Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta manuskript beskriver ett förenklat protokoll för isolering av retinala pigmenterade epitelceller (RPE) från musögon på ett stegvis sätt. Protokollet inkluderar enucleation och dissektion av musögon, följt av isolering, sådd och odling av RPE-celler.

Abstract

Det retinala pigmenterade epitelskiktet (RPE) ligger omedelbart bakom fotoreceptorerna och har ett komplext metaboliskt system som spelar flera kritiska roller för att upprätthålla fotoreceptorernas funktion. Således är RPE-strukturen och funktionen avgörande för att upprätthålla normal syn. Detta manuskript presenterar ett etablerat protokoll för primär mus RPE-cellisolering. RPE-isolering är ett utmärkt verktyg för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom RPE-patologi i de olika musmodellerna av okulära störningar. Dessutom kan RPE-isolering hjälpa till att jämföra primära mus RPE-celler isolerade från vildtyp och genetiskt modifierade möss, samt testa läkemedel som kan påskynda utvecklingen av terapi för synstörningar. Manuskriptet presenterar ett steg-för-steg RPE-isoleringsprotokoll; Hela proceduren, från enucleation till sådd, tar cirka 4 timmar. Media bör inte ändras i 5-7 dagar efter sådd, för att möjliggöra tillväxt av de isolerade cellerna utan störningar. Denna process följs av karakterisering av morfologi, pigmentering och specifika markörer i cellerna via immunofluorescens. Celler kan passeras högst tre eller fyra gånger.

Introduction

Retinala pigmenterade epitelceller (RPE) är belägna mellan choroid och neural näthinna och bildar ett enkelt monolager av kuboidala celler som ligger bakom fotoreceptorcellerna (PR)1. RPE spelar en avgörande roll för att upprätthålla en hälsosam miljö för PR-celler, främst genom att minska överdriven ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) och därmed oxidativ skada1. RPE-celler övervakar många funktioner, såsom omvandling och lagring av retinoider, absorption av spritt ljus, vätske- och jontransport och fagocytos av skjulets yttre segmentmembran 2,3. Förändringar i RPE (morfologi/funktion) kan försämra deras funktion vilket leder till retinopati och detta är en vanlig egenskap som delas av många okulära störningar4. Många okulära sjukdomar är förknippade med förändringar i morfologin och funktionen hos RPE-celler, inklusive vissa genetiska sjukdomar som retinitis pigmentosa, Leber medfödd amauros och albinism 4,5,6, liksom åldersrelaterade okulära störningar som diabetisk retinopati (DR) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)7,8 . Mänskliga celler är de mest önskvärda, så det skulle vara idealiskt att studera RPE-störningar i primära humana RPE-celler för att bilda RPE-monolager. Etiska frågor och den begränsade tillgången på mänskliga givare på grund av det faktum att de flesta av dessa störningar leder till sjuklighet9, men inte nödvändigtvis dödlighet10, förhindrar därmed isolering av primära mänskliga RPE-celler. Detta gör odling av RPE-celler från icke-mänskliga djurdonatorer till ett föredraget alternativ. Gnagare, särskilt möss, anses vara en bra modell för att studera olika ögonsjukdomar eftersom transgen teknik är mer omfattande etablerad i dessa arter11. Även om användningen av odlade primära RPE-celler erbjuder många fördelar, har det varit svårt att behålla växande celler för många passager, eller att lagra och återanvända cellerna. Huvudbegränsningen i detta protokoll är mössens ålder; möss som används för RPE-isolering bör vara i mycket ung ålder (18-21 dagar är optimalt) eftersom det har varit svårt att odla RPE-celler från vuxna möss11,12,13. RPE-celler kan isoleras från musögon i alla åldrar, men upp till fyra cellpassager lyckades bara med unga möss (18-21 dagar gamla). RPE-isolering från musnäthinnor, med användning av både C57BL6-möss och transgena möss med radering av N-metyl-D-aspartatreceptorerna (NMDAR) vid RPE-cellerna, utfördes för att studera effekten av förhöjd aminosyrahomocystein på utvecklingen och progressionen av AMD14. Dessutom hjälpte isolerade primära RPE-celler till att föreslå ett terapeutiskt mål för AMD genom hämning av NMDARs vid RPE-celler14. Det finns några NMDAR-blockerare som är godkända av Food and Drug Administration (FDA) och används för närvarande för att behandla måttlig till svår förvirring (demens) relaterad till Alzheimers sjukdom (AD), såsom memantin16, vilket kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för AMD14. Vidare användes isolerade primära mus-RPE-celler för detektion av inflammatoriska markörer och den föreslagna induktionen av inflammation som en underliggande mekanism för homocysteininducerade egenskaper hos AMD och AD med hjälp av en genetiskt modifierad mus (CBS), som presenterar en hög nivå av homocystein16,17.

Detta protokoll användes för att isolera RPE-celler från både vildtyp C57BL / 6-möss och transgena möss som utvecklats i vårt laboratorium som en förenklad anpassning av andra publicerade isoleringsprotokoll13,18,19 för att nå ett lätt tillämpligt och pålitligt protokoll. Det finns ingen könspreferens i detta protokoll. Medan mössens åldrar är avgörande för isoleringsprocessen användes unga, åldrade möss (18-21 dagar gamla) och äldre möss i alla åldrar (upp till 12 månader) för RPE-isolering. Vi märkte dock att RPE-cellerna isolerade från de unga mössen levde längre och upp till fyra passager kunde utföras. RPE-cellerna isolerade från äldre möss kunde passeras en eller två gånger, då skulle de sluta växa i normal takt och ändra sin form för att vara mer långsträckta (fibroblastliknande celler). Förlust av pigmentering och minskad vidhäftning till vävnadsodlingsplattan följt av lossning observerades också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur användes enligt riktlinjerna från Oakland University IACUC djurprotokoll nummer 21063 och riktlinjerna i ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och synforskning.

1. Beredning av lösningen

  1. Förbered det kompletta RPE-cellodlingsmediet genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Fetal Bovine Serum (FBS), 1.5% penicillin / streptomycin och 0.02% gentamicin.
  2. Bered enzym A genom att komplettera 741 μl Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) med 127 μL kollagenas stamlösning och 132 μL Hyaluronidase stamlösning. Detta gör en slutlig volym på 1 ml, som kan behandla fyra ögon.
    1. Bered stamlösningen av kollagenas genom att lösa 1 mg kollagenas från Clostridium histolyticum i 41 ml HBSS (19,5 enheter/ml).
    2. Bered stamlösningen av hyaluronidasstammen genom att lösa upp 1 mg hyaluronidas från testiklarna från nötkreatur i 18,4 ml HBSS (38 enheter/ml).
  3. Förbered enzym B genom att tillsätta två delar av 0,25% Trypsin-EDTA till tre delar av HBSS. Observera att den totala volymen är beroende av antalet dissekerade ögon; 1 ml enzym B kan användas för att behandla fyra ögon.

2. Enucleation

  1. Avliva musen etiskt med hjälp av koldioxid (CO2) inandning enligt IACUC standarder21.
    1. Placera kortfattat djuret /djuren i CO 2-kammaren för att införa 100% CO 2 med en fyllningshastighet på 30% -70% av kammarvolymen per minut med CO 2 för att uppnå medvetslöshet inom2 till 3 minuter, med minimal nöd för mössen.
    2. Bekräfta döden (brist på andning och blekad ögonfärg), flytta sedan musen från buret till ett rent steriliserat kirurgiskt område (skrubbad med alkohol) utrustad med steriliserad kirurgisk utrustning.
  2. Placera musen på en steril underplatta.
  3. Förbättra ögonen genom att trycka på pincett i 5/45 stil på orbitalområdet för att inducera proptos, följt av att flytta pincetten till ögats bakre del. Extrahera ögonen, med synnerven intakt, genom att dra ögonen försiktigt från orbitalhålan.
  4. Använd pincett, sänk ner ögonen i ett 2 ml mikrocentrifugrör innehållande 1 ml 5% povidon-jod. Inkubera ögonen vid rumstemperatur i 2-3 min.
  5. Ta bort ögonen från povidon-jodlösningen och lägg dem i en petriskål. Tvätta ögonen med HBSS med en steril överföringspipett tills povidonjodens orange färg är borta. Detta tar cirka två eller tre tvättar.
  6. Placera ögonen i en ny 60 mm petriskål och sänk ner dem i kalla (2-8 °C) kompletta RPE-cellodlingsmedier som beretts i steg 1.1.

3. Dissektion

  1. Under ett kirurgiskt mikroskop, använd M5S-stil pincett och Vannas sax för att ta bort bindväv och extraokulära muskler.
    OBS: Dissektion görs under en vävnadshuv i en helt steril miljö. Men för videoändamål placerades dissekeringsmikroskopet utanför huven för att uppnå en demonstration / filmning av högre kvalitet. Att placera en liten bit luddfritt silkespapper under ögat förbättrar stabiliteten under dissektion. Ögonen kan sedan hållas tillfälligt (inte i mer än 1 timme) i det kalla RPE-cellodlingsmediet. Det är dock att föredra att gå direkt till nästa steg omedelbart efter rengöring av ögonen.
  2. Överför ögonen till ett 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml enzym A-lösning för vart fjärde öga. Inkubera sedan ögonen i en inkubator vid 37 °C i 40 minuter.
  3. Ta bort ögonen från inkubatorn och mikrocentrifugröret. Överför dem sedan till ett nytt mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml enzym B-lösning för vart fjärde öga. Inkubera röret i en inkubator vid 37 °C i 50 minuter.
  4. Placera ögonen i en ny 60 mm suspensionsodlingsskål som innehåller 10 ml komplett RPE-celltillväxtmedium. Inkubera sedan ögonen vid 4 °C i 30 minuter.
  5. Placera skålen under ett kirurgiskt mikroskop och börja dissekera.
  6. Ta bort den främre delen av ögat (hornhinna, iris och lins) från den bakre delen av ögonmusslan (bakre näthinnan).
    1. Ta tag i ögat med Tång i M5S-stil och gör ett snitt i ora serrata-sektionen (de flesta främre delen av näthinnan där den ljusblå ändarna) med ett #11-blad eller nålen på en spruta.
    2. Ta tag i den inre delen av snittet med ett par pincett och ta tag i hornhinnan med ett annat par pincett. Börja långsamt dra eller riva hornhinnan från näthinnan. Var noga med att riva i små steg och flytta ner tåren medan du tar bort hornhinnan, för att säkerställa att RPE förblir mestadels intakt och resulterar i en renare tår.
      OBS: När hornhinnan är helt lossnad kan iris och lins ses.
    3. Separera både hornhinnan och iris.
  7. Separera linsen från ögonmusslan med mild kompression av den bakre halvan av ögat.
  8. För att ta bort den neurala näthinnan från RPE-skiktet, ta tag i ögonmusslans yttre lager med ett par pincett och placera armen på ett andra par pincett mellan både RPE och neurala lager. Därifrån drar eller skopar försiktigt den neurala näthinnan bort från RPE-lagret. Kassera den neurala näthinnan.
    OBS: I videon tas den neurala näthinnan och linsen bort tillsammans. Men för nybörjare blir det lättare att ta bort var och en separat. Det som återstår är RPE, choroid och sclera.
  9. Kassera hornhinnan, iris, linsen och neural näthinnan. Flytta den återstående ögonmusslan till ett nytt område på skålen fritt från skräp.
  10. För att separera RPE från choroid och sclera, skrapa försiktigt insidan av ögonmusslan med 5/45 pincett för att säkerställa separation av RPE-cellerna. RPE-cellerna verkar grumliga när de är upphängda i hela RPE-celltillväxtmediet.
  11. Aspirera cellerna med hjälp av en 3,2 ml steril överföringspipett och överför till ett nytt 15 ml centrifugrör innehållande komplett RPE-celltillväxtmedium.

4. Centrifugering

  1. Placera 15 ml centrifugröret som innehåller primära RPE-celler inuti en centrifug och centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
  2. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med 10 ml komplett RPE-tillväxtmedium. Det kompletta RPE-tillväxtmediet är mer specifikt för RPE-tillväxt än andra förorenande celler, såsom Müller-celler eller koroidala endotelceller. Müller-celler kräver höga glukosmedier, medan koroidala endotelceller kräver specifika tillväxtfaktorer. Genom att ändra media och passera kulturen kommer endast RPE-cellerna att fortsätta växa.

5. Cellodling

  1. Plåta de återsuspenderade primära RPE-cellerna på en steril 100 mm petriskål och överför dem till en inkubator (efter kontroll av renheten genom färgning av celler med specifika RPE/Müller-cellmarkörer, enligt figur 1E-N). Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 %CO2.
    OBS: De markörer som används nämns i materialförteckningen. Detta steg utförs efter att kulturen är etablerad.
  2. Inkubera cellerna i ca 5 dagar för att växa. Under denna tid, byt inte media, stör cellerna eller flytta cellodlingsplattan (detta är ett kritiskt steg i protokollet, efter isolering ska cellerna inkuberas och inte störas i 5 dagar).
    OBS: Antalet celler beror på antalet ögon som används för isoleringen. Ett större antal isolerade ögon ger ett större antal celler. RPE-isolering från två ögon ger ~ 440 000-880 000 celler, eller 5% -10% av 100 mm petriskålen, som kan rymma 8,8 miljoner celler.

6. Passning

  1. Aspirera ut media och tvätta med 2 ml PBS. Aspirera sedan ut PBS.
  2. Tillsätt 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x), eller tillräckligt för att täcka skålens botten. Inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
  3. Tillsätt 8 ml förvärmda RPE-medier eller dubbelt så mycket som volymen av hur mycket trypsin som användes i steg 6.2. Samla sedan cellerna och placera dem i ett 15 ml centrifugrör.
  4. Centrifugera vid 300 x g i 7 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml komplett RPE-cellodlingsmedium. Platta hela suspensionen i en steril 100 mm petriskål.
    OBS: Cellerna kan passeras upp till fyra eller fem gånger18. De mest konsekventa experimentresultaten hittas dock efter två eller tre passager. Efter två till fyra passager ändrade cellerna sin form (som visas i figur 1D) för att vara mer långsträckta, ackumulerade i mitten av plattan, slutade växa och lossna.
  5. Använd immunofluorescensprotokoll, enligt de tidigare publicerade metoderna 8,14,15,16, för att fläcka och validera RPE-specificiteten.

7. Immunofluorescens

OBS: Immunofluorescens utfördes enligt de tidigare publicerade metoderna 8,14,15,16,17,18 för att färga och validera RPE-specificiteten. Färgningen av primära RPE-celler gjordes vanligtvis vid passagerna P1 och P2. Här presenteras en kort översikt över det immunofluorescerande protokollet.

  1. Frö cellerna på en cellodlingskammare (30 000 celler per brunn för 8-brunnskammarens glid).
  2. Odla cellerna i kompletta RPE-cellodlingsmedier vid 37 °C och 5%CO2 i 24-48 timmar.
  3. När cellerna är 80% -90% sammanflytande, aspirera ut media och tvätta kammarglaset med 1x PBS.
  4. Fixa bilden med 4% paraformaldehyd i 10-15 min.
  5. Aspirera ut 4% paraformaldehyd och blockera sedan med blockerande lösning (se Materialförteckning).
  6. Sug ut blockeringslösningen och tillsätt den primära antikroppen, RPE65, och inkubera i tre timmar vid 37 °C (med en antikroppskoncentration som sträcker sig från 1:200-1:250 i blockerande buffert, vid en volym av 150-200 μl/diabild). Tvätta sedan tre gånger med PBS/TX-100 (5-10 min varje tvätt).
  7. Aspirera ut den primära antikroppen och tillsätt den sekundära antikroppen (med en antikroppskoncentration 1:1 000 i blockerande buffert, vid en volym av 150-200 μL/diabild). Inkubera i en timme vid 37 °C.
  8. Aspirera ut den sekundära antikroppen. Tvätta tre gånger med PBS/Trtion X-100 (5-10 min varje tvätt).
  9. Lägg till en droppe DAPI-monteringsmedium för att märka kärnorna och placera en täckskiva över bilden. Se till att det inte finns några bubblor under täckglaset.
  10. Ta sedan bilder med ett fluorescerande mikroskop, åtföljt av en högupplöst mikroskopkamera (HRM) och bildbehandlingsprogramvara (se materialförteckning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av specificitet, renhet och barriärfunktion/bildning av isolerade RPE-celler
De isolerade cellerna undersöktes under ett ljusmikroskop för att verifiera deras livskraft, morfologi och pigmentering. Bilder från P0 och P1 (figur 1A,B) och bilder från P0 och P4 togs (figur 1C,D) för att visa förändringarna i cellerna; form, storlek och pigmentering när passagerna fortsatte till den fjärde passagen (svarta pilar pekar på de isolerade RPE-cellerna i P4). En antikropp för RPE65-proteinet användes för att verifiera de isolerade cellernas identitet. Immunofluorescensfärgning av de isolerade cellerna utfördes med en antikropp mot RPE65, följt av undersökning under det fluorescerande mikroskopet (figur 1E,F: låg förstoring och figur 1G,H: hög förstoring, som visar positivt färgade RPE-celler i grönt och en kärnmarkör, DAPI, i blått). RPE65 är ett isomerohydrolas uttryckt i RPE. Det är viktigt för regenerering av det visuella pigment som krävs för stav- och konmedierad syn21 . För att validera barriärfunktionen hos den isolerade
celler, både cytoskelettprotein F-aktin och tätt korsningsprotein ZO-1 immunofluorescensfärgning8 för de isolerade cellerna användes (figur 1I,J: grön ZO-1 och blå kärnfärgning). och figur 1K,L: rött F-aktin och blå kärnfärgning). Den typiska kullerstensformen för RPE är dock mycket tydlig när cellerna är helt sammanflytande.

Negativ kontroll användes i experimenten där den sekundära antikroppen tillsattes till RPE-cellerna utan att tillsätta den primära antikroppen, för att säkerställa att antikroppens specificitet och den resulterande färgen är specifik för de antikroppar som användes (visas inte).

För att validera renheten och kontamineringen av den isolerade RPE av Müller-celler användes immunofluorescensfärgning av de isolerade cellerna med en specifik cellmarkör för Müller-celler, vimentin, (grön och blå för kärnfärgning som visas i figur 1M,N) med Müller-celler som en positiv kontroll. Isolerade RPE-celler visade negativ färgning för vimentin.

De isolerade cellerna undersöktes under ett ljusmikroskop för att verifiera deras livskraft, morfologi och pigmentering. Bilder från P0 och P1 (figur 1K,L) och bilder från P0 och P4 togs (figur 1M,N) för att visa förändringarna i cellernas form, storlek och pigmentering när passagerna fortsatte till den fjärde passagen (svarta pilar pekar på de isolerade RPE-cellerna i P4).

Figure 1
Figur 1: Validering av RPE-isolering. (A) Ljusmikroskop för RPE-passage noll (P0). (B) Ljusmikroskop för RPE passage ett (P1). (C) Karakterisering av morfologi vid P0. (D) Karakterisering av morfologi vid P4. (E) Immunfärgning för RPE65 vid låg förstoring. (F) Immunfärgning för RPE65 med kärnfärgning med DAPI. (G) Immunfärgning för RPE65 vid hög förstoring. (H) Immunfärgning för RPE65 med kärnfärgning med DAPI vid hög förstoring. (I) ZO-1-färgning för RPE-celler. (G) ZO-1-färgning för RPE-celler med kärnfärgning med DAPI. (K) F-aktinfärgning för RPE-celler. (L) F-aktinfärgning för RPE-celler med kärnfärgning med DAPI. (M) Vimentinfärgning för RPE-celler. (N) Vimentinfärgning för Müller-celler som en positiv kontroll (RMc-1) med kärnfärgning med DAPI. Skalstänger är lika med 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm respektive 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nuvarande protokollet är ett rapporterat, modifierat och förenklat detaljerat förfarande för RPE-isolering från musögon. Protokollet inkluderar enucleation, dissektion, insamling, sådd, odling och karakterisering av RPE-celler isolerade från musögon.

Det finns vissa begränsningar och kritiska steg som måste uppfyllas för framgångsrik RPE-isolering, såsom mössålder, antalet ögon som dissekerats, storleken på vävnadsodlingsplattan eller skålen och försiktighetsåtgärder efter sådd, lagring och passering. För att kunna passera de isolerade cellerna upp till tre eller fyra gånger är de bästa mössåldrarna mellan 18-21 dagar. För att ha ett rimligt antal isolerade celler som kan växa och föröka sig behövs minst två ögon för enkel isolering. Antalet celler som resulterar i isolering är proportionellt mot antalet ögon som dissekeras (~ 220 000 celler / öga). En steril 100 mm petriskål/kolv rekommenderas för att erhålla ett större antal celler i en tidig passage (P0). Efter sådd bör cellerna inte störas genom att flytta vävnadsodlingsplattan från inkubatorn eller genom att byta media i minst 5 dagar. En av begränsningarna meddenna teknik är också lagring och passering av de isolerade cellerna. Celler kan inte lagras (frysas och tinas) och kan bara passeras tre eller fyra gånger. Efter passage 4 börjar cellerna ändra storlek och form för att bli långsträckta (spindelform) med en markant minskning av cellpigmentering (figur 1D).

Detta protokoll skiljer sig från andra värdefulla och pålitliga publicerade protokoll för primär mus RPE-isolering1 3,19,20 genom att det förenklas med några steg som är lätta att följa. RPE-celler kan identifieras med sin morfologi, pigmentering och specifika RPE-markörer såsom RPE65 4,5,21. Validering av renheten och kontamineringen av Müller-celler uppnåddes genom färgning av isolerade celler med en specifik cellmarkör för Müller-celler (vimentin)22. Många tekniker har använts för att utvärdera integriteten hos blod-retinal barriären (BRB) in vitro, såsom elektronmikroskop (EM) undersökning, bedömning av täta korsningsproteiner (TJP), FITIC dextranläckageanalys och transepitelial elektrisk resistans (TER) mätning som utvärderar den fysiologiska funktionen av RPE som ett monolager 8,23 . RPE-celler spelar en viktig roll för att upprätthålla den yttre BRB, och för att validera denna funktion utvärderade vi tight junction-proteiner (TJP) såsom Zona ocludin-1 (ZO-1) och cytoskelettproteiner som F-aktin som tidigare publicerats8. TJPs-utvärdering är en bekvämare metod för utvärdering av BRB-integritet och barriärfunktion som inte kräver dyr utrustning som kanske inte är tillgänglig i alla forskningslaboratorier, i motsats till EM-utvärdering eller TER.

Primär RPE-isolering är en teknik som kan vara ett viktigt verktyg för att studera underliggande mekanismer och patogenes, och för att föreslå nya terapeutiska tillämpningar för olika ögonsjukdomar. Den nuvarande tekniken gjorde det möjligt att studera förändringarna i RPE-cellstruktur och funktion och deras inverkan på den yttre BRB vid åldersrelaterad makuladegeneration8. Dessutom hjälpte det till att studera förändringarna i RPE-celler isolerade från vildtyp C57BL6-möss och olika genetiskt modifierade möss, samt testa de olika farmakologiska föreningarna som söker ett terapeutiskt mål för AMD14,16.

Sammanfattningsvis visade många tillgängliga publicerade protokoll primär mus RPE-isolering. Det presenterade protokollet är ett förenklat förfarande som härrör från att modifiera vissa befintliga protokoll, med hjälp av material, metoder och utrustning som finns tillgängliga i de flesta forskningslaboratorier för att isolera primära RPE-celler från musögon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att förklara som är relevanta för innehållet i denna artikel.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biologi utgåva 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolering av primära musretinala pigmenterade epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter