Summary
在本手稿中，结膜下注射被证明是一种有效的小鼠眼组织载体递送方法，使用由输液/戒断注射泵和气密可拆卸注射器与显微注射针头组成的注射系统。该注射系统也适用于其他眼内给药途径。
Abstract
眼部疾病包括广泛的遗传性和获得性疾病，由于它们相对容易通过多种给药途径获得，因此是局部药物递送的吸引力靶标。结膜下（SCJ）注射比其他眼内给药途径具有优势，因为它们简单，安全，并且通常在门诊进行。由于眼睛的大小，小动物的SCJ注射通常需要手术显微镜的协助。先前的工作表明，SCJ注射特异性腺相关病毒（AAV）血清型是一种有效的基因传递策略，用于靶向转导眼表，眼肌，角膜和视神经，为治疗许多眼部疾病提供了潜在的方法。
在此，提出了使用由可编程输液/戒断注射泵（允许一致和精确的注射速度和压力）和气密可拆卸注射器与显微注射针头耦合的注射系统组成的小鼠模型中SCJ注射的详细方案。该注射系统还适用于其他眼内给药途径，例如小动物的基质内、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。尽管描述了用于眼部基因治疗研究的腺相关病毒载体的递送，但本文中的方案也可以适用于小动物模型中的各种眼科溶液。将详细讨论给药路线中的关键实际步骤、注射平台的设置、注射的制备以及直接经验的提示。此外，还将简要讨论用于AAV递送确认到所需组织的常见验证技术。
Introduction
眼部疾病包括广泛的遗传和获得性疾病。2015年，全世界估计有3600万人在法律上失明，超过10亿人至少患有一定程度的视力障碍，这突出表明有必要在各级扩大缓解工作1。提供眼部药物的主要方法包括局部和局部给药，例如滴眼液或结膜下 （SCJ）、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。尽管无创局部治疗是眼科药物最常见的给药方法，并且广泛用于许多眼前节疾病，但角膜解剖屏障的存在对局部给药物质的生物利用度、生物分布和疗效提出了挑战，这表明它可能不是许多内眼疾病的最佳候选治疗途径。局部注射到受疾病影响的特定眼室可能是一种更有效和有针对性的药物递送方法2。然而，重复注射引起的不良反应会使给药策略复杂化。理想情况下，治疗应在单次给药后保持长期疗效。因此，基因治疗是一种有前途的选择，可以最大限度地减少所需注射次数并为治疗眼部疾病提供持续的转基因表达3，4。
许多病毒和非病毒载体可用于基因治疗;然而，AAV载体因其出色的安全性而受到高度关注。AAV 是一种小的、单链的、无包膜的 DNA 病毒，最初于 1965 年由 Atchison 等人发现为腺病毒制剂的污染物5，6 AAV 随后在 1980 年代被设计为基因传递的有效病毒载体，并已成为许多疾病（包括眼部疾病）的首选基因治疗载体， 在过去的几十年里。其中最引人注目的是第一个市售基因治疗药物voretigene neparvovec，它被美国食品和药物管理局批准用于治疗Leber的先天性黑朦，这是一种罕见的后眼病。尽管沃雷蒂基因已成功地克服了临床开发的障碍，但其他眼部基因疗法的商业化仍面临挑战。例如，将voretigene neparvovec施用于通过视网膜下注射保留活视网膜细胞的患者。因此，缺乏活视网膜细胞的更晚期疾病患者没有资格接受治疗，因为它不会提供临床益处。此外，还观察到与视网膜下注射程序相关的已知并发症，包括眼部炎症，白内障，视网膜撕裂，黄斑病变和疼痛7，8。与此手术相关的其他问题包括出血，视网膜脱离，眼内炎的可能性，以及通过眼组织破坏撤销眼部免疫特权状态的可能性9，10，11，12。因此，探索侵入性较小的基因递送途径（例如SCJ注射）的努力变得越来越重要13，14，15，16，17。
结膜是包含3-5层细胞的薄膜，连接前眼和内眼睑。SCJ注射剂在临床上用于将眼科药物输送到眼睛的前段和/或后段，以治疗眼部疾病，例如年龄相关性黄斑变性，青光眼，视网膜炎和后葡萄膜炎18，19。它们相对容易执行，常规用于门诊环境中的眼科药物输送20，有点无痛，不会损害眼部免疫特权，并允许给药药物通过包含视神经的大眶周区域扩散。因此，SCJ注射是AAV基因治疗应用的一种有吸引力的给药途径。以前已经对通过SCJ注射在小鼠中施用的天然AAV血清型的安全性，转导效率，血清免疫原性，生物分布和组织特异性进行了表征13，16，21。这些数据表明，通过SCJ给药将基因传递到单个眼组织是一种正式的可能性。
