Summary
I detta manuskript demonstreras subkonjunktival injektion som en giltig vektortillförselmetod för ögonvävnader hos möss med hjälp av ett injektionssystem bestående av en infusions-/abstinenssprutpump och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Detta injektionssystem är också anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar.
Abstract
Okulära sjukdomar inkluderar ett brett spektrum av ärftliga genetiska och förvärvade störningar som är tilltalande mål för lokal läkemedelsleverans på grund av deras relativa lättillgänglighet via flera administreringsvägar. Subkonjunktival (SCJ) injektioner erbjuder fördelar jämfört med andra intraokulära administreringsvägar eftersom de är enkla, säkra och vanligtvis utförs i en poliklinisk miljö. SCJ-injektioner hos små djur kräver vanligtvis hjälp av ett operativt mikroskop på grund av ögats storlek. Tidigare arbete har visat att SCJ-injektion av specifika adenoassocierade virus (AAV) serotyper är en giltig genleveransstrategi för riktad transduktion av ögonytan, ögonmuskeln, hornhinnan och synnerven, vilket ger ett potentiellt tillvägagångssätt för behandling av många ögonsjukdomar.
Häri presenteras ett detaljerat protokoll för SCJ-injektioner i en musmodell med hjälp av ett injektionssystem bestående av en programmerbar infusions-/abstinenssprutpump (vilket möjliggör konsekvent och exakt injektionshastighet och tryck) och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Injektionssystemet är också anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar såsom intrastromala, intrakamerala, intravitreala och subretinala injektioner hos små djur. Även om leveransen av adenoassocierade virusvektorer för okulära genterapistudier beskrivs, kan protokollet häri också anpassas för en mängd olika oftalmiska lösningar i smådjursmodeller. De viktigaste praktiska stegen i administreringsvägen, installationen för injektionsplattformen, beredningen av injektionen och tips från direkt erfarenhet kommer att diskuteras i detalj. Dessutom kommer vanliga valideringstekniker för AAV-leveransbekräftelse till önskade vävnader också att diskuteras kortfattat.
Introduction
Ögonsjukdomar omfattar ett brett spektrum av både genetiska och förvärvade störningar. År 2015 var uppskattningsvis 36 miljoner människor juridiskt blinda över hela världen, och över 1 miljard människor lider av åtminstone någon nivå av synnedsättning, vilket belyser behovet av att öka hjälpinsatserna på alla nivåer1. De viktigaste metoderna för att leverera okulära läkemedel inkluderar både topisk och lokal administrering, såsom ögondroppar eller subkonjunktival (SCJ), intrakameral, intravitreala och subretinala injektioner. Även om icke-invasiv topisk terapi är den vanligaste leveransmetoden för oftalmiska läkemedel och används i stor utsträckning för många främre segmentstörningar, utgör förekomsten av hornhinnans anatomiska barriärer en utmaning för biotillgängligheten, biodistributionen och effekten av lokalt administrerade ämnen, vilket tyder på att det kanske inte är den bästa kandidatbehandlingsvägen för många sjukdomar i det inre ögat. Lokal injektion i det specifika okulära facket som påverkas av sjukdomen är sannolikt en mer effektiv och riktad läkemedelsleveransmetod2. Emellertid, biverkningar till följd av upprepade injektioner kan komplicera administreringsstrategier. Helst bör en terapi upprätthålla långsiktig terapeutisk effekt efter en enda administrering. Således är genterapi ett lovande alternativ för att minimera antalet nödvändiga injektioner och tillhandahålla ihållande transgenuttryck för behandling av okulär sjukdom 3,4.
Många virala och icke-virala vektorer är tillgängliga för genterapi; AAV-vektorer är dock av stort intresse på grund av deras utmärkta säkerhetsprofil. AAV är ett litet, enkelsträngat, icke-omslutet DNA-virus som ursprungligen upptäcktes som en förorening av ett adenoviruspreparat 1965 av Atchison et al.5,6 AAV konstruerades därefter som en effektiv viral vektor för genleverans på 1980-talet och har blivit den valda genterapivektorn för många sjukdomar, inklusive okulära störningar, under de senaste decennierna. Den mest anmärkningsvärda av dessa är det första kommersiellt tillgängliga genterapiläkemedlet, voretigene neparvovec, som godkändes av United States Food and Drug Administration för att behandla Lebers medfödda amauros, en sällsynt bakre ögonsjukdom. Även om voretigene neparvovec framgångsrikt har övervunnit hinder för klinisk utveckling, kvarstår utmaningar för kommersialiseringen av ytterligare okulära genterapier. Till exempel administreras voretigene neparvovec till patienter som behåller livskraftiga retinala celler via subretinal injektion. Således är patienter med mer avancerade former av sjukdomen som saknar livskraftiga retinala celler inte berättigade till behandling, eftersom det inte skulle ge någon klinisk nytta. Dessutom observerades kända komplikationer i samband med subretinal injektionsprocedur, inklusive ögoninflammation, grå starr, retinal rivning, makulopati och smärta 7,8. Andra problem relaterade till detta förfarande inkluderar möjligheten till blödning, retinalavskiljning, endoftalmitis och återkallande av ögonimmun privilegierad status genom ögonvävnadsförstöring 9,10,11,12. Således har ansträngningar för att utforska mindre invasiva genleveransvägar som SCJ-injektion blivit allt viktigare 13,14,15,16,17.
Konjunktiva är ett tunt membran som innehåller 3-5 lager celler och förbinder det främre ögat med det inre ögonlocket. SCJ-injektioner används kliniskt för oftalmisk läkemedelstillförsel till både de främre och / eller bakre segmenten av ögat för behandling av ögonsjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration, glaukom, retinit och bakre uveit18,19. De är relativt enkla att utföra, används rutinmässigt för oftalmisk läkemedelsleverans i en öppenvårdsmiljö20, något smärtfri, äventyrar inte okulärt immunprivilegium och tillåter administrerade läkemedel att spridas genom en stor periorbital region som omfattar synnerven. Därför är SCJ-injektioner en attraktiv administreringsväg för AAV-genterapiapplikationer. Naturliga AAV-serotyper administrerade via SCJ-injektion i möss har tidigare karakteriserats för säkerhet, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution och vävnadsspecificitet13,16,21. Dessa data visade att genleverans till enskilda okulära vävnader via SCJ-administrering är en formell möjlighet.
Detta dokument beskriver ett enkelt och anpassningsbart protokoll för SCJ-injektion för att leverera AAV-vektorer i en musmodell. För att säkerställa reproducerbarheten av detta tillvägagångssätt beskrivs ett injektionssystem bestående av ett stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprutpump (som möjliggör konsekvent och exakt injektionshastighet och tryck) och en gastät avtagbar spruta i kombination med mikroinjektionsnålar. Detta system är anpassningsbart för andra intraokulära administreringsvägar såsom intrastromala, intrakamerala, intravitreala och subretinala injektioner hos små djur. Dessutom används ofta ett fluoresceinfärgämne för att möjliggöra visualisering av AAV-injektionsstället. De viktigaste praktiska stegen i administreringsvägen, installationen för injektionsplattformen, beredningen av injektionen och tips från direkt erfarenhet kommer att diskuteras i detalj. Slutligen kommer vanliga valideringstekniker för bekräftelse av AAV-leverans till önskade vävnader att diskuteras kortfattat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med bestämmelserna från Institutional Animal Care and Use Committee vid University of North Carolina at Chapel Hill. Användningen av AAV-vektorer är en biosäkerhetsnivå 1-risk för biohazard. Använd korrekt personlig skyddsutrustning, inklusive en labbrock, handskar och skyddsglasögon vid hantering av AAV. För experimentet som beskrivs häri användes en rekombinant AAV-vektor förpackad med serotyp 8-kapsiden och kodning av en generisk allestädes närvarande cytomegalovirus (CMV) promotor som styr uttrycket av grönt fluorescensprotein (GFP).
1. Hantering och lagring av AAV-vektorer
- Förvara viruset i en frys med -80 °C i 100 μl alikvoter i silikoniserade eller lågretentionsmikrocentrifugrör.
- Tina alla vektorlagerlösningar på is före användning.
OBS: Färgämnen såsom natriumfluoresceinlösning (vid en slutlig koncentration av 0,1-2%) blandas ofta med AAV-vektorerna för att visualisera den injicerade lösningen. Dessutom hjälper visualisering av injicerade lösningar till att upptäcka luftbubblor och övervaka AAV-distribution och / eller läckage efter injektion.
2. Subkonjunktival (SCJ) injektion
- Montera injektionssystemet.
- För att montera injektionssystemet, placera ett stereomikroskop och en sprutpump i ett biosäkerhetsskåp.
OBS: En infusionspump behövs för att utföra injektioner med hög precision. Häri används en programmerbar sprutpump för standardinfusering/uttag (se materialtabellen), som inkluderar ett hårt grepp och en säker sprutklämma för sprutor som sträcker sig i volym från 0,5 μL till 60 ml. Denna pump erbjuder också förbättrad flödesprestanda med hög noggrannhet och jämna flödeshastigheter från 1,28 pl/min till 88,28 ml/min. - Skär polyetenslangen till en längd av cirka 50 cm (se materialtabellen).
- För in navänden på en 36 G-nål i en av slangens ändar.
OBS: Skjut nålnavänden i röret i ~ 3 mm för att säkerställa att inget läckage uppstår. 36 G-nålen används för den efterföljande SCJ-injektionen. Nålar mellan 32 G och 36 G är de vanligaste storlekarna för SCJ-injektioner. Användning av en hemostat för att hjälpa detta steg rekommenderas starkt för att undvika den potentiella risken för skarp skada. - Fyll en engångsspruta på 3 ml med sterilt vatten; För in denna engångsspruta i sidan av röret mittemot nålen och spola vattnet genom slangen/nålen. Upprepa detta steg med 70% alkohol.
- Upprepa steg 2.1.4 tre gånger till, alternerande spolningar med sterilt vatten och 70% alkohol, för att desinficera slangen och se till att inga läckor, träskor eller skador observeras i hela slangen.
- Använd engångssprutan på 3 ml för att fylla slangen med sterilt vatten och låt slangen fästas på engångssprutan.
- Placera en bit parafilm på bänkytan och tillsätt en pool med sterilt vatten till den (~ 1 ml). Sänk ner den del av slangen som är ansluten till nålen i poolen med sterilt vatten. Dra ut engångssprutan från röröppningen i motsatt ände för att förhindra att luft tränger in i slangen/nålsystemet när sprutan tas bort. Låt den del av slangen som är ansluten till nålen nedsänkt i vattenpoolen.
OBS: Utför procedurerna 2.1.4 till 2.1.7 i en laminär huva. - Fyll en 10 μL Hamilton spruta/nål med sterilt vatten och undvik luft i sprutan. Anslut Hamilton-sprutan/nålen till den återstående öppna änden av slangen genom att sänka ner slangen och nålspetsen på Hamilton-sprutan i poolen med sterilt vatten på parafilmen.
- Tryck på den snabba bakåtknappen på pumpskärmen för att flytta tryckblocket till sprutans ungefärliga längd. Skruva loss fästets klämknappar för att lossa fästfästena på påskjutaren och spruthållarblocken. Ladda Hamilton-sprutan på spruthållarblocket och säkra sprutan enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: För att säkra sprutan bör sprutcylinderklämman vara tätt mot sprutröret; Dra dock inte åt för mycket, särskilt när du använder glassprutor. Sprutkolven ska säkras av tryckblockets fästfäste. - Justera parametrarna på pumpinställningsskärmen.
- Tryck på Force-knappen och ställ in kraftnivån på 30%. Acceptera ändringarna för att gå tillbaka till inställningsskärmen .
- Tryck på snabbstartsknappen och välj Metod | Infusera/dra tillbaka.
- För sprutan väljer du Hamilton 1700, glas, 10 μl. Välj infusions - och uttagshastighet och injektionsvolym.
