Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

يحدد قياس التنفس عالي الدقة إلى جانب مستشعرات التألق استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يصف هذا البروتوكول تقنية لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي المتغلغل.

Abstract

يصاحب خلل الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية العديد من الأمراض المرتبطة بالاعتلال العصبي المحيطي ، والذي يمكن أن يحدث لأسباب متعددة ، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسكري والالتهابات والاضطرابات الموروثة والأورام. يمكن أن يكون تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية للفأر أمرا صعبا بسبب صغر حجم العينة ، وعدد محدود من الميتوكوندريا الموجودة في الأنسجة ، ووجود غمد المايلين. تقلل التقنية الموصوفة في هذا العمل من هذه التحديات باستخدام بروتوكول نفاذية فريد من نوعه مقتبس من بروتوكول يستخدم لألياف العضلات ، لتقييم وظيفة الميتوكوندريا العصبية الوركية بدلا من عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة. من خلال قياس إنتاج الأنواع التفاعلية الفلورية باستخدام Amplex Red / Peroxidase ومقارنة ركائز ومثبطات الميتوكوندريا المختلفة في الأعصاب النفاذة للسابونين ، كان من الممكن اكتشاف حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، ونشاط مجمعات الميتوكوندريا في وقت واحد. لذلك ، فإن الطريقة المعروضة هنا تقدم مزايا مقارنة بتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة تقنيات أخرى.

Introduction

الميتوكوندريا ضرورية للحفاظ على صلاحية الخلية وأداء العديد من وظائف الخلية مثل استقلاب الطاقة (الجلوكوز والأحماض الأمينية والدهون ومسارات استقلاب النيوكليوتيدات). باعتبارها الموقع الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، فإن الميتوكوندريا مركزية في العديد من عمليات إشارات الخلايا مثل موت الخلايا المبرمج وتشارك في تخليق مجموعات الحديد والكبريت (Fe-S) ، واستيراد بروتين الميتوكوندريا ونضجه ، والحفاظ على الجينوم والريبوسومات1،2،3. يتم التحكم في شبكة ديناميكيات غشاء الميتوكوندريا عن طريق عمليات الاندماج والانشطار ، ولديهم أيضا آلات لمراقبة الجودة و mitophagy 4,5,6.

يرتبط خلل الميتوكوندريا بظهور العديد من الحالات المرضية مثل السرطان والسكري والسمنة7. يتم الكشف عن اضطرابات في وظيفة الميتوكوندريا في الاضطرابات العصبية التنكسية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، كما هو الحال في مرض الزهايمر 8,9 ، ومرض باركنسون 10,11 ، والتصلب الجانبي الضموري 12,13 ، ومرض هنتنغتون 14,15 . في الجهاز العصبي المحيطي ، لوحظ فقدان وظيفة الميتوكوندريا في المحاور العصبية في الاعتلالات العصبية المناعية ، مثل متلازمة غيلان باريه 16,17 ، وبالاقتران مع ارتفاع إنتاج ROS الميتوكوندريا في المحاور العصبية ، تؤدي هذه الأحداث إلى تنشيط كيناز MAP في خلايا شوان18. هذا يدل على أن فسيولوجيا الميتوكوندريا قد تكون ضرورية ليس فقط لخلية خاصة بالموقع ، ولكن لنسيج بأكمله. في اعتلال الأعصاب الحسي البعيد المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV-DSP) ، يكون للميتوكوندريا دور في الآلية التي يسمح من خلالها المنشط العابر لبروتين النسخ (HIV-TAT) لفيروس نقص المناعة البشرية بالتكاثر بكفاءة ، بالإضافة إلى العديد من الأدوار الأخرى في التسبب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية19,20.

ظهر تقييم فسيولوجيا الميتوكوندريا العصبية الوركية كهدف أساسي للتحقيق في الاعتلال العصبي7،21،22. في الاعتلال العصبي السكري ، تشير التحليلات البروتينية والأيضية إلى أن معظم التغيرات الجزيئية في مرض السكري تؤثر على الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا الوركية للعصب الوركي واستقلاب الدهون7. يبدو أن هذه التعديلات هي أيضا علامات مبكرة لمرض السكري الناجم عن السمنة21. في نموذج الفأر للاعتلال العصبي المؤلم الناجم عن العلاج الكيميائي ، يتم الكشف عن ضعف الميتوكوندريا في العصب الوركي كانخفاض في الفسفرة التأكسدية22 ، وانخفاض في أنشطة مجمعات الميتوكوندريا ، وإمكانات الغشاء ، ومحتوى ATP23. ومع ذلك ، على الرغم من أن العديد من المجموعات قد استشهدت بخلل الميتوكوندريا في الاعتلالات العصبية ، إلا أن هذه الدراسات تقتصر على قياسات النشاط في مجمعات الميتوكوندريا دون الحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ، وتفتقر إلى تقييم سلامة الميتوكوندريا أو قياسات محتوى ATP كمعلمة لإنتاج ATP الميتوكوندريا. بشكل عام ، يتطلب التقييم السليم لاستهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي في تدرج percoll / sucrose. يمكن أن يكون عزل الميتوكوندريا أيضا عاملا مقيدا للأنسجة العصبية الوركية بسبب الكمية الكبيرة من الأنسجة اللازمة وفقدان الميتوكوندريا وتعطيلها.

