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Biochemistry

उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

प्रतिदीप्ति सेंसर के लिए युग्मित उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी को निर्धारित करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर और आरओएस उत्पादन का आकलन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

परिधीय तंत्रिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता परिधीय न्यूरोपैथी से जुड़ी कई बीमारियों के साथ होती है, जिसे ऑटोइम्यून बीमारियों, मधुमेह, संक्रमण, विरासत में मिले विकारों और ट्यूमर सहित कई कारणों से ट्रिगर किया जा सकता है। माउस परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना छोटे नमूना आकार, ऊतक में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया की सीमित संख्या और माइलिन म्यान की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस काम में वर्णित तकनीक ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बजाय कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए मांसपेशियों के तंतुओं के लिए उपयोग किए जाने वाले एक से अनुकूलित एक अद्वितीय पारगम्यता प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन चुनौतियों को कम करती है। पेरोक्सीडेज के साथ फ्लोरिमेट्रिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन को मापने और सैपोनिन-पारगम्य नसों में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट और अवरोधकों की तुलना करके, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), और माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों की गतिविधि का एक साथ पता लगाना संभव था। इसलिए, यहां प्रस्तुत विधि अन्य तकनीकों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मूल्यांकन की तुलना में फायदे प्रदान करती है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका व्यवहार्यता को बनाए रखने और ऊर्जा चयापचय (ग्लूकोज, अमीनो एसिड, लिपिड और न्यूक्लियोटाइड चयापचय मार्ग) जैसे कई सेल कार्यों को करने के लिए आवश्यक हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन की प्राथमिक साइट के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया एपोप्टोसिस जैसी कई सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में केंद्रीय हैं और लौह-सल्फर (एफई-एस) क्लस्टर, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात और परिपक्वता के संश्लेषण में भाग लेते हैं, और उनके जीनोम और राइबोसोम 1,2,3 के रखरखाव में भाग लेते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता नेटवर्क को संलयन और विखंडन प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और उनके पास गुणवत्ता नियंत्रण और माइटोफैगी 4,5,6 के लिए मशीनरी भी होती है।

माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता कैंसर, मधुमेह और मोटापे जैसी कई रोग स्थितियों की उपस्थिति से जुड़ी हुई है7. माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में गड़बड़ी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में पाई जाती है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करती है, जैसे अल्जाइमर रोग 8,9, पार्किंसंस रोग10,11, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस 12,13, और हंटिंगटन रोग14,15 . परिधीय तंत्रिका तंत्र में, अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का नुकसान प्रतिरक्षा न्यूरोपैथी में देखा जाता है, जैसे कि गुइलेन-बैरे सिंड्रोम16,17, और अक्षतंतु में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन के सहयोग से, ये घटनाएं श्वान कोशिकाओं18 में एमएपी किनेज सक्रियण का कारण बनती हैं। यह दर्शाता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी न केवल साइट-विशिष्ट सेल के लिए, बल्कि पूरे ऊतक के लिए आवश्यक हो सकती है। एचआईवी से जुड़े डिस्टल संवेदी पॉलीन्यूरोपैथी (एचआईवी-डीएसपी) में, माइटोकॉन्ड्रिया की तंत्र में एक भूमिका होती है जिसके द्वारा प्रतिलेखन (एचआईवी-टीएटी) प्रोटीन का ट्रांस-एक्टिवेटर एचआईवी को कुशलतापूर्वक दोहराने की अनुमति देता है, साथ ही साथ एचआईवी संक्रमण रोगजनन19,20 में कई अन्य भूमिकाएं भी।

कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान का मूल्यांकन न्यूरोपैथी 7,21,22 की जांच के लिए एक आवश्यक लक्ष्य के रूप में उभरा है। मधुमेह न्यूरोपैथी में, प्रोटिओमिक और चयापचय विश्लेषण से पता चलता है कि मधुमेह में अधिकांश आणविक परिवर्तन कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और लिपिड चयापचय को प्रभावित करतेहैं 7. ये परिवर्तन मोटापे से प्रेरित मधुमेह के शुरुआती संकेत भी प्रतीत होते हैं21. कीमोथेरेपी-प्रेरित दर्दनाक न्यूरोपैथी के एक माउस मॉडल में, कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल हानि को ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन22 में कमी और माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स गतिविधियों, झिल्ली क्षमता और एटीपी सामग्री23 की कमी के रूप में पाया जाता है। हालांकि, हालांकि कई समूहों ने न्यूरोपैथी में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का हवाला दिया है, ये अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के संरक्षण के बिना माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों में गतिविधि के माप तक सीमित हैं, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता के मूल्यांकन या माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के लिए एक पैरामीटर के रूप में एटीपी सामग्री के माप की कमी है। सामान्य तौर पर, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन के उचित मूल्यांकन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की आवश्यकता होती है विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन एक परकोल / माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक के लिए एक सीमित कारक भी हो सकता है क्योंकि बड़ी मात्रा में आवश्यक ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया हानि और व्यवधान।

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान को माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और कटिस्नायुशूल तंत्रिका में आरओएस उत्पादन के रूप में मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को संरक्षित करना और माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की आवश्यकता के बिना। इस प्रोटोकॉल को उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति (एचआरआर) द्वारा पारगम्य मांसपेशी फाइबर24 में ऑक्सीजन की खपत माप से अनुकूलित किया गया है। इस प्रक्रिया के फायदे कटिस्नायुशूल तंत्रिका जैसे ऊतक की छोटी मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन करने और सीटू में माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों का मूल्यांकन करने की संभावना है, जिससे शारीरिक रूप से भरोसेमंद परिणाम प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पर्यावरण, संरचना और बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को संरक्षित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों को माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स और साइटोक्रोम सी गुणांक का ठीक से आकलन करने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता के बाद सब्सट्रेट और अवरोधकों के साथ निर्धारित किया गया था, जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ईटीएस) मूल्यांकन और आवश्यक मापदंडों की गणना के चरणों के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करता है। यह अध्ययन पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र में सवालों के जवाब देने के लिए उपकरण प्रदान कर सकता है जिसमें कटिस्नायुशूल तंत्रिका चयापचय को फंसाया जाता है, जैसे कि परिधीय न्यूरोपैथी।

