Summary
형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.
Abstract
말초 신경의 미토콘드리아 기능 장애는 말초 신경 병증과 관련된 여러 질병을 동반하며,자가 면역 질환, 당뇨병, 감염, 유전 장애 및 종양을 포함한 여러 원인에 의해 유발 될 수 있습니다. 마우스 말초 신경에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 작은 표본 크기, 조직에 존재하는 제한된 수의 미토콘드리아, 및 미엘린 외피의 존재로 인해 어려울 수 있습니다. 이 연구에 설명 된 기술은 근육 섬유에 사용되는 것으로부터 적응 된 독특한 투과 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아를 조직으로부터 분리하는 대신 좌골 신경 미토콘드리아 기능을 평가함으로써 이러한 도전을 최소화합니다. Amplex Red/Peroxidase로 플루오르 반응성 종 생산을 측정하고 사포닌 투과 신경에서 다른 미토콘드리아 기질과 억제제를 비교함으로써 미토콘드리아 호흡 상태, 반응성 산소 종 (ROS) 및 미토콘드리아 복합체의 활성을 동시에 감지 할 수있었습니다. 따라서, 여기에 제시된 방법은 다른 기술에 의한 미토콘드리아 기능의 평가와 비교하여 이점을 제공한다.
Introduction
미토콘드리아는 세포 생존력을 유지하고 에너지 대사 (포도당, 아미노산, 지질 및 뉴클레오티드 대사 경로)와 같은 수많은 세포 기능을 수행하는 데 필수적입니다. 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 주요 부위로서, 미토콘드리아는 아폽토시스와 같은 여러 세포 신호 전달 과정에서 중심이며 철 - 황 (Fe-S) 클러스터의 합성, 미토콘드리아 단백질 수입 및 성숙, 게놈 및 리보솜 1,2,3의 유지에 참여합니다. 미토콘드리아 막 역학 네트워크는 융합 및 분열 과정에 의해 제어되며, 품질 관리 및 미토파지 4,5,6 용 기계도 갖추고 있습니다.
미토콘드리아 기능 장애는 암, 당뇨병 및 비만과 같은 여러 병리학 적 상태의 출현과 관련이 있습니다7. 미토콘드리아 기능의 교란은 알츠하이머 병 8,9, 파킨슨 병10,11, 근위축성 측삭 경화증 12,13 및 헌팅턴 병 14,15에서와 같이 중추 신경계에 영향을 미치는 신경 퇴행성 장애에서 발견됩니다. . 말초 신경계에서, 축색돌기에서의 미토콘드리아 기능의 상실은 길랑-바레 증후군16,17과 같은 면역 신경병증에서 관찰되고, 축색돌기에서의 높은 미토콘드리아 ROS 생산과 관련하여, 이러한 사건은 슈완 세포18에서 MAP 키나제 활성화를 유도한다. 이것은 미토콘드리아 생리학이 부위 특이적 세포뿐만 아니라 전체 조직에 필수적 일 수 있음을 보여줍니다. HIV-관련 원위 감각 다발성 신경병증 (HIV-DSP)에서, 미토콘드리아는 전사의 트랜스-활성화제 (HIV-TAT) 단백질이 HIV가 효율적으로 복제할 수 있게 하는 기작에서 역할을 할 뿐만 아니라, HIV 감염 병인에서 몇 가지 다른 역할도한다 19,20.
좌골 신경 미토콘드리아 생리학의 평가는 신경병증 7,21,22를 조사하기 위한 필수적인 표적으로서 등장하였다. 당뇨병성 신경병증에서, 프로테오믹 및 대사체 분석은 당뇨병의 대부분의 분자 변화가 좌골 신경 미토콘드리아 산화 인산화 및 지질 대사에 영향을 미친다는 것을 시사한다7. 이러한 변화는 또한 비만으로 인한 당뇨병21의 초기 징후 인 것으로 보입니다. 화학요법-유도된 통증성 신경병증의 마우스 모델에서, 좌골 신경의 미토콘드리아 손상은 산화적 인산화(22)의 감소, 및 미토콘드리아 복합체 활성, 막 전위, 및 ATP 함량(23)의 감소로서 검출된다. 그러나 여러 그룹이 신경 병증에서 미토콘드리아 기능 장애를 언급했지만, 이러한 연구는 미토콘드리아 막의 보존이없는 미토콘드리아 복합체에서의 활성 측정으로 제한되며, 미토콘드리아 무결성에 대한 평가가 부족하거나 미토콘드리아 ATP 생산을위한 매개 변수로서 ATP 함량의 측정이 부족합니다. 일반적으로 미토콘드리아 산소 소비량과 ROS 생산에 대한 적절한 평가는 퍼콜/수크로오스 구배에서 차등 원심분리에 의한 미토콘드리아의 분리를 필요로 합니다. 미토콘드리아의 분리는 또한 다량의 조직이 필요하고 미토콘드리아의 손실 및 파괴로 인해 좌골 신경 조직에 대한 제한 요소가 될 수 있습니다.
