Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.
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Artigo de método
Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais
Neste artigo
Resumo
Resumo
As doenças oculares incluem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos hereditários que são alvos atraentes para a administração local de medicamentos devido à sua relativa facilidade de acessibilidade através de várias vias de administração. As injeções subconjuntivais (SCJ) oferecem vantagens em relação a outras vias de administração intraocular, pois são simples, seguras e geralmente realizadas em ambiente ambulatorial. As injeções de SCJ em pequenos animais geralmente requerem a assistência de um microscópio cirúrgico devido ao tamanho do olho. Trabalhos anteriores demonstraram que a injeção de SCJ de sorotipos específicos de vírus adenoassociados (AAV) é uma estratégia válida de entrega de genes para transdução direcionada da superfície ocular, músculo ocular, córnea e nervo óptico, fornecendo uma abordagem potencial para o tratamento de muitas doenças oculares.
Neste documento, um protocolo detalhado é apresentado para injeções SCJ em um modelo de camundongo usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. O sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Embora a entrega de vetores virais adenoassociados para estudos de terapia gênica ocular seja descrita, o protocolo aqui também pode ser adaptado para uma variedade de soluções oftálmicas em pequenos modelos animais. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Além disso, técnicas comuns de validação para a confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados também serão brevemente discutidas.
Introdução
As doenças oculares abrangem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos. Em 2015, estima-se que 36 milhões de pessoas eram legalmente cegas em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas sofrem de pelo menos algum nível de deficiência visual, destacando a necessidade de ampliar os esforços de alívio em todos os níveis1. Os principais métodos para a administração de medicamentos oculares incluem administração tópica e local, como colírios ou injeções subconjuntivais (SCJ), intracamerais, intravítreas e sub-retinianas. Embora a terapia tópica não invasiva seja o método de administração mais comum para drogas oftálmicas e seja amplamente u....
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. O uso de vetores AAV é um risco de biossegurança Nível 1. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear o AAV. Para o experimento aqui descrito, foi utilizado um vetor AAV recombinante embalado com o capsídeo do sorotipo 8 e codificando um promotor genérico de citomegalovírus ubíquo (CMV) controlando a expressão da proteína de fluorescência verde (GFP).
1. Manuseio e armazenamento de veto....
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Resultados
A solução injetada no espaço subconjuntival apresenta-se como uma bolha dependendo do volume de injeção.
Neste experimento, 7 μL de AAV (7 × 109 genomas virais (vg)/olho) misturados com fluoresceína na concentração final de 0,1% foram injetados com uma agulha de 36 G sob estereomicroscópio, e a velocidade/pressão de injeção foi mantida constante usando uma bomba de seringa programável a 1 μL/s. Uma bolha pode aparecer após a injeção (seta). Uma visão microscópica da administração do vetor A.......
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Discussão
A terapia genética mediada por AAV tem um grande potencial para o tratamento de doenças oculares. A terapia genética ocular atual depende de duas vias principais de administração local, injeções intravítreas e sub-retinianas. Infelizmente, ambas as vias são invasivas e podem causar sérias complicações, incluindo descolamento de retina, formação de catarata e endoftalmite. Assim, a investigação de vias relativamente menos invasivas, como a injeção de SCJ, é de grande interesse.
Embora essa técn.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Vector Core da Universidade da Carolina do Norte por fornecer os vetores scAAV8-GFP usados neste estudo, o CGIBD Histology Core e o laboratório do Dr. Brian C. Gilger por sua assistência com os aspectos de avaliação clínica deste estudo. Este estudo foi apoiado pela Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship e um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Sociedade Americana de Terapia Genética e Celular e da Cystic Fibrosis Foundation. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais da Sociedade Americana de Terapia Genética e Celular ou da Fundação de Fibrose Cística.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas NanoFil de 36 G World | Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill | / | |
| Acepromazina | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anticorpo anti-GFP | AVES labs Inc. | ||
| Câmera digital | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| Kit de extração de DNA/RNA | Qiagen | 80204 | |
| Fórceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Seringa Hamilton | Hamilton | 7654-01 | |
| Tinta da Índia | StatLab | NC9903975 | |
| Solução de injeção de cloridrato de cetamina | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Filme resistente à umidade | Parafilm | 807-6 | |
| Tubo de polietileno | Becton Dickinson e Empresa | 427401 | |
| Proparacaína 0,1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Tonômetro de rebote | Tonovet | / | |
| solução de fluoresceína de sódio | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Bomba padrão de infusão / retirada 11 Pico Plus Elite Bomba de seringa programável | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Microscopia estéreo | Leica | Mz6 | |
| Cloridrato de Tetracaína Solução Oftálmica 0,5% | Bausch e Lomb | Rx apenas | |
| Pomada tópica | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
Referências
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C.
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Reimpressões e permissões