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल अनुसंधान में जानवरों के उपयोग पर आचार समिति, सीसीएस / यूएफआरजे (सीईयूए -101/19), और प्रयोगात्मक जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित है। कटिस्नायुशूल तंत्रिका को चार महीने के पुरुष सी 57 बीएल / 6 चूहों से अलग किया जाता है, जो संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु होती है। प्रोटोकॉल चरणों माइटोकॉन्ड्रियल गिरावट से बचने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन माउस कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक विच्छेदन और पारगम्यता से पहले किया गया था।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. ऊतक संरक्षण बफर (टीपी बफर) तैयार करें।
    1. अल्ट्राप्योर पानी के समाधान में निम्नलिखित अभिकर्मकों को तैयार करें: मुक्त कैल्शियम के 0.1 μM के साथ सीए-ईजीटीए बफर का 10 एमएम, इमिडाज़ोल का 20 एमएम, टॉरिन का 20 एमएम, के-एमईएस का 50 एमएम, डीटीटी का 0.5 एमएम, एमजीसीएल2 का 6.56 एमएम, एटीपी का 5.77 एमएम, फॉस्फोक्रिएटिन का 15 एमएम ( सामग्री की तालिका देखें), पीएच 7.1 -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन बफर (एमआर बफर) तैयार करें।
    1. अल्ट्राप्योर पानी के समाधान में निम्नलिखित अभिकर्मकों को तैयार करें: के2ईजीटीए के 0.5 एमएम, एमजीसीएल2 के 3 एमएम, एमईएस के 60 एमएम, टॉरिन के 20 एमएम, केएच2 पीओ4 के 10 एमएम, एचईपीईएस के 20 एमएम, डी-सुक्रोज के 110 एमएम, बीएसए के 1 मिलीग्राम / -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. टीपी बफर (चरण 1.1) के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम सैपोनिन ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करके सैपोनिन स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें। सैपोनिन को ताजा तैयार किया जाता है।
  4. 2 एमएम की स्टॉक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डीएमएसओ के साथ पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) को फिर से निलंबित करके एम्पलेक्स रेड तैयार करें और प्रकाश से संरक्षित शीशी में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: ठंड और विगलन द्वारा जांच पहनने से बचने के लिए, भंडारण के लिए छोटे विभाज्य 6 महीने से अधिक नहीं25.

2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति (एचआरआर) के लिए पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन

  1. उपकरण और सिरिंज के एचआरआर कक्षों को साफ करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. एचआरआर कक्षों को खोलें, शीर्ष तक आसुत जल से भरें और 5 मिनट 3x के लिए हलचल करें। इथेनॉल के साथ दोहराएं और फिर पानी के साथ फिर से। स्टॉपर्स और सिरिंज को पानी/इथेनॉल/पानी से 3x प्रत्येक से धोएं।
  2. एचआरआर सॉफ़्टवेयर में निम्न अंशांकन सेटिंग्स लागू करें ( सामग्री तालिका देखें)।
    1. एचआरआर सॉफ्टवेयर नियंत्रण में, प्रायोगिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस), ऑक्सीजन सेंसर (लाभ, 2; ध्रुवीकरण वोल्टेज, 800 एमवी) के लिए पैरामीटर जोड़ें, और एम्परोमेट्रिक सेंसर (लाभ, 1000; ध्रुवीकरण वोल्टेज, 100 एमवी) के लिए।
  3. ऑक्सीजन सेंसर को कैलिब्रेट करें।
    1. प्रत्येक कक्ष में एमआर बफर (चरण 1.2) के पिपेट 2.1 एमएल। स्टॉपर्स के साथ बंद करें और एक बुलबुला बनने तक कक्ष में हवा खींचें। अंशांकन मोड में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ जब तक कि प्रति द्रव्यमान ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर न हो।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल24 के अनुसार सॉफ्टवेयर में पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का वायु अंशांकन करें।
      नोट: अंशांकन कदम केवल एक प्रयोग से पहले एक बार प्रदर्शन किया जाता है। एक ही श्वसन माध्यम और तापमान में अतिरिक्त प्रयोग केवल कक्षों (चरण 2.1) धोने के बाद किया जा सकता है।

3. कटिस्नायुशूल तंत्रिका का विच्छेदन और पारगम्यीकरण

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कटिस्नायुशूल तंत्रिका को हटा दें।
    1. अपने पिंजरे से हटाने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जानवर को इच्छामृत्यु दें और धीरे-धीरे बेंच पर आराम करने के लिए संयमित करें।
    2. इच्छामृत्यु वाले जानवर में, पीठ के निचले हिस्से में कैंची के साथ चीरा लगाएं, रीढ़ के पास शुरू करें और जांघ को पैर की ओर आगे बढ़ाएं। तंत्रिका से जुड़ी त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें, और फिर पूरे कटिस्नायुशूल तंत्रिका को काटें और हटा दें।
    3. ऊतक को तुरंत तौलें और इसे ठंडे टीबी बफर (4 डिग्री सेल्सियस) से भरी शीशी में रखें। बर्फ पर चरण 3.2-3.3 निष्पादित करें।
      नोट: गीले ऊतक वजन का उपयोग निम्नलिखित चरणों में ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन प्रवाह को सामान्य करने के लिए किया जाता है। यदि ऊतक को तुरंत तौला नहीं जा सकता है, तो इसे ठंडे टीबी बफर में संरक्षित करें। प्रक्रिया ताजा ऊतक में की जाती है और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति से बचने के लिए जमे हुए नहीं होना चाहिए।
  2. ऊतक की तैयारी के लिए, कटिस्नायुशूल तंत्रिका को इसे कवर करने के लिए पर्याप्त टीपी बफर के साथ पेट्री डिश में रखें। संदंश के साथ तंत्रिका के एक छोर पकड़ो, और संदंश की एक और जोड़ी के साथ, क्षैतिज रूप से तंत्रिका बंडलों बाहर खींचो।
    नोट: ऊतक गिरावट से बचने के लिए इस प्रक्रिया को 10 मिनट से भी कम समय में किया जाना चाहिए। ऊतक तैयार हो जाएगा जब इसे पारदर्शी धूमिल परतों के रूप में कल्पना की जा सकती है, पिछले सफेद अपारदर्शी ऊतक (चित्रा 1) के विपरीत।
  3. सबसे पहले, ऊतक पारगम्यता के लिए टीपी बफर के 1 एमएल युक्त एक छोटे से पकवान में स्प्लेड ऊतक को स्थानांतरित करें। पारगम्यीकरण शुरू करने के लिए, संदंश के साथ ऊतक को टीपी बफर के 1 एमएल और सैपोनिन के 10 μL (स्टॉक समाधान से, चरण 1.3) युक्त डिश में स्थानांतरित करें।
    1. 30 मिनट के लिए धीरे से एक माइक्रोप्लेट शेकर में हिलाएं, फिर एमआर बफर (1 एमएल) युक्त एक ताजा पकवान के लिए संदंश के साथ ऊतक को स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए धीरे से हिलाएं। एक कैलिब्रेटेड एचआरआर कक्ष के लिए संदंश के साथ ऊतक स्थानांतरण।

4. ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन निर्धारण

  1. एमआर बफर के 2.1 एमएल के साथ एचआरआर कक्षों को भरें, 5 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए एम्पलेक्स रेड (चरण 1.4) जोड़ें और पेरोक्सीडेज को 2 यू / एमएल में जोड़ें, और पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका (चरण 3) जोड़ें।
    1. उपकरण के प्रतिदीप्ति सेंसर संलग्न करें, सॉफ़्टवेयर के नियंत्रण अनुभाग में रोशनी बंद करें, और ऑक्सीग्राफ से कनेक्ट दबाएं। सॉफ्टवेयर में "प्रोटोकॉल संपादित करें" में, चरण 3.1.3 में मापा ऊतक वजन डालें।
  2. "लेआउट" पर जाएं, "विशिष्ट प्रवाह प्रति यूनिट नमूना" विकल्प चुनें, और ऑक्सीजन खपत रीडआउट तक पहुंचने के लिए प्लॉट का चयन करें और यदि वांछित हो, तो एच2ओ2 उत्पादन। ~ 10 मिनट प्रतीक्षा करें।
    नोट: इस समय कोई जोड़ा सब्सट्रेट (बेसल) के साथ ऑक्सीजन की खपत के बेसल प्रवाह को स्थिर करने के लिए आवश्यक है। आगे इंजेक्शन से पहले, सुनिश्चित करें कि ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर है।
  3. कक्ष में बाद में अंशांकन के लिए एच2हे2 के दो दालों को इंजेक्ट करें, प्रत्येक को 260 μM की अंतिम एकाग्रता में इंजेक्ट करें।
  4. माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली को सक्रिय करने के लिए सक्सिनेट के 20 μL इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें), एक माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स II सब्सट्रेट।
    नोट: विभिन्न परिसरों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस बिंदु पर विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट जोड़े जा सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों मैं और द्वितीय के लिए अलग सब्सट्रेट के साथ प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है। इस बिंदु पर, ओ 2 खपत और एच2 ओ2उत्पादन में वृद्धि, एक साथ, चित्रा 3 में देखी जाती है।
  5. एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) संश्लेषण को सक्रिय करने के लिए एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) के 20 μL जोड़ें।
    नोट: एडीपी एटीपी संश्लेषण को उत्तेजित करता है और झिल्ली क्षमता को कम करता है। ओ 2 खपत में वृद्धि और एच2 ओ2के उत्पादन में कमी26,27 देखी जाने की उम्मीद है।
  6. अनुक्रम में, झिल्ली अखंडता के संकेतक के रूप में साइटोक्रोम सी ( सामग्री की तालिका देखें) के 5 μL जोड़ें।
    नोट: यदि ऊतक अच्छी तरह से तैयार और पारगम्य है, तो साइटोक्रोम सी को ऑक्सीजन की खपत में 15% से अधिक की वृद्धि नहीं करनी चाहिए। यदि ऐसा होता है, तो अनुशंसाओं के लिए समस्या निवारण अनुभाग की जाँच करें।
  7. एमएल ओलिगोमाइसिन के विभाज्य के साथ टाइट्रेट ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि ओ2 खपत में कोई और कमी नहीं देखी जाती है।
    नोट: ओलिगोमाइसिन एटीपी संश्लेषण को बाधित करके कार्य करता है जिससे ओ2 प्रवाह में कमी आती है और उच्च झिल्ली क्षमता26,27द्वारा इष्ट एच2 ओ2 गठन में वृद्धि होती है।
  8. एल कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) ( सामग्री की तालिका देखें) के विभाज्य के साथ टाइट्रेट, माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर, जब तक कि ओ2 खपत में कोई और वृद्धि नहीं देखी जा सकती है। प्रयोग को समाप्त करने के लिए, 5 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए एंटीमाइसिन ए के 2 μl इंजेक्ट करें और प्रवाह स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें।
    नोट: एफसीसीपी इंजेक्शन लगाने के बाद झिल्ली संभावित अपव्यय केकारण एच2 ओ 2 उत्पादन में कमी देखी जाती है। एंटीमाइसिन ए जटिल III को रोकता है, जिससे इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह को रोका जा सकता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रिया-निर्भर ओ2 की खपत बिगड़ा हुआ है, प्रति द्रव्यमान ऑक्सीजन प्रवाह को कम करना और इलेक्ट्रॉन रिसाव को उत्तेजित करना, एच2ओ2 उत्पादन26,27 में वृद्धि।
  9. कमांड बार पर जाएं, सॉफ़्टवेयर में "मल्टीसेंसरी" खोजें, नियंत्रण > सहेजें फ़ाइल और डिस्कनेक्ट पर क्लिक करें।
    नोट: अध्ययन के तहत प्रश्न के अनुसार अन्य सब्सट्रेट और अवरोधकों के अलावा प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणामों में एक उदाहरण का वर्णन किया गया है। निर्माताकेप्रोटोकॉल28 के अनुसार, प्रयोग खत्म करने के बाद एच2 ओ 2 अंशांकन किया जाता है।
  10. सहेजी गई फ़ाइल खोलें और प्रयोगात्मक ऑक्सीजन खपत परिणाम प्राप्त करने के लिए "ऑक्सीजन फ्लक्स प्रति मास" ट्रेस का चयन करें। शिफ्ट + लेफ्ट माउस बटन दबाकर मैन्युअल रूप से इंजेक्शन के बीच विंडो का चयन करें।
    1. सब्सट्रेट/इनहिबिटर/अनकपल प्रोटोकॉल के प्रत्येक इंजेक्शन के परिणामों की कल्पना करने के लिए मार्क्स > स्टैटिस्टिक्स पर जाएं। एच2ओ2 उत्पादन के लिए, "एम्प-स्लोप" ट्रेस के साथ एक ही प्रक्रिया करें।
      नोट: खिड़की का चयन करते समय, एक खिड़की चुनकर वॉल्यूम इंजेक्शन की कलाकृतियों से बचें जहां ऑक्सीजन (या एच2ओ2) अधिक स्थिर और स्थिर है। चयनित खिड़कियों के उदाहरण प्रतिनिधि परिणामों (चित्रा 2 और चित्रा 3) में काले ब्रेसिज़ द्वारा दर्शाए जाते हैं।

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Representative Results

पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत चित्रा 2 में दर्शाया गया है। लाल ट्रेस पीएमओएल / एस.मिलीग्राम में ओ2 प्रवाह प्रति यूनिट द्रव्यमान का प्रतिनिधित्व करता है। अंतर्जात सब्सट्रेट (नियमित श्वसन) के साथ बेसल ऑक्सीजन की खपत को रिकॉर्ड करने के बाद, सक्सिनेट (एसयूसीसी) को जटिल द्वितीय (सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज) संचालित श्वसन रिकॉर्ड करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत दर में वृद्धि होती है। अनुक्रम में, एडीपी की संतृप्त एकाग्रता जोड़ी जाती है, एटीपी सिंथेज़ को सक्रिय करती है और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन चलाती है। इसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की फॉस्फोराइलेटिव अवस्था होती है। फॉस्फोरिलेटिव स्टेट श्वसन का मतलब है कि एटीपी सिंथेज़ एटीपी26 उत्पन्न करने के लिए प्रोटॉन-मोटिव बल के रूप में प्रोटॉन ढाल द्वारा गठित झिल्ली क्षमता का उपयोग करके एडीपी + पाई (अकार्बनिक फॉस्फेट) से एटीपी का उत्पादन कर सकता है। एटीपी सिंथेज़ गतिविधि द्वारा पदोन्नत झिल्ली क्षमता में कमी के साथ, ऑक्सीजन की खपत तेज हो जाती है, और ऑक्सीजन प्रवाह में वृद्धि देखी जाती है। बहिर्जात साइटोक्रोम सी (सीवाईटीसी) के अलावा श्वसन की केवल न्यूनतम उत्तेजना को बढ़ावा दिया, इस तैयारी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली अखंडता को प्रमाणित किया। ऊतकों का पारगम्यता झिल्ली अखंडता और साइटोक्रोम सी के नुकसान को नुकसान पहुंचा सकता है। 10% -15% से अधिक की बढ़ी हुई श्वसन दर क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया और अपर्याप्त ऊतक तैयारी28,29 का संकेत देती है। इस प्रतिनिधि परिणाम में, श्वसन में 8.7% की वृद्धि हुई है, जो ऊतक तैयारी की अच्छी गुणवत्ता का संकेत देती है (तालिका 1)। ओलिगोमाइसिन (ओलिगो) के साथ अनुमापन को ओलिगो की एकाग्रता तक पहुंचने से बचने के लिए न्यूनतम खुराक के साथ किया जाना चाहिए जो अधिकतम क्षमता मूल्यांकन30 में हस्तक्षेप कर सकता है। ओलिगो द्वारा एटीपी सिंथेज़ का निषेध - या ओलिगोमाइसिन26 द्वारा राज्य 4 श्वसन - जिसके परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत प्रवाह में कमी आई। एफसीसीपी के साथ अनुमापन, एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर अभिकर्मक, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को नष्ट कर देता है, श्वसन प्रवाह को उत्तेजित करता है और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण (ईटीएस अधिकतम क्षमता) के लिए अधिकतम क्षमता प्रदर्शित करता है। प्रयोग के अंत में, एंटीमाइसिन ए (एए), जटिल III का एक अवरोधक, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बाधित करने और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत (अवशिष्ट श्वसन) (चित्रा 2) को रिकॉर्ड करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है। इस प्रतिनिधि प्रयोग में दर्ज निरपेक्ष ऑक्सीजन प्रवाह तालिका 1 में गणना कर रहे हैं।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन उत्पादन (आरओएस) के साथ माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का विश्लेषण करने की संभावना - प्रतिदीप्ति सेंसर के साथ एम्पलेक्स रेड द्वारा हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) का पता लगाकर निर्धारित की जाती है - एक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल और विभिन्न विकृतियों में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का पता लगाने के लिए एक मानक उपकरण निर्धारित करने के लिए एक बड़ा फायदा है। माइटोकॉन्ड्रियल ईटीएस को ईंधन देने के लिए विभिन्न परिसरों के लिए विभिन्न सब्सट्रेट के अलावा माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के लिए विशिष्ट साइटों के बारे में अधिक जानकारी भी मिल सकती है। चित्रा 3 ईटीएस के लिए ईंधन प्रदान करने वाले विभिन्न सब्सट्रेट की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 3 ए) और आरओएस उत्पादन (चित्रा 3 बी) के एक साथ माप के साथ दिखाया गया है। बेसल श्वसन रिकॉर्ड करने के बाद, पाइरूवेट + मैलेट (पीएम) को माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स आई के लिए सब्सट्रेट के रूप में कक्ष में जोड़ा जाता है, जिससे ऑक्सीजन की खपत प्रवाह बढ़ जाता है। जटिल द्वितीय के सब्सट्रेट एसयूसीसी के अलावा, श्वसन भी बढ़ता है, लेकिन पामिटॉयल-कार्निटाइन (पीसी) के आगे के अलावा पहले सब्सट्रेट परिवर्धन की तुलना में ऑक्सीजन प्रवाह में वृद्धि नहीं होती है, यह सुझाव देते हुए कि पीएम और एसयूसीसी ने पहले से ही माइटोकॉन्ड्रियल यूबिक्विनोन साइट या फैटी एसिड ऑक्सीकरण की कमी को संतृप्त कर दिया हो सकता है। जैसा कि अपेक्षित था, आरओएस उत्पादन सब्सट्रेट के अलावा भी बढ़ता है, जो ऑक्सीजन के रिसाव का प्रतिनिधित्व करता है जो ईटीएस से बच जाता है और आरओएस (चित्रा 3 बी, ग्रीन ट्रेस) बनाता है। संतृप्त एकाग्रता में एडीपी के अलावा ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है, एटीपी गठन ड्राइविंग (चित्रा 3 ए में लाल ट्रेस) और आरओएस उत्पादन (चित्रा 3 बी, हरा ट्रेस) कम हो जाता है। सीवाईटीसी के अलावा केवल 6.8% तक ऑक्सीजन प्रवाह बढ़ता है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता की पुष्टि करता है। ओलिगो के साथ अनुमापन ऑक्सीजन की खपत प्रवाह (चित्रा 3 ए में लाल ट्रेस) को कम करता है और आरओएस उत्पादन (चित्रा 3 बी में हरा ट्रेस) बढ़ाता है। एडीपी और ओलिगो प्रभाव बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल में पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी में मानक संबंध को दोहरा सकती है, जिसमें ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि से झिल्ली क्षमता में कमी आती है और आरओएस उत्पादन31,32 को रोकता है।

एफसीसीपी के अलावा, जैसा कि एक अनकपलर के लिए अपेक्षित है, ऑक्सीजन की खपत को इसकी अधिकतम दर तक बढ़ाता है, और झिल्ली संभावित अपव्यय के परिणामस्वरूप, आरओएस उत्पादन कम हो जाता है। रोटेनोन के अलावा, जटिल मैं और एए के एक अवरोधक, ऑक्सीजन की खपत को कम करता है और आरओएस गठन (चित्रा 3 ए, बी) को बढ़ाता है, यह पुष्टि करता है कि पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान और बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल संरक्षित हैं। इस प्रयोग में दर्ज ऑक्सीजन प्रवाह के लिए निरपेक्ष मूल्यों की गणना तालिका 2 में की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रिया के पारगम्यीकरण के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका तैयारी। सभी प्रक्रियाओं को बर्फ पर करने की आवश्यकता है। (ए) कटिस्नायुशूल तंत्रिका को एक इच्छामृत्यु माउस से निकाला जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक संरक्षण बफर युक्त पेट्री डिश में रखा जाता है। (सी, डी) ऊतक तैयार होता है जब इसे मूल सफेद अपारदर्शी ट्यूबलर संरचना (ए) के बजाय पारभासी टफ्ट्स में विच्छेदित किया जाता है। स्केल बार = 1 सेमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माउस के पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधि परिणाम। प्रयोग एक इच्छामृत्यु माउस से एक कटिस्नायुशूल तंत्रिका निकालने का एक प्रतिनिधि ट्रेस है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में कटिस्नायुशूल तंत्रिका पहले पारगम्य था। इंजेक्शन को विशिष्ट समय पर तीर के रूप में इंगित किया जाता है। एसयूसीसी: सक्सीनेट; एडीपी: एडेनोसिन डिफॉस्फेट; साइट सी: साइटोक्रोम सी; ओलिगो: ओलिगोमाइसिन; एफसीसीपी: कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फिनाइलहाइड्राज़ोन; एमएल) (ब्लू ट्रेस) के रूप में वास्तविक समय ऑक्सीजन एकाग्रता और प्रति यूनिट द्रव्यमान प्रवाह के रूप में ऑक्सीजन की खपत दर [पीएमओएल / (s.mg)] (लाल ट्रेस) दिखाया गया है। ब्लैक ब्रेसिज़ प्रत्येक इंजेक्शन के बाद परिणामों के लिए चयनित ऑक्सीजन खपत दरों की खिड़कियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बेसल बिना सब्सट्रेट के श्वसन को संदर्भित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का परिणाम पारगम्य माउस कटिस्नायुशूल तंत्रिका में आरओएस उत्पादन के लिए युग्मित है। इच्छामृत्यु वाले माउस से एक कटिस्नायुशूल तंत्रिका निकालने का एक प्रतिनिधि ट्रेस दिखाया गया है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में कटिस्नायुशूल तंत्रिका पहले पारगम्य था। इंजेक्शन को विशिष्ट समय पर तीर के रूप में इंगित किया जाता है। एच2हे2: हाइड्रोजन पेरोक्साइड; पीएम: पाइरूवेट / एसयूसीसी: सक्सीनेट; पीसी: पामिटॉयल-कार्निटाइन; एडीपी: एडेनोसिन डिफॉस्फेट; साइट सी: साइटोक्रोम सी; ओलिगो: ओलिगोमाइसिन; एफसीसीपी: कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फिनाइलहाइड्राज़ोन; सड़ांध: रोटेनोन; एमएल) (ब्लू ट्रेस) के रूप में वास्तविक समय ऑक्सीजन एकाग्रता और प्रति यूनिट द्रव्यमान प्रवाह के रूप में ऑक्सीजन की खपत दर [ओ2 पीएमओएल / (s.mg)] (लाल ट्रेस) दिखाया गया है। (बी) आरओएस उत्पादन अंशांकन के बाद एच2ओ2 प्रतिदीप्ति (बैंगनी ट्रेस) और एच2ओ2 उत्पादन ढलान [पीएमओएल / (s.mg)] (ग्रीन ट्रेस) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। ब्लैक ब्रेसिज़ प्रत्येक इंजेक्शन के बाद परिणामों के लिए चयनित ऑक्सीजन खपत दरों की खिड़कियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बेसल बिना सब्सट्रेट के श्वसन को संदर्भित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सब्सट्रेट अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत दर
प्रति द्रव्यमान प्रवाह (पीएमओएल/[s.mg])
बेसल (कोई अतिरिक्त नहीं) कोई नहीं 5.9
सक्सीनेट (एसयूसीसी) 10 एमएम का एक अतिरिक्त 16.9
एडीपी 1 μM का एक जोड़ 28.5
साइटोक्रोम सी (सीवाईटीसी) 10 μM का एक जोड़ 31
ओलिगोमाइसिन ए (ओलिगो) 0.2 μg/mL के परिवर्धन के साथ अनुमापन 21.9
एफसीसीपी 0.5 μM के परिवर्धन के साथ अनुमापन 31.1
एंटीमाइसिन ए (एए) 5 μM का एक जोड़ 11.3

अनुमापन (सूट) प्रोटोकॉल और माउस पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में ऑक्सीजन की खपत दर के परिणाम। सूट प्रोटोकॉल के प्रत्येक अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन की खपत को [ओ2पीएमओएल / (s.mg)] में दर्शाया गया है। परिणाम चित्रा 2 में चिह्नित चयनित खिड़कियों के औसत से प्राप्त कर रहे हैं.

सब्सट्रेट अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत (ओ2 पीएमओएल / [s.mg]) आरओएस उत्पादन (एच2ओ2 पीएमओएल / [s.mg])
बेसल (कोई अतिरिक्त नहीं) कोई नहीं 5.77 0.53
पाइरूवेट + मैलेट (पीएम) 5 एमएम + 2.5 एमएम की एक नाड़ी 7.17 0.58
सक्सीनेट (एसयूसीसी) 10 एमएम का एक अतिरिक्त 14.06 0.75
पामिटॉयल कार्निटाइन (पीसी) 25 μM की दो दालें 14.68 0.79
एडीपी 1 μM का एक जोड़ 22.9 0.25
साइटोक्रोम सी (सीवाईटीसी) 10 μM का एक जोड़ 24.36 0.09
ओलिगोमाइसिन ए (ओलिगो) 0.2 μg/mL के परिवर्धन के साथ अनुमापन 17.03 0.5
एफसीसीपी 0.5 μM के परिवर्धन के साथ अनुमापन 23.98 0.16
रोटेनोन (आरओटी) 1μM का एक जोड़ 19.75 0.48
एंटीमाइसिन ए (एए) 5 μM का एक जोड़ 4.08 0.53

अनुमापन (सूट) प्रोटोकॉल और आरओएस उत्पादन के परिणाम ऑक्सीजन खपत दर माउस पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका के लिए युग्मित हैं। सूट प्रोटोकॉल के प्रत्येक जोड़ के बाद ऑक्सीजन की खपत को [ओ2 पीएमओएल / (s.mg)] और आरओएस उत्पादन [एच2ओ2 पीएमओएल / (s.mg)] द्वारा दर्शाया गया है। परिणाम चित्रा 3 में चिह्नित चयनित खिड़कियों के औसत से प्राप्त कर रहे हैं.

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए पैरामीटर ऑक्सीजन खपत दरों से गणना
बेसल श्वसन बेसल श्वसन (सब्सट्रेट के कोई जोड़ के साथ प्रवाह)28
अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत (आरओएक्स) [एए के अतिरिक्त के बाद प्रवाह] 28
जटिल मैं रिसाव श्वसन [पीएम के अतिरिक्त के बाद प्रवाह] - [आरओएक्स]28,37
जटिल द्वितीय रिसाव श्वसन [एसयूसीसी के अलावा के बाद प्रवाह] - [आरओएक्स]28,37
फॉस्फोरिलेटिव अवस्था (ऑक्सफॉस क्षमता) [एडीपी के अतिरिक्त के बाद प्रवाह] - [आरओएक्स]28,43
गैर - फॉस्फोरिलेटिव अवस्था (रिसाव श्वसन) [ओलिगोमाइसिन के अलावा के बाद प्रवाह] - [आरओएक्स]28
श्वसन नियंत्रण अनुपात [फॉस्फोरिलेटिव अवस्था / गैर-फॉस्फोरिलेटिव] 28,43
ईटीएस की क्षमता [एफसीसीपी के अलावा के बाद प्रवाह] - [आरओएक्स]28,37

तालिका 3: माउस पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मूल्यांकन के लिए पैरामीटर गणना। ऑक्सीजन की खपत दरों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी मूल्यांकन सूत्र के लिए पैरामीटर।

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Discussion

न्यूरोपैथी के साथ कई बीमारियों या स्थितियों में जोखिम कारक के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता होती है। परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन यह स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है कि माइटोकॉन्ड्रिया इन न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों में कैसे कार्य करता है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन अलगाव विधि की कठिनाई और सामग्री की कमी के कारण श्रमसाध्य है। इस प्रकार, ऊतक पारगम्यता तकनीकों का विकास आवश्यक है जिन्हें माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की आवश्यकता नहीं है।

पारगम्य ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए, एक रसायन चुनना जो कोशिका श्वसन में हस्तक्षेप किए बिना कोशिका प्लाज्मा झिल्ली को पारगम्य बना सकता है, महत्वपूर्ण है। कटिस्नायुशूल तंत्रिका जैसे परिधीय तंत्रिकाओं में, माइलिन संरचना लगभग 70% लिपिड है, जिनमें से अधिकांश कोलेस्ट्रॉल33,34 हैं। कोलेस्ट्रॉल अणुओं के साथ बातचीत करने वाले सैपोनिन और डिजिटोनिन जैसे पारगम्य एजेंटों की पसंद के परिणामस्वरूप छिद्र होते हैं जो अन्य सेलुलर डिब्बों35,36 के साथ हस्तक्षेप किए बिना माइटोकॉन्ड्रियल मशीनरी तक सब्सट्रेट पहुंच की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, पेस्टा और ग्नाइजर24 द्वारा वर्णित सैपोनिन द्वारा मांसपेशियों-फाइबर पारगम्यता के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि कटिस्नायुशूल नसों के लिए अनुकूलित है। पारगम्यप्रक्रिया में ब्याज के माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों को रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट तक पहुंच की अनुमति देने के लिए ऊतक पृथक्करण के बारे में एक और महत्वपूर्ण कदम शामिल है। वर्तमान कार्य चरणों का वर्णन करता है, और चित्र 1 में एक संतोषजनक ऊतक पृथक्करण के लिए प्रदान किए जाते हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर रिकॉर्ड माइटोकॉन्ड्रिया कॉम्प्लेक्स खराबी, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन गड़बड़ी, या बाधित माइटोकॉन्ड्रिया के बारे में मतभेद स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। श्वसन स्थितियों और माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों को चांस और विलियम्स26 द्वारा परिभाषित किया गया है। इस लेख में, नियमित श्वसन को बेसल श्वसन के रूप में परिभाषित किया गया है जब माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत बहिर्जात सब्सट्रेट के बिना दर्ज की जाती है; कॉम्प्लेक्स क्षमता - जब जटिल I या II के लिए सब्सट्रेट को माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत को ईंधन में जोड़ा जाता है, जिसे रिसाव श्वसन भी कहा जाता है; फॉस्फोराइलेटिव अवस्था - जब एडीपी को कॉम्प्लेक्स सब्सट्रेट के अनुक्रम में जोड़ा जाता है और एटीपी संश्लेषण को चलाता है; गैर-फॉस्फोराइलेटिव राज्य - जब सभी एडीपी एटीपी में या एटीपी सिंथेज़ अवरोधक, ओलिगोमाइसिन (या राज्य 4) के अलावा बनते हैं; ईटीएस अधिकतम क्षमता - जब माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर एफसीसीपी जोड़ा जाता है और; रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के अलावा अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत (आरओएक्स) - जब ऑक्सीजन की खपत माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित नहीं होती है। एचआरआर द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन मूल्यांकन के लिए इस काम में वर्णित तकनीक एक ही नमूने के भीतर कई श्वसन राज्यों और आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की गणना का निर्धारण करने की अनुमति देती है। अवरोधक प्रोटोकॉल परीक्षण परिणामों का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मापदंडों को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जिसमें से श्वसन नियंत्रण अनुपात / कारकों की गणना37 की जा सकती है, जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है। इन मापदंडों का मूल्यांकन पूर्ण रिसाव दरों को जोड़ता है, अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के साथ मिलकर, और नैदानिक मूल्य 24,35,36,37,38,39 के लिए डेटा उठाता है।

यद्यपि परिधीय तंत्रिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता को साहित्य में उद्धृत किया गया है, लेकिन इन मापदंडों को प्रदर्शित करने में सीमाएं हैं। कीमोथेरेपी-प्रेरित न्यूरोपैथी मॉडल में, कीमोथेरेपी एजेंट, ऑक्सालिप्लैटिन के साथ उपचार में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में कमी, और परिसरों I, II और III की इन विट्रो गतिविधि में कमी परिधीय तंत्रिका (सैफेनस तंत्रिका) 40,41 के संवेदी अक्षतंतु में देखी जाती है। हालांकि, कॉम्प्लेक्स की गतिविधियों पर झिल्ली क्षमता और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा एटीपी के गठन पर लगाए गए नियंत्रण के बारे में जानकारी की कमी है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन मूल्यांकन में एक आवश्यक पैरामीटर है। इसके अलावा, स्प्रैग-डॉली चूहों से अलग कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं में डिजिटोनिन के साथ पारगम्य, ऑक्सीजन की खपत की रिकॉर्डिंग केवल फॉस्फोराइलेटेड अवस्था के लिए प्रदर्शित की जाती है, लेकिन एटीपीस अवरोधक या अनकपलर22 की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत के साथ तुलना नहीं की जाती है। वर्तमान विधि में, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के श्वसन नियंत्रण अनुपात की तुलना में पारगम्य तंत्रिका (तालिका 3) में श्वसन नियंत्रण अनुपात की गणना करना संभव है, आमतौर पर राज्य 3/राज्य 4 (या फॉस्फोराइलेटिव / गैर-फॉस्फोराइलेटिव राज्यों) से गणना की जाती है। इस काम में प्रदान की गई विधि के साथ, जटिल I, II क्षमताओं का आकलन करना संभव है - माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता को बनाए रखना - और प्रवाह नियंत्रण अनुपात, और अधिकतम क्षमता श्वसन और अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत प्राप्त करना।

माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत मूल्यांकन के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन साहित्य में किया गया है। कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता के लिए एक तकनीक भंवर नाड़ी द्वारा सैपोनिन उपचार और पारगम्यता के साथ एक प्रोटोकॉल में प्रदर्शित की जाती है; हालाँकि, केवल फॉस्फोराइलेटिव राज्य और अधिकतम क्षमता का प्रदर्शन किया गया था41. इसके अलावा, समान मापदंडों के लिए यहां प्रस्तुत मूल्यों की तुलना करते हुए, कूपर एट अल .41 द्वारा मनाया गया ऑक्सीजन प्रवाह 70% कम है, यह दर्शाता है कि आंदोलन विधि से संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान हुआ है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, ऊतक पृथक्करण माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता को संरक्षित करता है, साइटोक्रोम सी के अलावा ऑक्सीजन प्रवाह में छोटी वृद्धि से पुष्टि की जाती है। यह एक ऐसी विशेषता है जो सभी माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देती है, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और फ़ंक्शन का पूरा रिकॉर्ड प्रदान करती है। भले ही कोलेजनेज के साथ एक कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता विधि में, ऑक्सीजन प्रवाह मूल्य यहां प्रस्तुत किए गए लोगों के लिए तुलनीय हैं, साइटोक्रोम सी जोड़ने के बाद लगभग 20% की वृद्धि देखी जाती है, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति21 के कुछ स्तर का सुझाव देती है। इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, साइटोक्रोम सी जोड़ के बाद ऑक्सीजन प्रवाह के केवल 6.3% -8.7% की वृद्धि देखी गई, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता को संरक्षित करने और ऑक्सीजन खपत रिकॉर्डिंग को अनुकूलित करने में वर्तमान विधि के लाभ की पुष्टि की गई।

माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी की प्राथमिक साइट है जो कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक में विविध सिग्नलिंग प्रक्रियाओं और न्यूरोपैथी42,43 में पैथोफिजियोलॉजी से संबंधित तंत्र से जुड़ी है। इस प्रोटोकॉल ने ऑक्सीजन की खपत के साथ एक प्रतिदीप्ति सेंसर के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड पीढ़ी तक पहुंचना संभव बना दिया। जैसा कि चित्रा 3 में देखा गया है, आरओएस उत्पादन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों के परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील है, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता की स्थिति की पुष्टि करता है और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन रिकॉर्डिंग का अनुकूलन करता है।

ऑक्सीजन की खपत को रिकॉर्ड करने के लिए प्रतिदीप्ति सेंसर के आधार पर बाह्य प्रवाह विश्लेषक (ईएफए) जैसे अन्य तरीके, सुसंस्कृत कोशिकाओं में परिधीय-तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन कर सकते हैं - जैसे श्वान कोशिकाएं या अक्षतंतु - एक स्वचालित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग डिवाइस में। हालांकि, एचआरआर जैसे पोलरोग्राफिक सेंसर का उपयोग करने में कुछ फायदे हैं, विशेष रूप से वास्तविक समय में प्रयोग का पालन करने की क्षमता, सब्सट्रेट / इस प्रकार, यह एक प्रयोग में माइटोकॉन्ड्रिया में जटिल कार्यों की एक बड़ी संख्या के मूल्यांकन की अनुमति देता है, और उपभोग्य सामग्रियों की कम लागत 24,35,38,39। ईएफए की तुलना में एचआरआर का उपयोग करने का एक नुकसान मीडिया अम्लीकरण (ग्लाइकोलाइटिक प्रवाह के विश्लेषण के लिए) और सीमित वर्कफ़्लो क्षमता के लिए सेंसर की अनुपस्थिति है, जो एक समय में केवल दो नमूनों के उपयोग की अनुमति देता है।

एचआरआर के लिए आवश्यक ऊतक पारगम्यता तकनीकों की सीमाएं अच्छी तरह से ज्ञात हैं। उनमें माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन करने में असमर्थता शामिल है जब एडीपी सीमित होता है और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की तुलना में कम अनियंत्रित श्वसन दर होती है। हालांकि, यहां वर्णित सैपोनिन-कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता प्रोटोकॉल - पेस्टा और ग्नाइजर24 द्वारा मांसपेशी-फाइबर पारगम्यता प्रोटोकॉल के अनुकूलन के रूप में - माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को नुकसान पहुंचाए बिना माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों और माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। यह कटिस्नायुशूल तंत्रिका में ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन को एक साथ रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए कुख्यात सीमाओं के साथ एक ऊतक। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल परिधीय तंत्रिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के बेहतर मूल्यांकन की अनुमति देता है और परिधीय तंत्रिकाओं को पीड़ित करने वाली पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में माइटोकॉन्ड्रियल भूमिकाओं की जांच में शोधकर्ताओं को लाभ प्रदान कर सकता है।

समस्या निवारण
यदि ऑक्सीजन खपत प्रवाह के 15% से अधिक साइटोक्रोम सी को जोड़ने के बाद ओ2 खपत में वृद्धि होती है, तो यह इंगित करता है कि पारगम्यता प्रक्रिया बहुत मजबूत थी और माइटोकॉन्ड्रियल संरचना को नुकसान पहुंचाती थी। यदि ऐसा है, तो एक जेंटलर तंत्रिका पृथक्करण के साथ विच्छेदन को त्यागें और फिर से शुरू करें और चरणों को दोहराएं। यदि इंजेक्शन वाले कुछ अभिकर्मक माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीजन की खपत या एच2 ओ 2उत्पादन में अपेक्षित प्रभाव प्रदर्शित नहीं करते हैं, तो यह संभवतः माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के साथ कक्ष संदूषण के कारण होता है। इस मामले में, दो क्रियाएं की जा सकती हैं: (1) कक्षों और सिरिंज (चरण 2.1) को धोने के बाद प्रयोग को पुनरारंभ करें या (2) चरण 2.1 करने से पहले किसी भी ऊतक-पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या होमोजेनेट का एक नमूना जोड़ें। इन नमूनों के परिवर्धन माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों को अवशोषित करेंगे और सफाई चरण में सुधार करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो सेरापिलहेरा, फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (एफएपीईआरजे), कॉन्सेल्हो नैशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो सिएंटिफिको ई टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू) और कोर्डेनाकाओ डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोल डी निवेल सुपीरियर-ब्रासिल द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम प्रयोगशाला सुविधाओं के साथ समर्थन के लिए डॉ एंटोनियो गैलिना फिल्हो, डॉ मोनिका मोंटेरो लोमेली और डॉ क्लाउडियो मसूदा और लेख में सुधार में दयालु और मूल्यवान टिप्पणियों के लिए डॉ मार्था सोरेनसन के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना
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Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

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