تهدف هذه الدراسة إلى توفير بروتوكول لقياس فسيولوجيا الميتوكوندريا مثل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي ، والحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ودون الحاجة إلى عزل الميتوكوندريا. تم تكييف هذا البروتوكول من قياسات استهلاك الأكسجين في ألياف العضلات المتخلل24 بواسطة قياس التنفس عالي الدقة (HRR). تتمثل مزايا هذا الإجراء في إمكانية تقييم الميتوكوندريا في كميات صغيرة من الأنسجة مثل العصب الوركي وتقييم معلمات الميتوكوندريا في الموقع ، وبالتالي الحفاظ على بيئة الميتوكوندريا وهيكلها وملف تعريف الطاقة الحيوية ، للحصول على نتيجة جديرة بالثقة من الناحية الفسيولوجية. تم تحديد الحالات التنفسية للميتوكوندريا باستخدام ركائز ومثبطات بعد نفاذية العصب الوركي لتقييم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ومعامل السيتوكروم ج بشكل صحيح لسلامة غشاء الميتوكوندريا ، مما يوفر دليلا لخطوات تقييم نظام نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETS) وحساب المعلمات الأساسية. يمكن أن توفر هذه الدراسة أدوات للإجابة على الأسئلة في الآليات الفسيولوجية المرضية التي يتورط فيها استقلاب العصب الوركي ، مثل الاعتلالات العصبية المحيطية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات في البحوث، CCS/UFRJ (CEUA-101/19)، والمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام التجارب. يتم عزل العصب الوركي من الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر أربعة أشهر ، ويتم قتلها الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم تحسين خطوات البروتوكول لتجنب تدهور الميتوكوندريا. لذلك ، في هذا البروتوكول ، تم إجراء معايرة أجهزة استشعار الأكسجين القطبي قبل تشريح الأنسجة العصبية الوركية للفأر ونفاذها.

1. إعداد الكواشف

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحفاظ على الأنسجة (TP Buffer).
    1. قم بإعداد الكواشف التالية في محلول مائي فائق النقاء: 10 ملليمتر من المخزن المؤقت Ca-EGTA مع 0.1 ميكرومتر من الكالسيوم الحر ، 20 ملليمتر من الإيميدازول ، 20 ملليمتر من التورين ، 50 ملليمتر من K-MES ، 0.5 ملليمتر من DTT ، 6.56 ملليمتر من MgCl2 ، 5.77 ملليمتر من ATP ، 15 ملليمتر من الفوسفوكرياتين (انظر جدول المواد) ، الرقم الهيدروجيني 7.1. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. تحضير المخزن المؤقت للتنفس الميتوكوندريا (MR Buffer).
    1. تحضير الكواشف التالية في محلول مائي فائق النقاء: 0.5 mM من K 2 EGTA ، 3 mM من MgCl 2 ، 60 mM من MES ، 20 mM من التوراين ، 10 mM من KH2PO 4 ، 20 mM من HEPES ، 110 mM من D-sucrose ، 1 mg / mL من BSA (خالية من الأحماض الدهنية) (انظر جدول المواد) ، الرقم الهيدروجيني7.4. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول مخزون الصابونين عن طريق إذابة 5 ملغ من الصابونين (انظر جدول المواد) في 1 مل من TP Buffer (الخطوة 1.1) والاحتفاظ به على الجليد. يتم إعداد الصابونين طازجا.
  4. قم بتحضير Amplex Red عن طريق تعليق المسحوق (انظر جدول المواد) باستخدام DMSO للحصول على تركيز مخزون يبلغ 2 mM وتخزينه عند -20 درجة مئوية في قارورة محمية من الضوء.
    ملاحظة: لتجنب تآكل المسبار عن طريق التجميد والذوبان ، قم بعمل أليكوتات صغيرة للتخزين لا تزيد عن 6 أشهر25.

2. معايرة أجهزة استشعار الأكسجين القطبي لقياس التنفس عالي الدقة (HRR)

  1. تنظيف غرف HRR من الأداة والمحاقن (انظر جدول المواد).
    1. افتح غرف HRR ، املأها بالماء المقطر حتى الأعلى وحرك لمدة 5 دقائق 3x. كرر مع الإيثانول ثم مرة أخرى بالماء. اغسل السدادات والمحاقن بالماء / الإيثانول / الماء 3 أضعاف لكل منهما.
  2. قم بتطبيق إعدادات المعايرة التالية في برنامج HRR (انظر جدول المواد).
    1. في التحكم في برنامج HRR ، أضف درجة الحرارة التجريبية (37 درجة مئوية) ، ومعلمات مستشعر الأكسجين (الكسب ، 2 ؛ جهد الاستقطاب ، 800 mV) ، ومستشعر الأمبيرومترية (الكسب ، 1000 ؛ جهد الاستقطاب ، 100 mV).
  3. معايرة أجهزة استشعار الأكسجين.
    1. ماصة 2.1 مل من MR Buffer (الخطوة 1.2) في كل غرفة. أغلق مع السدادات واسحب الهواء إلى الغرفة حتى يتم تشكيل فقاعة. يحرك المزيج على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في وضع المعايرة حتى يستقر تدفق الأكسجين لكل كتلة.
    2. قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعرات الأكسجين المستقطبة في البرنامج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة24.
      ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة المعايرة مرة واحدة فقط قبل إجراء تجربة. يمكن إجراء تجارب إضافية في نفس وسط التنفس ودرجة الحرارة بعد مجرد غسل الغرف (الخطوة 2.1).