OBS: Kraftnivån är inställd beroende på spruttyp / material / kapacitet / tillverkare; Se fabrikstillverkarens instruktioner för föreslagen kraft för varje spruta. Injektionshastigheten som användes i detta experiment var 200 nL/s. SCJ-injektioner är relativt säkra, och det finns mindre oro för induktion av förhöjt intraokulärt tryck (IOP) till följd av injektionen. En långsammare injektionshastighet är ofta önskvärd för vissa applikationer för att undvika återflöde i nålen och upprätthålla konsistens i injektioner mellan djur.
- Mata ut vattnet från Hamiltonsprutan men lämna slangen och injektionsnålen full av vatten. Dra tillbaka Hamilton-sprutan något genom att trycka på Reverse-knappen för att införa en liten luftbubbla i slangen / nålen.
OBS: Luftbubblan kommer att fungera som en barriär mellan vattnet i röret och det terapeutiska läkemedlet (i detta fall AAV), vilket säkerställer noggrannheten hos den administrerade dosen. - Dra upp viruset genom att placera injektionsnålen i en alikvot av virusbeståndet. Se till att en synlig luftbubbla finns kvar mellan viruset och vattnet i slangen.
OBS: AAV-vektorer kan binda till plastslangen och metallnålen, vilket leder till förlust av virus och / eller felaktiga doseringsregimer. För att säkerställa noggrannhet, reproducerbarhet och en exakt dos av AAV rekommenderas därför förbeläggning av ytorna som därefter kommer i kontakt med AAV. För att belägga slang-/nålsystemet med viruset, dra in virusvektorlösningen i slangen/nålen och inkubera den vid rumstemperatur i 10 minuter för att möjliggöra mättnad av virusbindning till nålens och/eller slangens vägg. Kassera viruset.
- För att montera injektionssystemet, placera ett stereomikroskop och en sprutpump i ett biosäkerhetsskåp.
- Virusinjektion
- Bedöva musen med inhalerad anestesi (isofluran) eller intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin/acepromazin. Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet genom brist på svar på fasta tåpinnar.
OBS: Använd kvinnliga och / eller manliga C57BL / 6J eller BALB / c möss som är minst 6 veckor gamla. Ketamin/xylazin/acepromazindoser är följande: ketamin vid 70 mg/kg, xylazin vid 7 mg/kg och acepromazin vid 1,5 mg/kg. - Applicera lokalbedövning på ögat som kommer att få injektionen.
OBS: Använd 0,1% proparacainhydroklorid och/eller tetrakainhydroklorid oftalmisk lösning (0,5%) för lokalbedövning. - Applicera aktuell salva på det andra ögat som inte kommer att få en injektion för att förhindra torrhet och skada.
- Placera musen på mikroskopstadiet och exponera musögat under stereomikroskopet.
- Placera två fingrar på ögonlocket och dra det något bort från musens öga för att exponera konjunktiva, vilket är det inre membranet som förbinder ögonlocket med sclera.
- Ta tag i konjunktiva med pincett.
- Släpp ögonlocket och håll nålen med avfasningen uppåt med den dominerande handen.
- Sätt in nålen i konjunktiva. Sätt in nålen tills avfasningen är helt täckt av konjunktivalmembranet. Lägg nålen mot jordklotet.
OBS: Eftersom bindhinnan är ett klart membran är nålspetsen/avfasningen lätt synlig. - Starta injektionen genom att trycka på Start-knappen med fotbrytaren.
OBS: Luftens rörelse och Hamilton-kolven är synkroniserade; Varje fördröjning indikerar överflödig luft i injektionssystemet eller möjligen en lös anslutning mellan slangen, nålen och/eller sprutkomponenterna. - När injektionen är klar, håll nålen på plats i 10 s innan du drar tillbaka nålen från bindhinnan för att minska risken för återflöde.
OBS: Det är vanligt att en bleb uppträder på platsen för SCJ-injektionen. Sådana blebs försvinner normalt helt inom några timmar efter injektionen. - Lägg en droppe av den aktuella smörjmedelsgelen på musens ögon för att förhindra okulär torrhet / skada och placera sedan musen på en värmedyna för att återhämta sig.
- Utför okulära undersökningar som tårproduktion, IOP och slitslampaundersökning i samband med hornhinnefluoresceinfärgning för att bedöma okulära abnormiteter efter injektionen.
OBS: Tårproduktionen mäts med ett fenolrött trådtest, och en tonometer används ofta för att undersöka musögats IOP. Det rapporteras att vissa intraokulära injektioner, såsom intravitreala injektioner, kan resultera i en signifikant ökning av IOP; IOP-förändringar efter SCJ-injektion är dock inte uppenbara 13,22,23,24.
- Bedöva musen med inhalerad anestesi (isofluran) eller intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin/acepromazin. Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet genom brist på svar på fasta tåpinnar.
- AAV-biodistribution och transduktionseffektivitetsundersökning efter subkonjunktivalinjektion
- För att undersöka virusgenomets biodistribution och/eller transduktionsprofil för AAV-vektorer som levereras via SCJ, avliva mössen med AVMA-godkänd metod.
OBS: I detta experiment offrades mössen 8 veckor efter injektionen. - För biodistribution och transgenuttryck i riktade okulära fack, dissekera relevant vävnad av intresse, såsom ögonlocken, hornhinnan, konjunktiva, ögonmuskeln, näthinnan och optisk nerv. Snabbfrys alla vävnader och förvara vid -80 °C. För att undersöka AAV-biodistribution i hela kroppen, samla organ som de submandibulära lymfkörtlarna och levern och frysa och lagra dem vid -80 ° C.
- Använd ett DNA / RNA-extraktionssats och samla in gDNA och RNA från samma prov för att undersöka transgenuttryck respektive AAV-biodistribution. Om endast vektorbiodistribution önskas, använd ett DNA-extraktionssats för att extrahera gDNA.
- Utför standard qPCR och RT-qPCR för att bestämma AAV-vektorbiodistributionen och cDNA-överflöd med hjälp av vektortransgenspecifika primers / sonder13,25.
- För histologianalys, fixa ögonen, bädda in dem i paraffin och dela dem i en tjocklek av 5 μm. Utför standardimmunofluorescensfärgning för att avslöja transgenuttryck26.
- För att undersöka virusgenomets biodistribution och/eller transduktionsprofil för AAV-vektorer som levereras via SCJ, avliva mössen med AVMA-godkänd metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lösning som injiceras i subkonjunktivalutrymmet presenteras som en bleb beroende på injektionsvolymen.
I detta experiment injicerades 7 μL AAV (7 × 109 virala genom (vg)/öga) blandat med fluorescein i en slutlig koncentration av 0,1% med en 36 G-nål under ett stereomikroskop, och injektionshastigheten/trycket hölls konstant med hjälp av en programmerbar sprutpump vid 1 μL/s. En bleb kan visas vid injektion (pil). En mikroskopisk vy av administrering av AAV-vektorer till det murina SCJ-facket visas i figur 1.
Ämnen som injiceras i subkonjunktivalutrymmet diffunderar runt ögats värld och fördelas genom de periokulära vävnaderna.
För att definiera fördelningen av AAV administrerad via SCJ-injektion injicerades 7 μL utspätt Indien-bläck i subkonjunktivalutrymmet hos en 10 månader gammal mus efter bedövning. Ingen blödning, läckage eller återflöde upptäcktes under eller efter SCJ-injektionen. Trettio minuter efter injektionen skördades de okulära och omgivande vävnaderna och färgades därefter med Hematoxylin och Eosin (H&E) för att visualisera fördelningen av Indien-bläck. De representativa sagittala sektionerna som visas i figur 2 visar att dispersionen av indiskt bläck inträffade huvudsakligen intill de extraokulära musklerna, i den yttre ytan av sclera och de periokulära lösa bindväven (figur 2).
Självkompletterande AAV8 transducerar framgångsrikt hornhinnan och periokulära muskler efter SCJ.
För att bestämma transduktionsprofilen för självkomplementär AAV8 vid åtta veckor efter injektionen undersöktes GFP-överflöd i tvärsnitt över hela jordklotet via immunofluorescensfärgning med användning av en anti-GFP-antikropp vid en utspädning av 1:500. Bilderna togs under ett fluorescensmikroskop (figur 3). Dessa resultat avslöjade att AAV-vektorer som administreras via SCJ-injektion effektivt transducerar de periokulära musklerna bakom ögat och hornhinnan.
Rikligt vektorgenom och transgenuttryck i distinkta ögonfack efter SCJ-injektion
För att kvantitativt analysera vektorbiodistributionen och transgenuttrycket undersöktes vektorgenomkopieringsnummer i distinkta ögonfack och organ som lever och hjärta med qPCR (figur 4A), medan transgenuttrycket testades av qRT-PCR (figur 4B). Dessa resultat tyder på att SCJ-injektion av AAV8 resulterar i transgenuttryck i ögonlocket, bindhinnan, hornhinnan och synnerven.
Figur 1: Mikroskopisk vy av AAV-vektoradministration i det murina SCJ-rummet. För att möjliggöra visualisering av bildandet av en bleb under proceduren tillsattes 1% fluorescein direkt till AAV-vektorpreparatet. Bilderna togs med en digitalkamera kopplad till ett stereomikroskop. (A) Representativ bild av ett icke-injicerat öga; (B) representativ bild av ett injicerat öga. Pilen indikerar den injicerade AAV-lösningen som innehåller fluorescein i SCJ-utrymmet. Förkortningar: AAV = Adenoassocierat virus; SCJ = subkonjunktival. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: H&E-färgning av Indiens bläckfördelning (pil) efter SCJ-injektion i musögat. Sagittala delar av ett öga injicerat med Indien-bläck presenteras; 7 μl indiskt bläck injicerades på det angivna stället. *, Injektionsstället. Skalstreck = 500 μm. Förkortningar: SCJ = subkonjunktival; H&E = hematoxylin och eosin; C = hornhinna; I = iris; L = lins; R = Näthinnan; E = ögonlock; H = Harderian körtel; M = muskel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa GFP-histologibilder av självkompletterande AAV8 efter SCJ-injektion. Transduktion av hornhinnan (A) och ögonmusklerna (B) efter SCJ-injektion. GFP-uttryck (grönt) visualiserades via immunfärgning i paraffinbäddade vävnadssektioner med en anti-GFP-antikropp. Kärnor färgades med DAPI (blå). Skalstång = 100 μm (ögonmuskel), 20 μm (hornhinna). Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; AAV = adenoassocierat virus; SCJ = subkonjunktival; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantitativ analys av vektorbiodistribution och transgenuttryck. (A) Vektorbiodistribution i ögonfack (ögonlock, konjunktiva, hornhinna, optisk nerv och näthinna) och andra organ (lever och hjärta) efter SCJ presenteras som vektorgenomkopieringsnummer / μg av värdgenom-DNA. (B) GFP-överflöd som bestäms av qRT-PCR presenteras som vektor-cDNA-kopieringsnummer / värdtranskript. Denna siffra är modifierad från 13. Förkortningar: SCJ = subkonjunktival; qRT-PCR = kvantitativ revere-transkription PCR; GFP =grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV-medierad genterapi har stor potential för behandling av ögonsjukdomar. Nuvarande okulär genterapi är beroende av två stora lokala administreringsvägar, intravitreala och subretinala injektioner. Tyvärr är båda vägarna invasiva och kan orsaka allvarliga komplikationer, inklusive näthinneavlossning, kataraktbildning och endoftalmit. Således är undersökningen av relativt mindre invasiva vägar, såsom SCJ-injektion, av stort intresse.
Även om denna teknik är relativt enkel och betydligt mindre invasiv, finns det flera viktiga aspekter av AAV-leverans som måste belysas. Det rekommenderas att AAV-vektorn lagras vid -80 °C i alikvoter av önskad volym (100 μl här) i kiseliserade eller lågretentionsmikrocentrifugrör för att undvika flera frys-tina cykler och förhindra en minskning av viral titer. Vektorn som användes i detta experiment lagrades vid -80 ° C i ~ 6 år utan en signifikant förlust av titer. Dessutom kan fordonets sammansättning påverka vektorns stabilitet. I detta experiment var virusfordonet PBS med 350 mM NaCl + 5% D-sorbitol. Titern för det virus som användes i denna studie var 5,1 × 10 9 vg/μL (bestämd med qPCR) och totalt 7 × 109 vg/öga administrerades. Ett intervall på 1 × 108-1 × 1010 vg/öga är dock lämpligt, beroende på den riktade vävnaden och transgenen.
SCJ-injektioner är relativt mindre restriktiva när det gäller den administrerade volymen (1-100 μL för en mus). Volymskillnader tros dock spela en roll i AAV-biodistribution och transduktion, och större injektionsvolymer har enligt uppgift använts för att skapa en konjunktival ärrbildningsmodell27. En viktig aspekt är konjunktivas vaskulära natur, vilket kan leda till betydande systemisk clearance av AAV-vektorn, vilket resulterar i generering av neutraliserande antikroppar mot AAV-vektorn. Pågående forskning studerar aktivt potentiella strategier för att minska systemisk clearance av AAV-terapeutiska vektorer.
Dessutom är in vivo-fördelningen efter SCJ-injektion ett kritiskt övervägande för den potentiella tillämpningen av denna injektionsväg. I det aktuella protokollet undersöks fördelningen med hjälp av ett färgämne (Indien-bläck) vid en tidpunkt snarare än flera tidpunkter eller i realtid. Även om dessa data ger en viss indikation på hur AAV-vektorlösningen sprider sig omedelbart efter injektionen, kan fördelningen och kinetiska egenskaperna hos AAV-vektorn och andra ämnen variera avsevärt över tiden. Även om biodistributionen av AAV-vektorn detekterades i olika ögonfack med qPCR, som nämnts i avsnittet ovan metoder vid den experimentella slutpunkten, skulle idealiskt en teknik som kunde övervaka handeln med de terapeutiska reagenserna i hela ögat i realtid användas; Detta är dock ofta utmanande i praktiken. Slutligen kan AAV-transduktionsprofilen som observerats hos möss efter SCJ-injektion skilja sig åt i mänskliga ögon på grund av den uppenbara storleken, anatomiska och fysiologiska skillnader mellan ett musöga och ett mänskligt öga.
Näthinnesjukdomar är också ett viktigt mål för genterapi28; således är bestämningen av huruvida AAV administrerad via SCJ-injektion kan nå näthinnevävnaderna värtytterligare undersökning 13,17,29. Tidigare studier har visat att nanopartiklar som administreras via SCJ-injektioner kan nå den inre näthinnan. De specifika människohandelsvägarna är dock oklara. Distributionsdata för indiens bläck (figur 2) visar att det mesta av lösningen sprider sig till periokulära bindväv, vilket indikerar att AAV kan nå den inre näthinnan genom periokulär genomträngning genom att tränga in i sclera, choroid och retinal pigmenterat epitel.
Hornhinnetransduktionsdata som presenteras i figur 3A tyder på att AAV som injiceras i SCJ-utrymmet kan tränga in i sclera och hornhinnan. Detta tyder vidare på att administrering av AAV via SCJ-injektion kan nå den främre kammaren eller till och med de bakre och glasaktiga kamrarna, även om en signifikant högre dos kan krävas för att uppnå önskvärda effekter i näthinnan30. Ändå är SCJ-injektion en av de enklaste okulära administreringsvägarna och har stort löfte för AAV-leverans för att behandla flera okulära sjukdomar, inklusive men inte begränsat till okulära ytsjukdomar som limbal stamcellsbrist, torra ögonsjukdomar och / eller sjukdomar i ögonmusklerna, såsom oculopharyngeal muskeldystrofi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Vector Core vid University of North Carolina för att ha tillhandahållit scAAV8-GFP-vektorerna som används i denna studie, CGIBD Histology Core och laboratoriet för Dr. Brian C. Gilger för deras hjälp med de kliniska bedömningsaspekterna av denna studie. Denna studie stöddes av Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship och ett karriärutvecklingspris från American Society of Gene & Cell Therapy och Cystic Fibrosis Foundation. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