本文描述了一种简单且适应性强的SCJ注射方案，以在小鼠模型中递送AAV载体。为了确保该方法的可重复性，描述了由体视显微镜、可编程输液/取液注射泵（允许一致和精确的注射速度和压力）和气密可拆卸注射器与显微注射针头耦合的注射系统。该系统适用于其他眼内给药途径，例如小动物的基质内、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。此外，荧光素染料通常用于AAV注射部位的可视化。将详细讨论给药路线中的关键实际步骤、注射平台的设置、注射的制备以及直接经验的提示。最后，将简要讨论用于确认AAV递送到所需组织的常见验证技术。
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Protocol
所有动物程序均按照北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会的规定进行。使用AAV载体是生物安全1级生物危害风险。处理AAV时，请穿戴适当的个人防护设备，包括实验室外套，手套和护目镜。对于本文描述的实验，利用与血清型8衣壳包装的重组AAV载体，并编码控制绿色荧光蛋白（GFP）表达的通用巨细胞病毒（CMV）启动子。
1. AAV病媒处理和储存
- 将病毒以100μL等分试样储存在硅化或低保留微量离心管中的-80°C冰箱中。
- 使用前在冰上解冻所有矢量储备溶液。
注意：荧光素钠溶液（终浓度为0.1-2%）等染料通常与AAV载体混合以可视化注入的溶液。此外，注入溶液的可视化有助于检测气泡并监测注射后的AAV分布和/或泄漏。
2.结膜下（SCJ）注射
- 组装注射系统。
- 要组装注射系统，请将体视显微镜和注射泵放在生物安全柜中。
注意：需要输液泵才能进行高精度注射。本文使用标准输注/抽出可编程注射泵（参见 材料表），其中包括一个紧密的夹持和一个安全的注射器夹，用于体积范围为0.5μL至60mL的注射器。该泵还提供增强的流量性能，具有高精度和从 1.28 pl/min 到 88.28 ml/min 的平稳流速。 - 将聚乙烯管切割成约50厘米的长度（见 材料表）。
- 将 36 G 针的轮毂端插入管子的一端。
注意： 将针轮毂端滑入管中 ~3 mm，以确保不会发生泄漏。36 G 针用于随后的 SCJ 注射。32 G至36 G之间的针头是SCJ注射最常用的尺寸。强烈建议使用止血器来辅助此步骤，以避免锐器受伤的潜在风险。 - 用无菌水填充一次性 3 mL 注射器;将此一次性注射器插入针头对面的管子侧面，并冲洗整个管子/针头的水。用70%的酒精重复此步骤。
- 再重复步骤2.1.4三次，用无菌水和70%酒精交替冲洗，对管道进行消毒，并确保在整个管道中没有发现泄漏，堵塞或损坏。
- 使用一次性 3 mL 注射器将管子装满无菌水，并将管子连接到一次性注射器上。
- 将一块封口膜放在工作台表面上，并向其中添加一池无菌水（~1 mL）。将连接到针头的管道部分浸入无菌水池中。从另一端的管口拉出一次性注射器，以防止任何空气在取出注射器时进入管道/针头系统。将连接到针头的管子部分浸入水池中。
注意：在层流罩中执行程序 2.1.4 至 2.1.7。 - 用无菌水填充 10 μL 汉密尔顿注射器/针头，避免注射器中有空气。通过将汉密尔顿注射器的管子和针尖浸入封口膜上的无菌水池中，将汉密尔顿注射器/针头连接到管子的剩余开口端。
- 按下泵屏幕上的 快速反向 按钮，将推杆块移动到注射器的近似长度。拧下支架夹紧旋钮，松开推杆和注射器支架块上的固定支架。将汉密尔顿注射器装入注射器支架块上，并按照制造商的说明固定注射器。
注意：为了固定注射器，注射器筒夹应紧紧贴注射器筒;但是，不要过度拧紧，尤其是在使用玻璃注射器时。注射器柱塞应用推杆固定支架固定。 - 在泵设置屏幕中调整参数。
- 按下 力 按钮，并将力级别设置为 30%。接受更改以返回到 设置 屏幕。
- 按 快速启动 按钮并选择 方法 |输液/退出。
- 对于 注射器，选择 汉密尔顿1700，玻璃，10μL。选择 输液 和 取断率 以及 注射量。
注意： 力水平 根据注射器类型/材料/容量/制造商设置;请参阅工厂制造商说明，了解每个注射器的建议用力。本实验中使用的注射速度为200 nL/s.SCJ注射相对安全，并且不太担心注射引起的眼内压（IOP）升高。对于某些应用，通常需要较慢的注射速度，以避免回流到针头中并保持动物之间注射的一致性。
- 从汉密尔顿注射器中喷出水，但让管道和注射针充满水。通过按下 反向 按钮在管路/针头中引入一个小气泡，稍微拉回汉密尔顿注射器。
注意：气泡将作为管中的水和治疗药物（在这种情况下为AAV）之间的屏障，确保给药剂量的准确性。 - 通过将注射针头放入病毒原液的等分试样中来提取病毒。确保病毒和管道中的水之间保留可见气泡。
注意：AAV载体可以与塑料管和金属针结合，导致病毒丢失和/或不准确的给药方案。因此，为了确保AAV的严谨性、可重复性和准确剂量，建议对随后与AAV接触的表面进行预涂。为了用病毒涂覆管道/针头系统，将病毒载体溶液吸入管道/针头中，并在室温下孵育10分钟，以使病毒结合到针和/或管道壁上饱和。丢弃病毒。
- 要组装注射系统，请将体视显微镜和注射泵放在生物安全柜中。
- 病毒注射
- 用吸入麻醉（异氟醚）或腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪麻醉小鼠。通过对坚硬的脚趾捏合缺乏反应来确认麻醉的手术平面。
注意：使用至少6周大的雌性和/或雄性C57BL / 6J或BALB / c小鼠。氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪剂量如下：氯胺酮为70毫克/千克，甲苯噻嗪为7毫克/千克，乙酰丙嗪为1.5毫克/千克。 - 对将接受注射的眼睛进行局部麻醉。
注意：使用0.1%盐酸丙帕卡因和/或盐酸丁卡因眼用溶液（0.5%）进行局部麻醉。 - 将局部软膏涂抹在另一只不会接受注射的眼睛上，以防止干燥和受伤。
- 将鼠标放在显微载物台上，并将小鼠眼睛暴露在体视显微镜下。
- 将两根手指放在眼睑上，将其从鼠标的眼睛上轻轻拉开，露出结膜，结膜是连接眼睑和巩膜的内膜。
- 用镊子抓住结膜。
- 松开眼睑，用惯用手握住针头，斜面朝上。
- 将针插入结膜。插入针头，直到斜面完全被结膜覆盖。将针放在地球上。
注意：由于结膜是透明的膜，因此针尖/斜面很容易看到。 - 使用脚踏开关按下“开始”按钮 开始 注射。
注意：空气和汉密尔顿柱塞的运动是同步的;任何延迟都表示注射系统中的空气过多，或者管道、针头和/或注射器组件之间的连接可能松动。 - 注射完成后，将针头固定到位10秒，然后再将针头从结膜中取出，以减少回流的机会。
注意：在SCJ注射部位出现水泡是很常见的。这种水泡通常在注射后几个小时内完全消退。 - 将一滴局部润滑凝胶滴在小鼠的眼睛上以防止眼睛干燥/受伤，然后将鼠标放在加热垫上以恢复。
- 结合角膜荧光素染色进行眼部检查，例如泪液产生、眼压和裂隙灯检查，以评估注射后的眼部异常。
注意：泪液产生是通过酚红线测试测量的，眼压计通常用于检查小鼠眼睛的眼压。据报道，一些眼内注射，如玻璃体内注射，可能会导致眼压显着增加;但SCJ注射后眼压变化不明显13，22，23，24。
- 用吸入麻醉（异氟醚）或腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪麻醉小鼠。通过对坚硬的脚趾捏合缺乏反应来确认麻醉的手术平面。
- 结膜下注射后AAV生物分布和转导效率检查
- 为了研究通过SCJ递送的AAV载体的病毒基因组生物分布和/或转导谱，通过AVMA批准的方法对小鼠实施安乐死。
注意：在该实验中，在注射后8周处死小鼠。 - 对于靶眼区室中的生物分布和转基因表达，解剖感兴趣的相关组织，例如眼睑、角膜、结膜、眼肌、视网膜和视神经。快速冷冻所有组织并储存在-80°C。 为了检查全身AAV的生物分布，收集下颌下淋巴结和肝脏等器官，并快速冷冻并储存在-80°C。
- 使用 DNA/RNA 提取试剂盒，从同一样品中收集 gDNA 和 RNA，分别检查转基因表达和 AAV 生物分布。如果只需要载体生物分布，请使用 DNA 提取试剂盒提取 gDNA。
- 使用载体转基因特异性引物/探针13，25 进行标准 qPCR 和 RT-qPCR 以确定 AAV 载体生物分布和 cDNA 丰度。
- 对于组织学分析，固定眼睛，将它们嵌入石蜡中，并以5μm的厚度切片。进行标准免疫荧光染色以揭示转基因表达26。
- 为了研究通过SCJ递送的AAV载体的病毒基因组生物分布和/或转导谱，通过AVMA批准的方法对小鼠实施安乐死。
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Representative Results
注射到结膜下间隙的溶液根据注射量表现为水疱。
在该实验中，在立体显微镜下用36 G针头注射7 μL AAV（7 ×10 9 病毒基因组（vg）/眼）与荧光素混合，终浓度为0.1%，并使用可编程注射泵保持注射速度/压力恒定1μL / s。注射时可能会出现水泡（箭头）。将AAV载体施用到小鼠SCJ室的显微镜视图如图 1所示。
注射到结膜下间隙的物质扩散到眼球周围，并分布在整个眼周组织中。
为了确定通过SCJ注射给药的AAV的分布，在麻醉后将7μL稀释的印度墨水注入10个月龄小鼠的结膜下间隙。在 SCJ 注射期间或之后未检测到出血、渗漏或回流。注射后三十分钟，收获眼部和周围组织，随后用苏木精和伊红（H&E）染色，以可视化印度墨水的分布。图2中描绘的代表性矢状切片表明，印度墨水的分散主要发生在眼外肌附近，巩膜外表面和眼周松散结缔组织（图2）。
自互补AAV8在SCJ后成功转导角膜和眼周肌。
为了确定注射后八周自互补AAV8的转导谱，使用抗GFP抗体以1：500的稀释度通过免疫荧光染色检查了整个横截面中的GFP丰度。在荧光显微镜下拍摄图像（图3）。这些结果表明，通过SCJ注射给药的AAV载体有效地将眼后和角膜的眼周肌肉转导。
SCJ注射后不同眼室中丰富的载体基因组和转基因表达
为了定量分析载体生物分布和转基因表达，通过qPCR检查不同眼室和器官（如肝脏和心脏）中的载体基因组拷贝数（图4A），而通过qRT-PCR测试转基因表达（图4B）。这些结果表明，SCJ注射AAV8会导致眼睑，结膜，角膜和视神经中的转基因表达。
图1：AAV载体施用到小鼠SCJ空间的显微镜视图。 为了在手术过程中可视化气泡的形成，将1%荧光素直接添加到AAV载体制备中。使用连接到体视显微镜的数码相机拍摄图像。（A） 未注射眼睛的代表性图像;（B）注射眼的代表性图像。箭头表示在SCJ空间中注入含有荧光素的AAV溶液。缩写：AAV = 腺相关病毒;SCJ = 结膜下。 请点击此处查看此图的大图。
图2：在小鼠眼中注射SCJ后印度墨水分布（箭头）的H&E染色。 呈现注入印度墨水的眼睛矢状面;在指定部位注入 7 μL 印度墨水。*，注射部位。比例尺 = 500 μm。缩写：SCJ = 亚结膜;H&E = 苏木精和伊红;C = 角膜;I = 虹膜;L = 镜头;R = 视网膜;E = 眼睑;H = 哈德氏腺;M = 肌肉。 请点击此处查看此图的大图。
图3：SCJ注射后自互补AAV8的代表性GFP组织学图像。 注射SCJ后角膜（A）和眼部肌肉（B）的转导。通过用抗GFP抗体在石蜡包埋的组织切片中进行免疫染色来观察GFP表达（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺= 100 μm（眼肌），20 μm（角膜）。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;AAV = 腺相关病毒;SCJ = 结膜下;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。
图4：载体生物分布和转基因表达的定量分析。（A）SCJ后眼室（眼睑，结膜，角膜，视神经和视网膜）和其他器官（肝脏和心脏）中的载体生物分布表示为宿主基因组DNA的载体基因组拷贝数/μg。（B）通过qRT-PCR确定的GFP丰度以载体cDNA拷贝数/宿主转录本的形式表示。这个数字是从 13修改而来的。缩写：SCJ = 亚结膜;qRT-PCR = 定量转录 PCR;GFP =绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
AAV介导的基因疗法在治疗眼部疾病方面具有巨大潜力。目前的眼部基因治疗依赖于两种主要的局部给药途径，玻璃体内和视网膜下注射。不幸的是，这两种途径都是侵入性的，可能导致严重的并发症，包括视网膜脱离、白内障形成和眼内炎。因此，研究相对较少的侵入性途径，例如SCJ注射，是非常有趣的。
虽然这种技术相对简单，侵入性明显较小，但必须强调AAV递送的几个重要方面。建议将AAV载体以所需体积（此处为100μL）的等分试样在-80°C下储存在硅化或低保留微量离心管中，以避免多次冻融循环并防止病毒滴度降低。本实验中使用的载体在-80°C下储存~6年，滴度没有显着损失。此外，载体组成可能会影响载体的稳定性。在该实验中，病毒载体是含有350 mM NaCl + 5%D-山梨糖醇的PBS。本研究中使用的病毒滴度为5.1 × 109 vg/μL（通过qPCR测定），总共给予7 × 109 vg/眼。然而，1 × 108-1 ×10 vg /眼睛的范围是合适的，具体取决于靶组织和转基因。
SCJ进样对给药体积的限制相对较小（小鼠为1-100μL）。然而，体积差异被认为在AAV生物分布和转导中起作用，据报道，更大的注射体积已被用于创建结膜瘢痕模型27。一个重要方面是结膜的血管性质，这可能导致AAV载体的大量全身清除，从而导致AAV载体的中和抗体的产生。正在进行的研究正在积极研究降低AAV治疗载体全身清除率的潜在策略。
此外，SCJ注射后的 体内 分布是该注射途径潜在应用的关键考虑因素。在当前的协议中，通过使用染料（印度墨水）在一个时间点而不是多个时间点或实时检查分布。尽管这些数据提供了AAV载体溶液在注射后如何立即扩散的一些指示，但AAV载体和其他物质的分布和动力学特性可能会随着时间的推移而显着变化。尽管通过qPCR在不同眼室中检测AAV载体的生物分布，如实验终点的上述方法部分所述，理想情况下，将使用一种可以实时监测治疗试剂在整个眼睛中的运输的技术;然而，这在实践中往往具有挑战性。最后，由于小鼠眼睛和人眼之间的明显大小、解剖学和生理差异，在注射 SCJ 后在小鼠中观察到的 AAV 转导谱在人眼中可能有所不同。
视网膜疾病也是基因治疗的主要目标28;因此，通过SCJ注射给药的AAV是否可以到达视网膜组织的确定值得进一步检查13，17，29。先前的研究表明，通过SCJ注射给药的纳米颗粒可以到达视网膜内部。然而，具体的贩运途径尚不清楚。印度墨水的分布数据（图2）表明，大部分溶液扩散到眼周结缔组织中，表明AAV可能通过穿透巩膜，脉络膜和视网膜色素上皮通过眼周渗透到达视网膜内。
图3A所示的角膜转导数据表明，注射到SCJ间隙的AAV可以穿透巩膜和角膜。这进一步表明，通过SCJ注射的AAV给药可以到达前房甚至后房和玻璃体房，尽管可能需要显着更高的剂量才能在视网膜30中达到理想的效果。然而，SCJ注射是最简单的眼部给药途径之一，对于AAV递送治疗多种眼部疾病具有很大的希望，包括但不限于眼表疾病，如角膜缘干细胞缺乏症、干眼病和/或眼肌疾病，如眼咽肌营养不良症。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢北卡罗来纳大学的Vector Core提供本研究中使用的scAAV8-GFP载体，CGIBD组织学核心以及Brian C. Gilger博士的实验室为本研究的临床评估方面提供帮助。这项研究得到了辉瑞-北卡罗来纳州生物技术杰出博士后奖学金和美国基因与细胞治疗学会和囊性纤维化基金会的职业发展奖的支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国基因与细胞治疗学会或囊性纤维化基金会的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
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