3. تشريح ونفاذية العصب الوركي

  1. قم بإزالة العصب الوركي باتباع الخطوات أدناه.
    1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم بعد إزالته من قفصه وتقييده بلطف للراحة على مقاعد البدلاء.
    2. في الحيوان الرحيم ، قم بعمل شق بمقص في أسفل الظهر ، بدءا من العمود الفقري والمضي قدما أسفل الفخذ نحو القدم. إزالة الجلد والعضلات المرتبطة بالعصب ، ثم قطع وإزالة العصب الوركي بأكمله.
    3. قم بوزن الأنسجة على الفور وضعها في قارورة مليئة بمخزن السل البارد (4 درجات مئوية). نفذ الخطوات من 3.2 إلى 3.3 على الجليد.
      ملاحظة: يتم استخدام وزن الأنسجة الرطبة لتطبيع استهلاك الأكسجين وتدفق إنتاج ROS في الخطوات التالية. إذا تعذر وزن الأنسجة على الفور، فاحفظها في مخزن السل البخاخ البارد. يتم تنفيذ الإجراء في الأنسجة الطازجة ويجب عدم تجميده لتجنب تلف الميتوكوندريا.
  2. لإعداد الأنسجة ، ضع العصب الوركي في طبق بتري مع ما يكفي من TP Buffer لتغطيته. امسك أحد طرفي العصب بملقط ، ومع زوج آخر من الملقط ، اسحب الحزم العصبية أفقيا.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء في أقل من 10 دقائق لتجنب تدهور الأنسجة. سيكون النسيج جاهزا عندما يمكن تصوره كطبقات ضبابية شفافة ، مقابل الأنسجة البيضاء غير الشفافة السابقة (الشكل 1).
  3. أولا ، انقل الأنسجة الملتفة إلى طبق صغير يحتوي على 1 مل من TP Buffer لتخلل الأنسجة. لبدء الاختراق ، انقل الأنسجة بالملقط إلى طبق يحتوي على 1 مل من TP Buffer و 10 ميكرولتر من الصابونين (من محلول المخزون ، الخطوة 1.3).
    1. رج المزيج في صفيحة صغيرة بلطف لمدة 30 دقيقة، ثم انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق طازج يحتوي على MR Buffer (1 مل) ورجه بلطف لمدة 10 دقائق. انقل الأنسجة باستخدام الملقط إلى غرفة HRR معايرة.

