van deze studie. Deze studie werd ondersteund door de Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship en een Career Development Award van de American Society of Gene &Cell Therapy en de Cystic Fibrosis Foundation. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de American Society of Gene &Cell Therapy of de Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