본 연구는 좌골 신경에서 미토콘드리아 산소 소비 및 ROS 생산으로 미토콘드리아 생리학을 측정하여 미토콘드리아 막을 보존하고 미토콘드리아를 분리 할 필요없이 미토콘드리아 생리학을 측정하는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 프로토콜은 고분해능 호흡측정법(HRR)에 의해 투과된 근섬유(24 )에서의 산소 소비 측정으로부터 적응된다. 이 절차의 장점은 좌골 신경과 같은 소량의 조직에서 미토콘드리아를 평가하고 현장에서 미토콘드 리아 매개 변수를 평가하여 미토콘드리아 환경, 구조 및 생물 에너지 프로파일을 보존하여 생리적으로 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 미토콘드리아 호흡 상태는 좌골 신경 투과 후 기질 및 억제제로 결정되어 미토콘드리아 막 완전성에 대한 미토콘드리아 생물 에너지 및 시토크롬 c 계수를 적절하게 평가하여 미토콘드리아 전자 수송 시스템 (ETS) 평가 및 필수 매개 변수 계산의 단계에 대한 가이드를 제공했습니다. 이 연구는 좌골 신경 대사가 수반되는 병리 생리학 적 메커니즘의 질문에 대답하기위한 도구를 제공 할 수 있습니다 (예 : 말초 신경 병증).
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Protocol
본 프로토콜은 연구에서 동물 사용에 관한 윤리위원회, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 의해 승인되었습니다. 좌골 신경은 4 개월 된 수컷 C57BL / 6 마우스에서 분리되며, 기관 지침에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. 프로토콜 단계는 미토콘드리아 악화를 피하기 위해 최적화되어 있습니다. 따라서, 이 프로토콜에서, 편광 산소 센서의 교정은 마우스 좌골 신경 조직 해부 및 투과화 이전에 수행되었다.
1. 시약의 제조
- 조직 보존 버퍼(TP 버퍼)를 준비합니다.
- 초순수 용액에서 다음 시약을 준비한다: 0.1 μM의 유리 칼슘을 갖는 10 mM의 Ca-EGTA 완충액, 20 mM의 이미다졸, 20 mM의 타우린, 50 mM의 K-MES, 0.5 mM의 DTT, 6.56 mM의MgCl2, 5.77 mM의 ATP, 15 mM의 포스포크레아틴( 물질표 참조), pH 7.1. -20°C에서 보관하십시오.
- 미토콘드리아 호흡 완충액(MR 완충액)을 준비한다.
- 초순수 용액에서 다음 시약을 준비한다: 0.5 mM의 K2 EGTA, 3 mM의MgCl2, 60 mM의 MES, 20 mM의 타우린, 10 mM의 KH2PO4, 20 mM의 HEPES, 110 mM의 D-수크로스, 1 mg/mL의 BSA (무지방산) (물질 표 참조), pH 7.4. -20°C에서 보관한다.
- 사포닌 5mg( 물질표 참조)을 TP 버퍼 1mL에 용해시켜 사포닌 원액을 준비하고(단계 1.1) 얼음 위에 보관한다. 사포닌은 신선하게 준비됩니다.
- Amplex Red 분말( 표 참조)을 DMSO로 재현탁시켜 2 mM의 스톡 농도를 얻고 빛으로부터 보호된 바이알에 -20°C에서 보관하여 제조한다.
참고: 동결 및 해동으로 프로브가 마모되지 않도록 하려면6개월 이상 보관하기 위한 작은 분취량을 25개월 이상 만들지 마십시오.
2. 고해상도 호흡 측정(HRR)을 위한 편광 산소 센서의 교정
- 기기와 주사기의 HRR 챔버를 청소 하십시오 (재료 표 참조).
- HRR 챔버를 열고 상단까지 증류수로 채우고 5 분 동안 3x를 저어줍니다. 에탄올로 반복 한 다음 다시 물로 반복하십시오. 마개와 주사기를 물 / 에탄올 / 물로 각각 3 배로 씻으십시오.
- HRR 소프트웨어에 다음 교정 설정을 적용 합니다(자료 표 참조).
- HRR 소프트웨어 제어에서 실험 온도(37°C), 산소 센서(게인, 2; 분극 전압, 800mV) 및 앰페로메트릭 센서(게인, 1000; 분극 전압, 100mV)에 대한 파라미터를 추가합니다.
- 산소 센서를 보정합니다.
- 2.1 mL의 MR 버퍼(단계 1.2)를 각 챔버에 피펫한다. 마개로 닫고 거품이 형성 될 때까지 챔버로 공기를 끌어들입니다. 질량당 산소 플럭스가 안정될 때까지 교정 모드에서 37°C에서 1시간 동안 저어준다.
- 제조업체의 프로토콜24에 따라 소프트웨어에서 편광 산소 센서의 공기 교정을 수행합니다.
참고: 교정 단계는 실험 전에 한 번만 수행됩니다. 동일한 호흡 매체 및 온도에서 추가적인 실험은 단지 챔버 세척 후에 수행될 수 있다(단계 2.1).
3. 좌골 신경의 해부와 투과
- 아래 단계에 따라 좌골 신경을 제거하십시오.
- 새장에서 제거한 후 자궁 경부 탈구로 동물을 안락사시키고 벤치에서 휴식을 취하도록 부드럽게 억제하십시오.
- 안락사 된 동물에서는 척추 근처에서 시작하여 허벅지를 발쪽으로 진행하면서 허리에 가위로 절개하십시오. 신경에 붙어있는 피부와 근육을 제거한 다음 좌골 신경 전체를 잘라내어 제거하십시오.
- 조직을 즉시 계량하고 차가운 TB 버퍼 (4°C)로 채워진 바이알에 넣습니다. 얼음 위에서 3.2-3.3단계를 수행합니다.
참고: 젖은 조직 무게는 다음 단계에서 산소 소비 및 ROS 생산 흐름을 정상화하는 데 사용됩니다. 조직을 즉시 칭량할 수 없는 경우 차가운 TB 버퍼에 보관하십시오. 이 절차는 신선한 조직에서 수행되며 미토콘드리아 손상을 피하기 위해 냉동해서는 안됩니다.
- 조직 준비를 위해, 좌골 신경을 충분한 TP 버퍼가 있는 페트리 접시에 넣어 덮으십시오. 포셉으로 신경의 한쪽 끝을 잡고 다른 포셉으로 신경 번들을 수평으로 당겨 내십시오.
참고 :이 절차는 조직 악화를 피하기 위해 10 분 이내에 수행해야합니다. 조직은 이전의 흰색 불투명 조직과 반대되는 투명한 안개 층으로 시각화 될 수있을 때 준비됩니다 (그림 1). - 먼저, 재생 된 조직을 조직 투과를 위해 TP 버퍼 1 mL가 들어있는 작은 접시에 옮깁니다. 투과를 시작하려면, 포셉으로 조직을 TP 버퍼 1mL와 사포닌 10μL를 함유하는 접시로 옮긴다(원액으로부터, 단계 1.3).
- 마이크로플레이트 쉐이커에서 30분 동안 부드럽게 흔들고, 포셉으로 조직을 MR 버퍼(1mL)가 들어있는 신선한 접시로 옮기고 10분 동안 부드럽게 흔들어 준다. 포셉으로 조직을 교정된 HRR 챔버로 옮깁니다.
4. 산소 소비 및 ROS 생산 결정
- HRR 챔버를 2.1mL의 MR 버퍼로 채우고, Amplex Red(단계 1.4)를 최종 농도 5μM에, 퍼옥시다제를 2U/mL로 추가하고, 투과화된 좌골 신경을 추가합니다(단계 3).
- 계측기의 형광 센서를 부착하고 소프트웨어의 제어 부분에 있는 조명을 끄고 연결을 눌러 산소 촬영에 연결합니다. 소프트웨어의 "편집 프로토콜"에서 3.1.3 단계에서 측정 된 조직 무게를 삽입하십시오.
- "레이아웃"으로 이동하여 "단위 샘플 당 특정 플럭스"옵션을 선택하고 플롯을 선택하여 산소 소비 판독 값에 동시에 액세스하고 원하는 경우H2O2생산에 액세스하십시오. ~ 10 분 정도 기다리십시오.
참고 :이 시간은 추가 된 기질 (기저)없이 산소 소비의 기저 흐름을 안정화시키는 데 필요합니다. 추가 주사 전에 산소 흐름이 안정화되었는지 확인하십시오. - H2O2의 두 펄스를 각각260 μM의 최종 농도로 주입하여 챔버에서 나중에 교정하십시오.
- 미토콘드리아 복합체 II 기질인 숙시네이트 20μL( 표 참조)를 주입하여 미토콘드리아 전자 수송 시스템을 활성화시킨다.
참고: 이 시점에서 다른 미토콘드리아 기질을 추가하여 다른 복합체에 의한 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있습니다. 미토콘드리아 복합체 I 및 II에 대해 다양한 기질을 사용한 대표적인 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다. 이 시점에서, O2 소비와 H2O2 생산의 증가는 동시에 도 3에서 관찰된다. - 20μL의 아데노신 디포스페이트(ADP)를 첨가하여 아데노신 트리포스페이트(ATP) 합성을 활성화시킨다.
참고: ADP는 ATP 합성을 자극하고 막 전위를 감소시킵니다. O2 소비의 증가 및H2O2의 생산의 감소는26,27로 관찰될 것으로 예상된다. - 순차적으로, 막 완전성의 지표로서 5 μL의 시토크롬 c ( 물질의 표 참조)를 첨가한다.
참고: 조직이 잘 준비되고 투과되면 시토크롬 c는 산소 소비를 15% 이상 증가시키지 않아야 합니다. 이 경우 문제 해결 섹션에서 권장 사항을 확인하십시오. - O2 소비의 더 이상의 감소가 관찰되지 않을 때까지 0.2 μg/mL의 올리고마이신 분취량으로 적정한다(물질 표 참조).
참고: 올리고마이신은 ATP 합성을 억제하여O2 유동의 감소와 높은 막 전위26,27에 의해 선호되는H2O2 형성의 향상으로 이어짐으로써 작용한다. - 0.5 μmol/L의 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)의 분취량으로 적정하고, 미토콘드리아 언커플러는,O2 소비의 더 이상의 증가를 관찰할 수 없을 때까지이다. 실험을 끝내기 위해, 2 μl의 안티마이신 A를 최종 농도 5 μM로 주입하고 유동 안정화를 기다린다.
참고:H2O2생산의 감소는 FCCP 주입 후 막 전위 소산으로 인해 관찰됩니다. 안티마이신 A는 콤플렉스 III을 억제하여, 전자의 흐름을 방지한다. 따라서, 미토콘드리아 의존성 O2 소비가 손상되어, 질량당 산소 플럭스가 감소하고 전자 누출이 자극되어,H2O2생산량이 26,27 증가한다. - 명령 모음으로 이동하여 소프트웨어에서 "다중 감각"을 검색하고 제어 > 파일 저장 및 연결 끊기를 클릭하십시오.
참고 : 다른 기질과 억제제의 첨가는 연구중인 질문에 따라 수행 할 수 있습니다. 대표적인 결과에 예가 설명되어 있습니다. H2O2 캘리브레이션은 제조자의 프로토콜28에 따라 실험을 마친 후에 수행된다. - 저장된 파일을 열고 "질량당 산소 플럭스" 추적을 선택하여 실험적 산소 소비 결과를 얻습니다. Shift + 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 주사 사이의 창을 수동으로 선택합니다.
- 마크 > 통계로 이동하여 기질/억제제/결합되지 않은 프로토콜의 각 주입에 대한 결과를 시각화합니다. H2O2생산의 경우 "Amp-Slope" 트레이스와 동일한 절차를 수행하십시오.
참고: 창을 선택할 때 산소(또는H2O2)가 더 안정적이고 일정한 창을 선택하여 볼륨 주입의 아티팩트를 피하십시오. 선택한 창의 예는 대표적인 결과에서 검은색 중괄호로 표시됩니다(그림 2 및 그림 3).
- 마크 > 통계로 이동하여 기질/억제제/결합되지 않은 프로토콜의 각 주입에 대한 결과를 시각화합니다. H2O2생산의 경우 "Amp-Slope" 트레이스와 동일한 절차를 수행하십시오.
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Representative Results
투과된 좌골 신경에 의한 미토콘드리아 산소 소비량은 도 2에 나타내었다. 적색 트레이스는 단위 질량당O2 플럭스를 pmol/s.mg로 나타낸다. 내인성 기질로 기저 산소 소비를 기록한 후(일상적인 호흡), 숙시네이트(SUCC)는 콤플렉스 II(숙시네이트 데하이드로게나제)-구동 호흡을 기록하기 위해 주입되어, 산소 소모율의 증가를 초래한다. 순차적으로, ADP의 포화 농도가 첨가되어, ATP 신타제를 활성화시키고 산화적 인산화를 유도한다. 이것은 미토콘드리아 호흡의 인산 상태를 초래합니다. 인산 상태 호흡은 ATP 합성효소가 ATP26을 생성하는 양성자-동기력으로서 양성자 구배에 의해 형성된 막 전위를 사용하여 ADP+Pi(무기 포스페이트)로부터 ATP를 생성할 수 있음을 의미한다. ATP 신타제 활성에 의해 촉진되는 막 전위의 감소로 인해 산소 소비가 가속화되고 산소 흐름의 증가가 관찰됩니다. 외인성 시토크롬 c (CYTC)의 첨가는 호흡의 최소한의 자극만을 촉진하여이 준비를위한 미토콘드리아 외막 완전성을 인증했습니다. 조직의 투과화는 막 완전성을 손상시키고 시토크롬 c의 손실을 초래할 수 있다. 10%-15% 이상의 호흡률 증가는 손상된 미토콘드리아와 부적절한 조직 준비28,29를 나타낸다. 이 대표적인 결과에서, 호흡이 8.7 %의 증가가 있으며, 이는 조직 제제의 양호한 품질을 나타냅니다 (표 1). 올리고마이신(OLIGO)을 사용한 적정은 최대 용량 평가(30)에서 방해할 수 있는 OLIGO의 농도에 도달하는 것을 피하기 위해 최소 용량으로 수행되어야 한다. OLIGO에 의한 ATP 합성효소의 억제- 또는 올리고마이신26에 의한 상태 4 호흡-은 감소된 산소 소비 흐름을 가져왔다. 미토콘드리아 언커플러 시약인 FCCP로 적정하면 미토콘드리아 막 전위가 소산되어 호흡 플럭스를 자극하고 전자 전달을 위한 최대 용량(ETS 최대 용량)을 표시합니다. 실험이 끝나면 콤플렉스 III의 억제제인 안티마이신 A(AA)를 주입하여 미토콘드리아 호흡을 억제하고 비미토콘드리아 산소 소비(잔류 호흡)를 기록한다(그림 2). 이 대표적인 실험에 기록된 절대 산소 흐름은 표 1에 계산된다.
반응성 산소 생산(ROS)과 동시에 미토콘드리아 산소 소비를 분석하는 가능성-형광 센서를 갖는 Amplex Red에 의해 과산화수소(H2O2)를 검출함으로써 결정-생물 에너지 프로파일을 결정하는 데 큰 이점이며 다양한 병리에서 미토콘드리아 기능장애를 검출하기 위한 표준 도구이다. 미토콘드리아 ETS를 연료로 하기 위해 상이한 복합체에 대해 상이한 기질을 첨가하는 것은 또한 미토콘드리아 기능장애에 대한 특정 부위에 대한 더 많은 정보를 산출할 수 있다. 도 3은 ETS를 위한 연료를 제공하는 상이한 기판의 존재하에서의 산소 소비량(도 3A) 및 ROS 생산(도 3B)의 동시 측정과 함께 도시된다. 기저 호흡을 기록한 후, 피루베이트 + 말레이트(PM)가 미토콘드리아 복합체 I의 기질로서 챔버에 첨가되어, 산소 소비 플럭스를 증가시킨다. 콤플렉스 II의 기질인 SUCC의 첨가는 또한 호흡을 증가시키지만, 팔미토일-카르니틴(PC)의 추가 첨가는 이전의 기질 첨가에 비해 산소 흐름을 증가시키지 않으며, 이는 PM 및 SUCC가 이미 미토콘드리아 유비퀴논 부위를 포화시키거나 지방산 산화의 부족을 가질 수 있음을 시사한다. 예상대로, ROS 생산은 또한 기질의 첨가 후에 증가하여, ETS로부터 탈출하여 ROS를 형성하는 산소의 누출을 나타낸다(그림 3B, 녹색 트레이스). 포화 농도에서 ADP를 첨가하면 산소 소비가 증가하여 ATP 형성(그림 3A의 적색 트레이스)이 증가하고 ROS 생산이 감소합니다(그림 3B, 녹색 트레이스). CITC의 첨가는 산소 흐름을 6.8% 증가시켜, 미토콘드리아 막의 완전성을 확인시켜준다. OLIGO를 사용한 적정은 산소 소비 흐름을 감소시키고(도 3A의 적색 트레이스) ROS 생산을 증가시킨다(도 3B의 녹색 트레이스). ADP 및 OLIGO 효과는 이 프로토콜에서 투과된 좌골 신경이 미토콘드리아 생리학에서 표준 관계를 복제할 수 있음을 시사하며, 여기서 산소 소비의 증가는 막 전위의 감소로 이어지고 ROS 생산을 방지한다(31,32).
언커플러에 대해 예상된 바와 같이 FCCP를 첨가하면 산소 소비가 최대 속도로 증가하고, 막 전위 소산의 결과로 ROS 생산이 감소합니다. 콤플렉스 I과 AA의 억제제인 로테논을 첨가하면 산소 소비가 감소하고 ROS 형성이 증가하며(도 3A,B), 투과된 좌골 신경에서 미토콘드리아 생리학 및 생체에너지 프로파일이 보존됨을 확인하였다. 본 실험에 기록된 산소 흐름에 대한 절대값은 표 2에 계산된다.
그림 1: 미토콘드리아의 투과를 위한 좌골 신경 준비. 모든 절차는 얼음 위에서 수행되어야합니다. (A) 좌골신경을 안락사시킨 마우스로부터 추출하고 4°C에서 조직보존 완충액을 함유하는 페트리 접시에 넣는다. (B) 좌골신경 다발을 포셉으로 분리한다. (C,D) 조직은 원래의 흰색 불투명 관형 구조 (A)가 아닌 반투명 터프트로 해부 될 때 준비됩니다. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마우스의 투과된 좌골신경에서의 미토콘드리아 산소 소비의 대표적인 결과. 이 실험은 안락사된 마우스로부터의 좌골 신경 추출물의 대표적인 흔적이다. 좌골 신경은 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 이전에 투과되었다. 주사는 특정 시간에 화살표로 표시됩니다. SUCC: 숙시네이트; ADP: 아데노신 디포스페이트; Cyt c: 시토크롬 c; 올리고마이신; FCCP: 카르보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존; AA: 항마이신 A. 단위 질량당 플럭스로서의 산소 소모율 [nmol/mL](청색 트레이스)과 산소 소모율(적색 s.mg 량)으로서의 실시간 산소 농도가 표시됩니다. 검정 중괄호는 각 주사 후 결과에 대해 선택된 산소 소모율의 창을 나타냅니다. 기저부는 기질이없는 호흡을 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 투과화된 마우스 좌골 신경에서 ROS 생산에 결합된 미토콘드리아 산소 소비의 결과. 안락사된 마우스로부터의 좌골 신경 추출물의 대표적인 흔적이 도시되어 있다. 좌골 신경은 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 이전에 투과되었다. 주사는 특정 시간에 화살표로 표시됩니다. H2O2: 과산화수소; PM: 피루베이트/말레이트; SUCC: 숙시네이트; PC: 팔미토일카르니틴; ADP: 아데노신 디포스페이트; Cyt c: 시토크롬 c; 올리고마이신; FCCP: 카르보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존; ROT: 로테논; AA: 항마이신 A. (A) 단위 질량당 플럭스로서의 산소 소모율 [nmol/mL](청색 트레이스)과 산소 소모율(적색 트레이스)을 [s.mg nmol/mL]로 표시하였다. (b) ROS 생산은 교정 후H2O2형광(보라색 트레이스) 및H2O2생산 기울기[pmol/(s.mg)](녹색 트레이스)로서 입증된다. 검정 중괄호는 각 주사 후 결과에 대해 선택된 산소 소모율의 창을 나타냅니다. 기저부는 기질이없는 호흡을 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 기판 | 추가 | 산소 소비 비율 |
| 질량당 플럭스(pmol/[s.mg]) | ||
| 기저(추가 없음) | 없음 | 5.9 |
| 숙시네이트 (SUCC) | 10 mM의 한 번 첨가 | 16.9 |
| 증권 시세 표시기 | 1 μM의 1회 첨가 | 28.5 |
| 시토크롬 c (CYTC) | 10 μM의 한 번의 첨가 | 31 |
| 올리고마이신 A (OLIGO) | 0.2 μg/mL를 첨가한 적정 | 21.9 |
| 증권 시세 표시기 | 0.5 μM의 첨가를 사용한 적정 | 31.1 |
| 항 마이신 A (AA) | 5 μM의 한 번의 첨가 | 11.3 |
표 1: 기질/언커플러/억제제/적정(SUIT) 프로토콜 및 마우스 투과성 좌골 신경의 산소 소모율 결과. 산소 소비량은 SUIT 프로토콜의 각각의 첨가 후에 [O2pmol/(s.mg)]로 표시된다. 결과는 그림 2에 표시된 선택된 창의 평균에 의해 얻어집니다.
| 기판 | 추가 | 산소 소비량 (O2 pmol / [s.mg]) | ROS 생산 (H2O2pmol/[s.mg]) |
| 기저(추가 없음) | 없음 | 5.77 | 0.53 |
| 피루베이트 + 말레이트 (PM) | 5 mM + 2.5 mM의 하나의 펄스 | 7.17 | 0.58 |
| 숙시네이트 (SUCC) | 10 mM의 한 번 첨가 | 14.06 | 0.75 |
| 팔미토일 카르니틴 (PC) | 25μM의 두 펄스 | 14.68 | 0.79 |
| 증권 시세 표시기 | 1 μM의 1회 첨가 | 22.9 | 0.25 |
| 시토크롬 c (CYTC) | 10 μM의 한 번의 첨가 | 24.36 | 0.09 |
| 올리고마이신 A (OLIGO) | 0.2 μg/mL를 첨가한 적정 | 17.03 | 0.5 |
| 증권 시세 표시기 | 0.5 μM의 첨가를 사용한 적정 | 23.98 | 0.16 |
| 로테논 (로트) | 1μM의 1회 첨가 | 19.75 | 0.48 |
| 항 마이신 A (AA) | 5 μM의 한 번의 첨가 | 4.08 | 0.53 |
표 2: 기질/언커플러/억제제/적정(SUIT) 프로토콜 및 산소 소비율에 결합된 ROS 생산의 결과는 마우스 투과성 좌골 신경에 결합됨. 산소 소비는 SUIT 프로토콜의 각각의 첨가 후 [O2 pmol/(s.mg)] 및 [H2O2pmol/(s.mg)]에 의한 ROS 생산으로 표시된다. 결과는 그림 3에 표시된 선택된 창의 평균에 의해 얻어집니다.
| 미토콘드리아 함수에 대한 매개 변수 | 산소 소비율로부터의 계산 |
| 기저 호흡 | 기저 호흡 (기질을 첨가하지 않은 플럭스)28 |
| 잔류 산소 소비(ROX) | [AA 첨가 후의 플럭스] 28 |
| 복잡한 I 누출 호흡 | [PM의 첨가 후 플럭스] - [ROX]28,37 |
| 복잡한 II 누출 호흡 | [SUC 첨가 후 플럭스] - [ROX]28,37 |
| 인산 상태 (옥포스 용량) | [ADP 첨가 후 플럭스] - [ROX]28,43 |
| 비 - 인산 상태 (누출 호흡) | [올리고마이신 첨가 후 플럭스] – [ROX]28 |
| 호흡 조절 비율 | [인산 상태/비-인산화성] 28,43명 |
| ETS 수용량 | [FCCP 첨가 후 플럭스] - [ROX]28,37 |
표 3: 마우스 투과성 좌골 신경에서 미토콘드리아 기능의 평가를 위한 파라미터 계산. 산소 소모율에 의한 미토콘드리아 생리학 평가 공식에 대한 파라미터.
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Discussion
신경 병증을 동반하는 여러 질병 또는 상태는 위험 인자로서 미토콘드리아 기능 장애를 갖는다. 말초 신경에서 미토콘드리아 기능의 평가는 미토콘드리아가 이러한 신경 퇴행성 조건에서 어떻게 작용하는지 밝히는 데 필수적입니다. 미토콘드리아 기능의 평가는 분리 방법의 어려움과 물질의 부족으로 인해 힘들다. 따라서, 미토콘드리아의 단리를 필요로 하지 않는 조직 투과화 기술의 개발이 필수적이다.
투과 조직에서 미토콘드리아 기능을 평가하려면 세포 호흡을 방해하지 않고 세포 원형질막을 투과시킬 수있는 화학 물질을 선택하는 것이 중요합니다. 좌골 신경과 같은 말초 신경에서, 미엘린 조성물은 약 70 %의 지질이며, 그 중 대부분은 콜레스테롤33,34입니다. 콜레스테롤 분자와 상호작용하는 사포닌 및 디지토닌과 같은 투과화제의 선택은 다른 세포 구획을 방해하지 않으면서 미토콘드리아 기계에 기질이 접근할 수 있게 하는 기공을 초래한다(35,36). 이 프로토콜에서, Pesta 및 Gnaiger24에 의해 기술된 사포닌에 의한 근육-섬유 투과를 위한 잘 확립된 방법은 좌골 신경에 적응된다. 투과화 절차는 관심있는 미토콘드리아 파라미터를 기록하는 데 필요한 기질의 접근을 허용하기 위해 조직 분리에 관한 또 다른 중요한 단계를 포함한다. 본 작품은 단계를 설명하고, 도 1에서 만족스러운 조직 분리를 위한 예시가 제공된다.
미토콘드리아 호흡률 기록은 미토콘드리아 복합체 오작동, 산화 인산화 장애 또는 미토콘드리아의 교란과 관련된 차이를 확립하는 데 필수적입니다. 호흡기 상태 및 미토콘드리아 파라미터는 Chance와 Williams26에 의해 정의된다. 이 기사에서, 일상적인 호흡은 외인성 기질의 첨가없이 미토콘드리아 산소 소비가 기록 될 때 기초 호흡으로 정의됩니다. 복합체 용량 - 복합체 I 또는 II에 대한 기질이 미토콘드리아 산소 소비를 연료로 첨가 할 때, 누출 호흡으로도 명명 됨; 인산 상태 - ADP가 복합체 기질의 시퀀스에 첨가되면 ATP 합성을 유도하고; 비-인산 상태-모든 ADP가 ATP로 형성되거나 ATP 신타제 억제제의 첨가와 함께 형성될 때, 올리고마이신 (또는 상태 4); ETS 최대 용량-미토콘드리아 언커플러 FCCP가 첨가되는 경우와; 로테논 및 안티마이신 A의 첨가 후 잔류 산소 소비량 (ROX)-산소 소비가 미토콘드리아와 관련되지 않을 때. HRR에 의한 좌골 신경 조직에서 미토콘드리아 기능 평가를 위해이 작업에 설명 된 기술은 수많은 호흡 상태를 결정하고 동일한 샘플 내에서 고유 한 미토콘드리아 기능을 계산할 수있게합니다. 기질/결합되지 않은/억제제 프로토콜 테스트 결과는 표 3에 입증된 바와 같이 호흡 조절 비율/인자가 계산될 수 있는 미토콘드리아 기능의 파라미터를 도출하는데 사용될 수 있다(37). 이러한 파라미터의 평가는 절대 누출 속도를 최대 미토콘드리아 호흡과 결합하고 진단 값24,35,36,37,38,39에 대한 데이터를 발생시킵니다.
말초 신경의 미토콘드리아 기능 장애는 문헌에서 인용되지만, 이러한 매개 변수를 입증하는 데는 한계가 있습니다. 화학요법-유도된 신경병증 모델에서, 화학요법제인 옥살리플라틴을 사용한 치료에서 미토콘드리아 막 전위의 감소 및 복합체 I, II 및 III의 시험관내 활성의 감소가 말초 신경(saphenous nerve)의 감각 축삭(saphenous nerve)40,41에서 관찰된다. 그러나, 미토콘드리아 기능 평가에 필수적인 파라미터인 산화적 인산화에 의한 복합체의 활성 및 ATP의 형성에 대한 막 전위에 의해 발휘되는 조절에 대한 정보가 부족하다. 또한, 디지토닌으로 투과된 Sprague-Dawley 래트로부터의 해리된 좌골 신경에서, 산소 소비의 기록은 인산화된 상태에 대해서만 입증되지만, ATPase 억제제 또는 언커플러(22)의 존재하에서의 산소 소비와 비교되지는 않는다. 본 방법에서, 투과된 신경에서 호흡 조절 비율(표 3)을 분리된 미토콘드리아의 호흡 조절 비율과 비교하여, 보통 state3/state4(또는 인산화성/비인산성 상태)로부터 계산할 수 있다. 이 작업에 제공된 방법을 사용하면 복잡한 I, II 용량 - 미토콘드리아 막 무결성 유지 - 및 플럭스 제어 비율을 평가하고 최대 용량 호흡 및 잔류 산소 소비를 달성 할 수 있습니다.
미토콘드리아 산소 소비 평가를 위한 좌골 신경 투과를 위한 상이한 방법이 문헌에 기재되어 있다. 좌골 신경 투과를 위한 기술은 사포닌 치료 및 소용돌이 맥박에 의한 투과를 갖는 프로토콜에서 입증된다; 그러나, 오직 인산 상태 및 최대 용량만이 입증되었다41. 또한, 동일한 파라미터에 대해 여기에 제시된 값들을 비교하면, Cooper et al.41 에 의해 관찰된 산소 플럭스는 70% 더 낮으며, 교반 방법과 관련된 미토콘드리아 막에 손상이 있음을 입증한다. 본 프로토콜에서, 조직 분리는 미토콘드리아 막 완전성을 보존하고, 시토크롬 c의 첨가 후 산소 플럭스의 작은 증가에 의해 확인된다. 이것은 모든 미토콘드리아 매개 변수를 기록 할 수있게하여 미토콘드리아 산화 인산화 및 기능에 대한 완전한 기록을 제공하는 기능입니다. 콜라게나제를 사용한 좌골 신경 투과 방법에서도, 산소 플럭스 값은 여기에 제시된 것과 비슷하지만, 시토크롬 c를 첨가한 후에 거의 20%의 증가가 관찰되며, 이는 미토콘드리아 막 손상의 일정 수준을 시사한다(21). 이 기사에 설명 된 프로토콜을 통해 시토크롬 c 첨가 후 산소 플럭스의 6.3 % -8.7 %의 증가만이 관찰되어 미토콘드리아 막 무결성을 보존하고 산소 소비 기록을 최적화하는 데 본 방법의 이점을 확인했습니다.
미토콘드리아는 좌골 신경 조직에서 다양한 신호 전달 과정과 관련된 반응성 산소 종 (ROS) 생성의 주요 부위이며 신경 병증의 병리 생리학과 관련된 메커니즘42,43입니다. 이 프로토콜은 산소 소비와 동시에 형광 센서로 과산화수소 생성에 액세스 할 수있게 해주었습니다. 도 3에서 관찰된 바와 같이, ROS 생산은 미토콘드리아 호흡 상태의 변화에 민감하여, 미토콘드리아 완전성 상태를 확인하고 미토콘드리아 기능 기록을 최적화한다.
산소 소비량을 기록하기 위해 형광 센서를 기반으로 한 세포외 플럭스 분석기 (EFA)와 같은 다른 방법은 자동화 된 고처리량 스크리닝 장치에서 Schwann 세포 또는 축색돌기와 같은 배양 된 세포에서 말초 신경 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있습니다. 그러나 HRR과 같은 편광 센서를 사용할 때 몇 가지 이점이 있으며, 특히 실시간으로 실험을 수행하여 기질 / 억제제를 여러 번 주입 할 수있는 기능을 포함합니다. 따라서 이것은 한 번의 실험에서 미토콘드리아의 더 많은 복잡한 기능에 대한 평가와 소모품 24,35,38,39의 저렴한 비용을 허용합니다. EFA에 비해 HRR을 사용할 때의 단점은 매체 산성화(글리콜 플럭스 분석용)용 센서가 없고 한 번에 두 개의 샘플만 사용할 수 있는 제한된 워크플로우 기능이라는 점입니다.
HRR에 필요한 조직 투과화 기술의 한계는 잘 알려져 있다. 여기에는 ADP가 제한 될 때 미토콘드리아를 평가할 수 없으며 분리 된 미토콘드리아에 비해 결합되지 않은 호흡률이 감소합니다. 그러나, 여기에 기술된 사포닌-좌골 신경 투과화 프로토콜-페스타 및 그나이거24 에 의한 근육-섬유 투과화 프로토콜의 적응으로서-미토콘드리아 완전성을 손상시키지 않으면서 미토콘드리아 호흡 상태 및 미토콘드리아 파라미터의 평가를 허용한다. 또한 좌골 신경에서 산소 소비량과 ROS 생성을 동시에 기록 할 수 있으며, 미토콘드리아를 분리하는 데 악명 높은 한계가있는 조직입니다. 따라서이 프로토콜은 말초 신경에서 미토콘드리아 기능에 대한 더 나은 평가를 가능하게하고 말초 신경을 괴롭히는 병리 생리학 적 조건에서 미토콘드리아 역할을 조사하는 데 연구원에게 이점을 제공 할 수 있습니다.
문제 해결
시토크롬 c를 산소 소비 플럭스의 15% 이상으로 첨가한 후O2 소비가 증가하면, 투과화 과정이 매우 강하여 미토콘드리아 구조에 손상을 일으켰다는 것을 나타낸다. 이 경우 더 부드러운 신경 분리로 해부를 버리고 다시 시작하고 단계를 반복하십시오. 주입된 일부 시약이 미토콘드리아 산소 소비 또는H2O2생산에서 예상되는 효과를 입증하지 못한다면, 아마도 미토콘드리아 억제제를 사용한 챔버 오염 때문일 것이다. 이 경우, 두 가지 조치가 취해질 수 있다: (1) 챔버 및 주사기를 세척한 후 실험을 다시 시작하거나(단계 2.1) 또는 (2) 단계 2.1을 수행하기 전에 임의의 조직-분리된 미토콘드리아 또는 균질액의 샘플을 첨가한다. 이러한 샘플의 첨가는 미토콘드리아 억제제를 흡수하고 세척 단계를 향상시킵니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)에 의해 자금을 지원받았다. 우리는 안토니오 갈리나 필로 박사, 모니카 몬테로 로멜리 박사와 클라우디오 마수다 박사에게 실험실 시설에 대한 지원과 마사 소렌슨 박사에게 기사 개선에 친절하고 가치있는 의견을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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