4. استهلاك الأكسجين وتحديد إنتاج ROS

  1. املأ غرف HRR ب 2.1 مل من MR Buffer ، وأضف Amplex Red (الخطوة 1.4) إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر وبيروكسيديز إلى 2 U / mL ، وأضف العصب الوركي المتخلل (الخطوة 3).
    1. قم بتوصيل مستشعرات التألق الخاصة بالجهاز، وأطفئ الأنوار الموجودة في قسم التحكم في البرنامج، واضغط على الاتصال ب oxygraph. في "تحرير البروتوكولات" في البرنامج، أدخل وزن الأنسجة الذي تم قياسه في الخطوة 3.1.3.
  2. انتقل إلى "التخطيط" ، واختر خيار "التدفق المحدد لكل وحدة عينة" ، وحدد المؤامرات للوصول في وقت واحد إلى قراءة استهلاك الأكسجين ، وإذا رغبت في ذلك ، إنتاجH 2 O2. انتظر ~ 10 دقائق.
    ملاحظة: هذه المرة مطلوبة لتحقيق الاستقرار في التدفق القاعدي لاستهلاك الأكسجين بدون ركيزة مضافة (قاعدية). قبل المزيد من الحقن ، تأكد من استقرار تدفق الأكسجين.
  3. حقن نبضتين من H 2 O2، كل واحدة إلى تركيز نهائي قدره 260 ميكرومتر ، للمعايرة اللاحقة في الغرفة.
  4. حقن 20 ميكرولتر من السكسينات (انظر جدول المواد) ، وهي ركيزة مجمع الميتوكوندريا II ، لتنشيط نظام نقل إلكترونات الميتوكوندريا.
    ملاحظة: يمكن إضافة ركائز الميتوكوندريا المختلفة في هذه المرحلة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة مجمعات مختلفة. تظهر النتائج التمثيلية ذات الركائز المختلفة لمجمعات الميتوكوندريا الأولى والثانية في الشكل 2 والشكل 3. عند هذه النقطة ، لوحظ في الشكل 3 زيادةفي استهلاك O 2وإنتاج H 2 O2 ، في وقت واحد.
  5. أضف 20 ميكرولتر من ثنائي فوسفات الأدينوسين (ADP) لتنشيط تخليق الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP).
    ملاحظة: ADP يحفز تخليق ATP ويقلل من إمكانات الغشاء. ومن المتوقع ملاحظة زيادة في استهلاك O 2 وانخفاض في إنتاج H2O2 26,27.
  6. بالتسلسل ، أضف 5 ميكرولتر من السيتوكروم c (انظر جدول المواد) كمؤشر على سلامة الغشاء.
    ملاحظة: إذا كان النسيج مستعدا جيدا ومتغلغلا ، فيجب ألا يزيد السيتوكروم c من استهلاك الأكسجين بأكثر من 15٪. في حالة حدوث ذلك، راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على توصيات.
  7. معايرة مع أليكوتس من 0.2 ميكروغرام / مل من oligomycin (انظر جدول المواد) حتى لا يلاحظ أي انخفاض آخر في استهلاك O2 .
    ملاحظة: يعمل Oligomycin عن طريق تثبيط تخليق ATP مما يؤدي إلى انخفاض في تدفق O 2 وتعزيز في تكوين H 2 O2الذي يفضله إمكانات الغشاء العالية 26,27.
  8. معايرة مع أليكوتس من 0.5 ميكرومول / لتر من سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) (انظر جدول المواد) ، والميتوكوندريا غير المقترنة ، حتى يصبح من الممكن ملاحظة أي زيادة أخرى في استهلاك O2 . لإنهاء التجربة ، حقن 2 ميكرولتر من antimycin A إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر وانتظر استقرار التدفق.
    ملاحظة: لوحظ انخفاض في إنتاج H 2O2 بسبب تبديد الغشاء المحتمل بعد حقن FCCP. يمنع Antimycin A المركب III ، وبالتالي يمنع تدفق الإلكترونات. لذلك ، فإن استهلاك O 2 المعتمد على الميتوكوندريا ضعيف ، مما يقلل من تدفق الأكسجين لكل كتلة ويحفز تسرب الإلكترون ، مما يزيد من إنتاج H 2 O2 26,27.
  9. انتقل إلى شريط الأوامر ، وابحث عن "متعدد الحواس" في البرنامج ، وانقر فوق التحكم > حفظ الملف وقطع الاتصال.
    ملاحظة: يمكن إجراء إضافة ركائز ومثبطات أخرى وفقا للسؤال قيد الدراسة. يتم وصف مثال في النتائج التمثيلية. يتم إجراءمعايرة H 2 O2 بعد الانتهاء من التجربة ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة28.
  10. افتح الملف المحفوظ وحدد أثر "تدفق الأكسجين لكل كتلة" للحصول على نتائج استهلاك الأكسجين التجريبية. حدد النافذة يدويا بين الحقن بالضغط على زر Shift + الماوس الأيسر.
    1. انتقل إلى Marks > Statistics لتصور النتائج لكل حقنة من الركيزة / المثبطات / البروتوكول غير المقترن. لإنتاج H 2O2 ، قم بإجراء نفس الإجراء باستخدام تتبع "Amp-Slope".
      ملاحظة: عند تحديد النافذة، تجنب القطع الأثرية لحقن الحجم عن طريق اختيار نافذة يكون فيها الأكسجين (أوH 2 O2) أكثر استقرارا وثباتا. يتم تمثيل أمثلة النوافذ المحددة بواسطة أقواس سوداء في النتائج التمثيلية (الشكل 2 والشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تمثيل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا بواسطة العصب الوركي المتخلل في الشكل 2. يمثل التتبع الأحمر تدفق O2 لكل وحدة كتلة في pmol / s.mg. بعد تسجيل استهلاك الأكسجين القاعدي مع الركائز الداخلية (التنفس الروتيني) ، يتم حقن السكسينات (SUCC) لتسجيل التنفس المعقد الثاني (نازعة هيدروجيناز السكسينات) ، مما يؤدي إلى زيادة في معدل استهلاك الأكسجين. في التسلسل ، يتم إضافة تركيز مشبع من ADP ، وتنشيط سينثاز ATP ودفع الفسفرة التأكسدية. هذا يؤدي إلى حالة فسفورية من التنفس الميتوكوندريا. التنفس في الحالة الفسفرية يعني أن ATP synthase يمكن أن ينتج ATP من ADP + Pi (الفوسفات غير العضوي) باستخدام إمكانات الغشاء التي شكلها تدرج البروتون كقوة دافعة للبروتون لتوليد ATP26. مع انخفاض إمكانات الغشاء التي يعززها نشاط سينثاز ATP ، يتم تسريع استهلاك الأكسجين ، ويلاحظ زيادة في تدفق الأكسجين. إن إضافة السيتوكروم الخارجي c (CYTC) لم تشجع سوى الحد الأدنى من تحفيز التنفس ، مما يشهد على سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا لهذا المستحضر. يمكن أن يؤدي تخلل الأنسجة إلى إتلاف سلامة الغشاء وفقدان السيتوكروم c. تشير زيادة معدلات التنفس لأكثر من 10٪ -15٪ إلى الميتوكوندريا التالفة وعدم كفاية إعداد الأنسجة28,29. في هذه النتيجة التمثيلية ، هناك زيادة بنسبة 8.7 ٪ في التنفس ، مما يشير إلى نوعية جيدة من إعداد الأنسجة (الجدول 1). يجب أن يتم المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام oligomycin (OLIGO) بجرعات دنيا لتجنب الوصول إلى تركيز OLIGO الذي يمكن أن يتداخل في تقييم السعة القصوى30. أدى تثبيط سينثاز ATP بواسطة OLIGO - أو تنفس الحالة 4 بواسطة oligomycin26 - إلى انخفاض تدفق استهلاك الأكسجين. تعمل المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام FCCP ، وهو كاشف غير مقترن للميتوكوندريا ، على تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، مما يحفز تدفق التنفس ويعرض السعة القصوى لنقل الإلكترون (السعة القصوى ETS). في نهاية التجربة ، يتم حقن antimycin A (AA) ، وهو مثبط للمجمع III ، لمنع التنفس الميتوكوندريا وتسجيل استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا (التنفس المتبقي) (الشكل 2). يتم حساب تدفقات الأكسجين المطلقة المسجلة في هذه التجربة التمثيلية في الجدول 1.

تعد إمكانية تحليل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا في وقت واحد مع إنتاج الأكسجين التفاعلي (ROS) - الذي يتم تحديده عن طريق اكتشاف بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) بواسطة Amplex Red باستخدام مستشعرات التألق - ميزة كبيرة لتحديد ملف تعريف الطاقة الحيوية وأداة قياسية للكشف عن خلل الميتوكوندريا في الأمراض المتنوعة. إضافة ركائز مختلفة لمجمعات مختلفة لتغذية ETS الميتوكوندريا يمكن أن تسفر أيضا عن مزيد من المعلومات حول المواقع المحددة لخلل الميتوكوندريا. ويبين الشكل 3 مع القياس المتزامن لاستهلاك الأكسجين (الشكل 3 ألف) وإنتاج ROS (الشكل 3 باء) في وجود ركائز مختلفة توفر الوقود لنظام ETS. بعد تسجيل التنفس القاعدي ، يضاف البيروفات + مالات (PM) إلى الغرفة كركيزة لمجمع الميتوكوندريا I ، مما يزيد من تدفق استهلاك الأكسجين. كما أن إضافة SUCC ، ركيزة المركب II ، تزيد أيضا من التنفس ، ولكن إضافة المزيد من بالميتويل كارنيتين (PC) لا تزيد من تدفق الأكسجين مقارنة بإضافات الركيزة السابقة ، مما يشير إلى أن PM و SUCC ربما يكون قد تشبع بالفعل موقع يوبيكينون الميتوكوندريا أو نقص أكسدة الأحماض الدهنية. كما هو متوقع ، يزداد إنتاج ROS أيضا بعد إضافة ركائز ، تمثل تسرب الأكسجين الذي يهرب من ETS ويشكل ROS (الشكل 3B ، التتبع الأخضر). تؤدي إضافة ADP في التركيز المشبع إلى زيادة استهلاك الأكسجين ، مما يؤدي إلى تكوين ATP (التتبع الأحمر في الشكل 3A) وتقليل إنتاج ROS (الشكل 3B ، التتبع الأخضر). إضافة CYTC يزيد فقط من تدفق الأكسجين بنسبة 6.8 ٪ ، مما يؤكد سلامة غشاء الميتوكوندريا. تقلل المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام OLIGO من تدفق استهلاك الأكسجين (التتبع الأحمر في الشكل 3A) وتزيد من إنتاج ROS (التتبع الأخضر في الشكل 3B). تشير تأثيرات ADP و OLIGO إلى أن العصب الوركي المتخلل في هذا البروتوكول يمكن أن يكرر العلاقة القياسية في فسيولوجيا الميتوكوندريا ، حيث تؤدي الزيادة في استهلاك الأكسجين إلى انخفاض في إمكانات الغشاء ويمنع إنتاج ROS31,32.

إضافة FCCP ، كما هو متوقع لغير المقترن ، يزيد من استهلاك الأكسجين إلى أقصى معدل له ، ونتيجة لتبديد الغشاء المحتمل ، يتم تقليل إنتاج ROS. إن إضافة الروتينون ، وهو مثبط للمركب I و AA ، يقلل من استهلاك الأكسجين ويزيد من تكوين ROS (الشكل 3A ، B) ، مما يؤكد أنه يتم الحفاظ على فسيولوجيا الميتوكوندريا وملف تعريف الطاقة الحيوية في العصب الوركي المتغلغل. يتم حساب القيم المطلقة لتدفقات الأكسجين المسجلة في هذه التجربة في الجدول 2.

Figure 1
الشكل 1: تحضير العصب الوركي لنفاذية الميتوكوندريا. يجب تنفيذ جميع الإجراءات على الجليد. (أ) يتم استخراج العصب الوركي من فأر قتل رحيم ووضعه في طبق بتري يحتوي على مخزن مؤقت لحفظ الأنسجة عند 4 درجات مئوية. (ب) فصل حزم الأعصاب الوركية مع الملقط. (ج، د) يكون النسيج جاهزا عندما يتم تشريحه إلى خصلات شفافة ، بدلا من البنية الأنبوبية البيضاء الأصلية غير الشفافة (A). شريط المقياس = 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: نتيجة تمثيلية لاستهلاك أكسجين الميتوكوندريا في العصب الوركي المتخلل للفأر. التجربة هي أثر تمثيلي لمستخلص عصب وركي واحد من فأر تم قتله رحيما. كان العصب الوركي يتخلل من قبل ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يشار إلى الحقن كسهام في أوقات محددة. SUCC: سكسينات. ADP: الأدينوسين ثنائي الفوسفات. Cyt c: السيتوكروم c; أوليغو: أوليغومايسين. FCCP: سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيرازون. AA: antimycin A. يظهر تركيز الأكسجين في الوقت الفعلي ك [nmol / mL] (التتبع الأزرق) ومعدل استهلاك الأكسجين كتدفق لكل وحدة كتلة [pmol / (s.mg)] (أثر أحمر). تمثل الأقواس السوداء نوافذ معدلات استهلاك الأكسجين المحددة للنتائج بعد كل حقنة. القاعدية تشير إلى التنفس مع عدم وجود ركائز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتيجة استهلاك أكسجين الميتوكوندريا إلى جانب إنتاج ROS في العصب الوركي للفأر المتغلغل. يظهر أثر تمثيلي لمستخلص العصب الوركي من فأر تم قتله رحيما. كان العصب الوركي يتخلل من قبل ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يشار إلى الحقن كسهام في أوقات محددة. H2O2: بيروكسيد الهيدروجين. PM: بيروفات / مالات. SUCC: سكسينات. PC: بالميتويل كارنيتين. ADP: الأدينوسين ثنائي الفوسفات. Cyt c: السيتوكروم c; أوليغو: أوليغومايسين. FCCP: سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيرازون. ROT: روتينون. AA: antimycin A. (A) يظهر تركيز الأكسجين في الوقت الفعلي ك [nmol / mL] (تتبع أزرق) ومعدل استهلاك الأكسجين كتدفق لكل وحدة كتلة [O2 pmol / (s.mg)] (أثر أحمر). (ب) يظهر إنتاج ROS على أنه تألق H 2 O 2 (أثر أرجواني) ومنحدر إنتاج H2O2 [pmol / (s.mg)] (أثر أخضر) ، بعد المعايرة. تمثل الأقواس السوداء نوافذ معدلات استهلاك الأكسجين المحددة للنتائج بعد كل حقنة. القاعدية تشير إلى التنفس مع عدم وجود ركائز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ركائز الاضافات معدل استهلاك الأكسجين
التدفق لكل كتلة (pmol / [s.mg])
القاعدية (بدون إضافة) اي 5.9
سكسينات (SUCC) إضافة واحدة من 10 mM 16.9
شرطة أبوظبي إضافة واحدة من 1 ميكرومتر 28.5
السيتوكروم ج (CYTC) إضافة واحدة من 10 ميكرومتر 31
أوليغوميسين أ (أوليغو) المعايرة بالتحليل الحجمي مع إضافات 0.2 ميكروغرام / مل 21.9
FCCP المعايرة بالتحليل الحجمي مع إضافات 0.5 ميكرومتر 31.1
أنتيميسين أ (AA) إضافة واحدة من 5 ميكرومتر 11.3

الجدول 1: بروتوكول الركائز / غير المقترن / المثبطات / المعايرة بالتحليل الحجمي (SUIT) ونتائج معدلات استهلاك الأكسجين في العصب الوركي المتخلل للفأر. يتم تمثيل استهلاك الأكسجين في [O2pmol / (s.mg)] ، بعد كل إضافة لبروتوكول SUIT. يتم الحصول على النتائج من خلال متوسط النوافذ المحددة المحددة في الشكل 2.

ركائز الاضافات استهلاك الأكسجين (O2 pmol / [s.mg]) إنتاج ROS (H 2O2 pmol / [s.mg])
القاعدية (بدون إضافة) اي 5.77 0.53
بيروفات + مالات (PM) نبضة واحدة من 5 mM + 2.5 mM 7.17 0.58
سكسينات (SUCC) إضافة واحدة من 10 mM 14.06 0.75
بالميتويل كارنيتين (PC) نبضتان من 25 ميكرومتر 14.68 0.79
شرطة أبوظبي إضافة واحدة من 1 ميكرومتر 22.9 0.25
السيتوكروم ج (CYTC) إضافة واحدة من 10 ميكرومتر 24.36 0.09
أوليغوميسين أ (أوليغو) المعايرة بالتحليل الحجمي مع إضافات 0.2 ميكروغرام / مل 17.03 0.5
FCCP المعايرة بالتحليل الحجمي مع إضافات 0.5 ميكرومتر 23.98 0.16
روتينون (ROT) إضافة واحدة من 1μM 19.75 0.48
أنتيميسين أ (AA) إضافة واحدة من 5 ميكرومتر 4.08 0.53

الجدول 2: بروتوكول الركائز / غير المقترن / المثبطات / المعايرة بالتحليل الحجمي (SUIT) ونتائج إنتاج ROS إلى جانب معدلات استهلاك الأكسجين في العصب الوركي المتخلل للماوس. يتم تمثيل استهلاك الأكسجين في [O 2 pmol / (s.mg)] وإنتاج ROS بواسطة [H 2 O2pmol / (s.mg)] بعد كل إضافة لبروتوكول SUIT. يتم الحصول على النتائج من خلال متوسط النوافذ المحددة المحددة في الشكل 3.

معلمات لوظيفة الميتوكوندريا حسابات من معدلات استهلاك الأكسجين
التنفس القاعدي التنفس القاعدي (تدفق بدون إضافة ركائز)28
استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX) [التدفق بعد إضافة AA] 28
مجمع I تسرب التنفس [التدفق بعد إضافة PM] – [ROX]28,37
مجمع II تسرب التنفس [التدفق بعد إضافة SUCC] – [ROX]28,37
الحالة الفسفرية (قدرة أوكسفوس) [التدفق بعد إضافة ADP] – [ROX]28,43
الحالة غير الفسفرية (تنفس التسرب) [التدفق بعد إضافة الأوليغومايسين] – [ROX]28
نسبة التحكم في الجهاز التنفسي [الحالة الفسفرية / غير الفوسفوريلية] 28,43
سعة ETS [التدفق بعد إضافة FCCP] – [ROX]28,37

الجدول 3: حساب المعلمات لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي المتخلل للفأر. معلمات صيغة تقييم فسيولوجيا الميتوكوندريا حسب معدلات استهلاك الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العديد من الأمراض أو الحالات المصاحبة للاعتلالات العصبية لديها خلل وظيفي في الميتوكوندريا كعامل خطر. يعد تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية أمرا ضروريا لتوضيح كيفية عمل الميتوكوندريا في هذه الحالات التنكسية العصبية. تقييم وظيفة الميتوكوندريا شاق بسبب صعوبة طريقة العزل وندرة المواد. وبالتالي ، فإن تطوير تقنيات نفاذية الأنسجة التي لا تتطلب عزل الميتوكوندريا أمر ضروري.

لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة المتخلل ، يعد اختيار مادة كيميائية يمكنها اختراق غشاء بلازما الخلية دون التدخل في تنفس الخلية أمرا بالغ الأهمية. في الأعصاب الطرفية مثل العصب الوركي ، تكوين المايلين حوالي 70 ٪ من الدهون ، ومعظمها من الكوليسترول33،34. يؤدي اختيار العوامل المتخلل مثل الصابونين والديجيتونين التي تتفاعل مع جزيئات الكوليسترول إلى مسام تسمح بوصول الركيزة إلى آلات الميتوكوندريا دون التدخل في المقصورات الخلوية الأخرى35,36. في هذا البروتوكول ، يتم تكييف الطريقة الراسخة لنفاذية الألياف العضلية بواسطة الصابونين التي وصفها Pesta و Gnaiger24 للأعصاب الوركية. يتضمن إجراء النفاذية خطوة حاسمة أخرى فيما يتعلق بفصل الأنسجة للسماح بالوصول إلى الركائز كما هو مطلوب لتسجيل معلمات الميتوكوندريا ذات الأهمية. يصف هذا العمل الخطوات ، ويتم توفير الرسوم التوضيحية لفصل الأنسجة بشكل مرض في الشكل 1.

تعد سجلات معدلات التنفس في الميتوكوندريا ضرورية لتحديد الاختلافات المتعلقة بخلل مجمعات الميتوكوندريا أو اضطراب الفسفرة التأكسدية أو الميتوكوندريا المعطلة. يتم تعريف أمراض الجهاز التنفسي ومعلمات الميتوكوندريا بواسطة Chance و Williams26. في هذه المقالة ، يتم تعريف التنفس الروتيني على أنه التنفس القاعدي عندما يتم تسجيل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا دون إضافة ركائز خارجية المنشأ. قدرة المجمعات - عندما تضاف ركائز للمجمع الأول أو الثاني لاستهلاك أكسجين الميتوكوندريا ، وتسمى أيضا باسم تنفس التسرب ؛ الحالة الفسفرية - عندما تتم إضافة ADP في تسلسل ركائز المجمعات ويدفع تخليق ATP ؛ الحالة غير الفسفرية - عندما يتم تشكيل كل ADP في ATP أو مع إضافة مثبط synthase ATP ، oligomycin (أو الحالة 4) ؛ السعة القصوى ل ETS - عند إضافة FCCP غير المقترن بالميتوكوندريا و ؛ استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX) بعد إضافة الروتينون ومضاد المايسين A - عندما لا يرتبط استهلاك الأكسجين بالميتوكوندريا. تسمح التقنية الموصوفة في هذا العمل لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة العصبية الوركية بواسطة HRR بتحديد العديد من حالات الجهاز التنفسي وحساب وظيفة الميتوكوندريا الداخلية داخل نفس العينة. يمكن استخدام نتائج اختبار بروتوكول الركيزة / غير المقترنة / المثبطات لاشتقاق معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن من خلالها حساب نسب / عوامل التحكم في الجهاز التنفسي37 ، كما هو موضح في الجدول 3. يجمع تقييم هذه المعلمات بين معدلات التسرب المطلقة ، إلى جانب التنفس الأقصى للميتوكوندريا ، ويرفع البيانات للحصول على قيمة تشخيصية24،35،36،37،38،39.

على الرغم من أن خلل الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية مذكور في الأدبيات ، إلا أن هناك قيودا في إظهار هذه المعلمات. في نموذج الاعتلال العصبي الناجم عن العلاج الكيميائي ، لوحظ انخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا في العلاج بعامل العلاج الكيميائي ، أوكسالي بلاتين ، وانخفاض في النشاط المختبري للمجمعات الأول والثاني والثالث في المحاور الحسية للعصب المحيطي (العصب الصفني) 40,41. ومع ذلك ، هناك نقص في المعلومات حول التحكم الذي تمارسه إمكانات الغشاء على أنشطة المجمعات وتشكيل ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية ، وهي معلمة أساسية في تقييم وظيفة الميتوكوندريا. أيضا ، في الأعصاب الوركية المنفصلة عن فئران Sprague-Dawley المتخلل مع الديجيتونين ، يتم إثبات تسجيل استهلاك الأكسجين فقط للحالة المفسفرة ، ولكن لا تتم مقارنته باستهلاك الأكسجين في وجود مثبط ATPase أو غير مقترن22. في الطريقة الحالية ، من الممكن حساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي في العصب المتخلل (الجدول 3) مقارنة بنسبة التحكم في الجهاز التنفسي للميتوكوندريا المعزولة ، وعادة ما يتم حسابها من الحالة 3 / الحالة 4 (أو الحالات الفوسفورية / غير الفسفرية). باستخدام الطريقة المقدمة في هذا العمل ، من الممكن تقييم القدرات المعقدة I و II - الحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا - ونسب التحكم في التدفق ، وتحقيق أقصى قدر من التنفس واستهلاك الأكسجين المتبقي.

يتم وصف طرق مختلفة لنفاذية العصب الوركي لتقييم استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا في الأدبيات. يتم إثبات تقنية لنفاذية العصب الوركي في بروتوكول مع علاج الصابونين والنفاذية بواسطة نبض الدوامة. ومع ذلك ، تم إثبات الحالة الفسفرية والقدرة القصوى فقط41. بالإضافة إلى ذلك ، بمقارنة القيم المعروضة هنا لنفس المعلمات ، فإن تدفق الأكسجين الذي لاحظه كوبر وآخرون.41 أقل بنسبة 70٪ ، مما يدل على وجود تلف في غشاء الميتوكوندريا يتعلق بطريقة الإثارة. في هذا البروتوكول ، يحافظ فصل الأنسجة على سلامة غشاء الميتوكوندريا ، وهو ما تؤكده الزيادة الصغيرة في تدفق الأكسجين بعد إضافة السيتوكروم c. هذه ميزة تسمح بتسجيل جميع معلمات الميتوكوندريا ، مما يوفر سجلا كاملا لفسفرة الميتوكوندريا المؤكسدة ووظيفتها. على الرغم من أنه في طريقة نفاذية العصب الوركي مع الكولاجيناز ، فإن قيم تدفق الأكسجين قابلة للمقارنة مع تلك المعروضة هنا ، إلا أنه لوحظ زيادة بنسبة 20٪ تقريبا بعد إضافة السيتوكروم c ، مما يشير إلى مستوى معين من تلف غشاء الميتوكوندريا21. مع البروتوكول الموضح في هذه المقالة ، لوحظت زيادة بنسبة 6.3٪ -8.7٪ فقط من تدفق الأكسجين بعد إضافة السيتوكروم ج ، مما يؤكد ميزة الطريقة الحالية في الحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا وتحسين تسجيل استهلاك الأكسجين.

الميتوكوندريا هي الموقع الرئيسي لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) المرتبطة بعمليات الإشارات المتنوعة في الأنسجة العصبية الوركية والآليات المتعلقة بالفيزيولوجيا المرضية في الاعتلالات العصبية42,43. جعل هذا البروتوكول من الممكن الوصول إلى توليد بيروكسيد الهيدروجين باستخدام مستشعر التألق في وقت واحد مع استهلاك الأكسجين. وكما لوحظ في الشكل 3، فإن إنتاج ROS حساس للتغيرات في حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا، مما يؤكد حالة سلامة الميتوكوندريا ويحسن تسجيل وظيفة الميتوكوندريا.

يمكن لطرق أخرى مثل محلل التدفق خارج الخلية (EFA) ، استنادا إلى أجهزة استشعار التألق لتسجيل استهلاك الأكسجين ، تقييم وظيفة الميتوكوندريا العصبية الطرفية في الخلايا المستزرعة - مثل خلايا شوان أو المحاور العصبية - في جهاز فحص آلي عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، هناك بعض المزايا في استخدام أجهزة الاستشعار القطبية مثل HRR ، بما في ذلك على وجه الخصوص القدرة على متابعة التجربة في الوقت الفعلي ، لإجراء حقن متعددة من الركائز / المثبطات ؛ وبالتالي ، فإن هذا يسمح بتقييم عدد أكبر من الوظائف المعقدة في الميتوكوندريا في تجربة واحدة ، وانخفاض تكلفة المواد الاستهلاكية24،35،38،39. ومن عيوب استخدام HRR مقارنة ب EFA عدم وجود جهاز استشعار لتحمض الوسائط (لتحليل التدفق المحلل للسكر) والقدرة المحدودة على سير العمل ، والتي تسمح باستخدام عينتين فقط في وقت واحد.

القيود المفروضة على تقنيات نفاذية الأنسجة المطلوبة ل HRR معروفة جيدا. وهي تشمل عدم القدرة على تقييم الميتوكوندريا عندما يكون ADP محدودا وانخفاض معدل التنفس غير المقترن مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة. ومع ذلك ، فإن بروتوكول نفاذية العصب الوركي الصابونين الموصوف هنا - كتكييف لبروتوكول نفاذية الألياف العضلية بواسطة Pesta و Gnaiger24 - يسمح بتقييم حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ومعلمات الميتوكوندريا دون الإضرار بسلامة الميتوكوندريا. كما يسمح بتسجيل استهلاك الأكسجين وإنتاج ROS في وقت واحد في العصب الوركي ، وهو نسيج له قيود سيئة السمعة لعزل الميتوكوندريا. وبالتالي ، يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييم أفضل لوظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية ويمكن أن يوفر مزايا للباحثين في التحقيق في أدوار الميتوكوندريا في الحالات الفسيولوجية المرضية التي تصيب الأعصاب الطرفية.

استكشاف الاخطاء
إذا كانت هناك زيادة في استهلاك O2 بعد إضافة السيتوكروم c إلى أكثر من 15٪ من تدفق استهلاك الأكسجين ، فهذا يشير إلى أن إجراء النفاذية كان قويا جدا وتسبب في تلف بنية الميتوكوندريا. إذا كان الأمر كذلك ، فتجاهل التشريح وأعد تشغيله بفصل عصبي ألطف وكرر الخطوات. إذا كانت بعض الكواشف التي يتم حقنها لا تظهر التأثير المتوقع في استهلاك أكسجين الميتوكوندرياأو إنتاج H 2 O2 ، فمن المحتمل أن يكون ذلك بسبب تلوث الغرفة بمثبطات الميتوكوندريا. في هذه الحالة ، يمكن اتخاذ إجراءين: (1) إعادة تشغيل التجربة بعد غسل الغرف والمحاقن (الخطوة 2.1) أو (2) إضافة عينة من أي ميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة أو تجانس قبل تنفيذ الخطوة 2.1. سوف تمتص إضافات هذه العينات مثبطات الميتوكوندريا وتحسن خطوة التنظيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد مول هذه الدراسة كل من المعهد السريبيليهيرا، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في ريو دي جانيرو، والمجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، وتنسيقية الأعمال الصديقة للفيزياء في نيفيل العليا - البرازيل. نحن ممتنون للدكتور أنطونيو غالينا فيلهو والدكتورة مونيكا مونتيرو لوميلي والدكتور كلاوديو ماسودا على الدعم مع مرافق المختبر ، والدكتورة مارثا سورنسون على التعليقات اللطيفة والقيمة في تحسين المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 183 ،
تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira,… More

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter