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Biochemistry

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Abstract

La disfunción mitocondrial en los nervios periféricos acompaña a varias enfermedades asociadas con la neuropatía periférica, que puede desencadenarse por múltiples causas, incluidas enfermedades autoinmunes, diabetes, infecciones, trastornos hereditarios y tumores. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos del ratón puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de la muestra, un número limitado de mitocondrias presentes en el tejido y la presencia de una vaina de mielina. La técnica descrita en este trabajo minimiza estos desafíos mediante el uso de un protocolo de permeabilización único adaptado de uno utilizado para las fibras musculares, para evaluar la función mitocondrial del nervio ciático en lugar de aislar las mitocondrias del tejido. Al medir la producción fluorimétrica de especies reactivas con Amplex Red/Peroxidasa y comparar diferentes sustratos e inhibidores mitocondriales en nervios permeabilizados con saponina, fue posible detectar estados respiratorios mitocondriales, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de complejos mitocondriales simultáneamente. Por lo tanto, el método presentado aquí ofrece ventajas en comparación con la evaluación de la función mitocondrial mediante otras técnicas.

Introduction

Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas 1,2,3. La red de dinámica de membranas mitocondriales está controlada por procesos de fusión y fisión, y también cuentan con maquinaria para el control de calidad y mitofagia 4,5,6.

La disfunción mitocondrial se asocia con la aparición de varias afecciones patológicas como el cáncer, la diabetes y la obesidad7. Se detectan alteraciones en la función mitocondrial en trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central, como en la enfermedad de Alzheimer 8,9, la enfermedad de Parkinson10,11, la esclerosis lateral amiotrófica12,13 y la enfermedad de Huntington 14,15 . En el sistema nervioso periférico, la pérdida de la función mitocondrial en los axones se observa en neuropatías inmunes, como el síndrome de Guillain-Barré16,17, y en asociación con una alta producción de ROS mitocondriales en axones, estos eventos conducen a la activación de la MAP quinasa en las células de Schwann18. Esto demuestra que la fisiología mitocondrial puede ser esencial no solo para una célula específica del sitio, sino para un tejido completo. En la polineuropatía sensorial distal asociada al VIH (HIV-DSP), las mitocondrias tienen un papel en el mecanismo por el cual la proteína transactivadora de la transcripción (HIV-TAT) permite que el VIH se replique de manera eficiente, así como varias otras funciones en la patogénesis de la infección por VIH19,20.

La evaluación de la fisiología mitocondrial del nervio ciático se ha convertido en un objetivo esencial para la investigación de la neuropatía 7,21,22. En la neuropatía diabética, los análisis proteómicos y metabolómicos sugieren que la mayoría de las alteraciones moleculares en la diabetes afectan a la fosforilación oxidativa mitocondrial del nervio ciático y al metabolismo lipídico7. Estas alteraciones también parecen ser signos tempranos de diabetes inducida por la obesidad21. En un modelo de ratón de neuropatía dolorosa inducida por quimioterapia, el deterioro mitocondrial en el nervio ciático se detecta como una disminución en la fosforilación oxidativa22 y una reducción de las actividades de los complejos mitocondriales, el potencial de membrana y el contenido de ATP23. Sin embargo, aunque varios grupos han citado la disfunción mitocondrial en neuropatías, estos estudios se limitan a las mediciones de la actividad en complejos mitocondriales sin preservación de las membranas mitocondriales, careciendo de evaluación de la integridad mitocondrial o mediciones del contenido de ATP como parámetro para la producción de ATP mitocondrial. En general, una evaluación adecuada del consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS requiere el aislamiento de las mitocondrias por centrifugación diferencial en un gradiente percol/sacarosa. El aislamiento de las mitocondrias también puede ser un factor limitante para el tejido nervioso ciático debido a la gran cantidad de tejido necesario y la pérdida e interrupción de las mitocondrias.

El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para medir la fisiología mitocondrial como el consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático, preservando las membranas mitocondriales y sin necesidad de aislar las mitocondrias. Este protocolo se adapta a partir de mediciones de consumo de oxígeno en fibras musculares permeabilizadas24 mediante respirometría de alta resolución (HRR). Las ventajas de este procedimiento son la posibilidad de evaluar las mitocondrias en pequeñas cantidades de tejido como el nervio ciático y evaluar los parámetros mitocondriales in situ, preservando así el entorno mitocondrial, la estructura y el perfil bioenergético, para obtener un resultado fisiológicamente confiable. Los estados respiratorios mitocondriales se determinaron con sustratos e inhibidores después de la permeabilización del nervio ciático para evaluar adecuadamente la bioenergética mitocondrial y el coeficiente del citocromo c para la integridad de la membrana mitocondrial, proporcionando una guía para los pasos de la evaluación del sistema de transporte de electrones mitocondrial (ETS) y el cálculo de los parámetros esenciales. Este estudio puede proporcionar herramientas para responder preguntas sobre mecanismos fisiopatológicos en los que está implicado el metabolismo del nervio ciático, como las neuropatías periféricas.

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Protocol

El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración de los sensores polarográficos de oxígeno se realizó antes de la disección y permeabilización del tejido nervioso ciático del ratón.

1. Preparación de reactivos

  1. Prepare el tampón de preservación de tejidos (TP Buffer).
    1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 10 mM de tampón de Ca-EGTA con 0,1 μM de calcio libre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TDT, 6,56 mM de MgCl2, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabla de Materiales), pH 7.1. Conservar a -20°C.
  2. Prepare el Mitochondria Respiration Buffer (MR Buffer).
    1. Preparar los siguientes reactivos en solución de agua ultrapura: 0,5 mM de K2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarosa, 1 mg/mL de BSA (libre de ácidos grasos) (ver Tabla de Materiales), pH 7.4. Conservar a -20 °C.
  3. Prepare la solución madre de saponina disolviendo 5 mg de saponina (ver Tabla de Materiales) en 1 ml de TP Buffer (paso 1.1) y manténgala en hielo. La saponina se prepara fresca.
  4. Preparar Amplex Red resuspendiendo el polvo (ver Tabla de Materiales) con DMSO para obtener una concentración de stock de 2 mM y almacenar a -20 °C en un vial protegido de la luz.
    NOTA: Para evitar el desgaste de la sonda por congelación y descongelación, haga pequeñas alícuotas para almacenamiento de no más de 6 meses25.

2. Calibración de sensores polarográficos de oxígeno para respirometría de alta resolución (HRR)

  1. Limpie las cámaras HRR del instrumento y las jeringas (consulte la Tabla de materiales).
    1. Abra las cámaras HRR, llene con agua destilada hasta la parte superior y revuelva durante 5 min 3x. Repetir con etanol y luego de nuevo con agua. Lave los tapones y las jeringas con agua/etanol/agua 3 veces cada uno.
  2. Aplique los siguientes ajustes de calibración en el software HRR (consulte la Tabla de materiales).
    1. En el control de software HRR, agregue la temperatura experimental (37 ° C), los parámetros para el sensor de oxígeno (ganancia, 2; voltaje de polarización, 800 mV) y para el sensor amperométrico (ganancia, 1000; voltaje de polarización, 100 mV).
  3. Calibrar los sensores de oxígeno.
    1. Pipetear 2,1 ml de tampón MR (paso 1,2) en cada cámara. Cierre con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 °C durante 1 h en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa sea estable.
    2. Realizar una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno en el software según el protocolo del fabricante24.
      NOTA: El paso de calibración solo se realiza una vez antes de un experimento. Se pueden realizar experimentos adicionales en el mismo medio de respiración y temperatura después de simplemente lavar las cámaras (paso 2.1).

3. Disección y permeabilización del nervio ciático

  1. Retire el nervio ciático siguiendo los pasos a continuación.
    1. Eutanasiar al animal por luxación cervical después de retirarlo de su jaula y sujetarlo suavemente para descansar en el banco.
    2. En el animal sacrificado, haga una incisión con tijeras en la parte baja de la espalda, comenzando cerca de la columna vertebral y avanzando por el muslo hacia el pie. Retire la piel y el músculo unidos al nervio, y luego corte y elimine todo el nervio ciático.
    3. Pesar el tejido inmediatamente y colocarlo en un vial lleno de tampón para la tuberculosis fría (4 °C). Realice los pasos 3.2-3.3 sobre hielo.
      NOTA: El peso del tejido húmedo se utiliza para normalizar el consumo de oxígeno y el flujo de producción de ROS en los siguientes pasos. Si el tejido no se puede pesar inmediatamente, consérvelo en Cold TB Buffer. El procedimiento se realiza en tejido fresco y no debe congelarse para evitar daños mitocondriales.
  2. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente TP Buffer para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps, y con otro par de fórceps, extraiga los haces nerviosos horizontalmente.
    NOTA: Este procedimiento debe realizarse en menos de 10 minutos para evitar el deterioro del tejido. El tejido estará listo cuando se pueda visualizar como capas de niebla transparentes, opuestas al tejido opaco blanco anterior (Figura 1).
  3. Primero, transfiera el tejido estirado a un plato pequeño que contenga 1 ml de TP Buffer para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a un plato que contenga 1 ml de TP Buffer y 10 μL de saponina (de la solución madre, paso 1.3).
    1. Agite en un agitador de microplacas suavemente durante 30 minutos, luego transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga MR Buffer (1 ml) y agite suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada.

4. Consumo de oxígeno y determinación de la producción de ROS

  1. Llene las cámaras HRR con 2,1 ml de MR Buffer, agregue Amplex Red (paso 1.4) a una concentración final de 5 μM y peroxidasa a 2 U / ml, y agregue el nervio ciático permeabilizado (paso 3).
    1. Conecte los sensores de fluorescencia del instrumento, apague las luces en la sección de control del software y presione Conectar al oxógrafo. En "protocolos de edición" en el software, inserte el peso del tejido medido en el paso 3.1.3.
  2. Vaya a "diseño", elija la opción "flujo específico por unidad de muestra" y seleccione Parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si lo desea, a la producción de H2O2 . Espere ~ 10 min.
    NOTA: Este tiempo es necesario para estabilizar el flujo basal del consumo de oxígeno sin sustrato añadido (basal). Antes de nuevas inyecciones, asegúrese de que el flujo de oxígeno esté estabilizado.
  3. Inyectar dos pulsos de H2O2, cada uno a una concentración final de 260 μM, para su posterior calibración en la cámara.
  4. Inyectar 20 μL de succinato (ver Tabla de Materiales), un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.
    NOTA: Se pueden agregar diferentes sustratos mitocondriales en este punto para evaluar la función mitocondrial mediante diferentes complejos. Los resultados representativos con sustratos variables para los complejos mitocondriales I y II se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. En este punto, se observa un aumento en el consumo de O2y la producción de H2 O 2, simultáneamente, en la Figura 3.
  5. Añadir 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para activar la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP).
    NOTA: ADP estimula la síntesis de ATP y reduce el potencial de membrana. Se espera observar un aumento en el consumo de O2y una disminución en la producción de H2 O2 2 26,27.
  6. En secuencia, agregue 5 μL de citocromo c (ver Tabla de Materiales) como indicador de la integridad de la membrana.
    NOTA: Si el tejido está bien preparado y permeabilizado, el citocromo c no debe aumentar el consumo de oxígeno en más del 15%. Si ocurre, consulte la sección de solución de problemas para obtener recomendaciones.
  7. Valorar con alícuotas de 0,2 μg/ml de oligomicina (ver Tabla de Materiales) hasta que no se observe una nueva disminución en el consumo de O2 .
    NOTA: La oligomicina actúa inhibiendo la síntesis de ATP dando lugar a una disminución en el flujo de O2 y una mejora en la formaciónde H2 O 2 favorecida por el alto potencial de membrana26,27.
  8. Valorar con alícuotas de 0,5 μmol/L de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) (ver Tabla de Materiales), el desacoplador mitocondrial, hasta que no sea posible observar más aumento en el consumo de O2 . Para finalizar el experimento, inyecte 2 μl de antimicina A a una concentración final de 5 μM y espere la estabilización del flujo.
    NOTA: Se observa una disminución en la producción de H2O2 debido a la disipación del potencial de membrana después de inyectar FCCP. La antimicina A inhibe el complejo III, impidiendo así el flujo de electrones. Por lo tanto, el consumo de O2 dependiente de las mitocondrias se ve afectado, disminuyendo el flujo de oxígeno por masa y estimulando la fuga de electrones, aumentandolaproducciónde H 2 O2 26,27.
  9. Vaya a la barra de comandos, busque "multisensorial" en el software, haga clic en Control > Guardar archivo y Desconectar.
    NOTA: La adición de otros sustratos e inhibidores se puede realizar de acuerdo con la pregunta en estudio. Un ejemplo se describe en los resultados representativos. La calibración H2O2 se realiza después de terminar el experimento, de acuerdo con el protocolo del fabricante28.
  10. Abra el archivo guardado y seleccione el rastro "Flujo de oxígeno por masa" para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno. Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones pulsando Mayús + Botón izquierdo del ratón.
    1. Vaya a Marcas > Estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustrato/inhibidores/protocolo desacoplado. Para la producción de H2O2 , realice el mismo procedimiento con el trazado "Amp-Slope".
      NOTA: Al seleccionar la ventana, evite los artefactos de las inyecciones de volumen eligiendo una ventana donde el oxígeno (o H2O2) sea más estable y constante. Los ejemplos de ventanas seleccionadas están representados por llaves negras en los resultados representativos (Figura 2 y Figura 3).

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Representative Results

El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O2 por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agrega una concentración saturante de ADP, activando la ATP sintasa e impulsando la fosforilación oxidativa. Esto resulta en un estado fosforilativo de la respiración mitocondrial. La respiración en estado fosforilativo significa que la ATP sintasa puede producir ATP a partir de ADP + Pi (fosfato inorgánico) utilizando el potencial de membrana formado por el gradiente de protones como una fuerza protón-motriz para generar ATP26. Con la disminución del potencial de membrana promovida por la actividad de la ATP sintasa, el consumo de oxígeno se acelera y se observa un aumento en el flujo de oxígeno. La adición de citocromo c exógeno (CYTC) promovió solo una estimulación mínima de la respiración, certificando la integridad de la membrana externa mitocondrial para esta preparación. La permeabilización de los tejidos puede dañar la integridad de la membrana y la pérdida del citocromo c. El aumento de las tasas de respiración de más del 10%-15% indica mitocondrias dañadas y una preparación inadecuada de los tejidos28,29. En este resultado representativo, hay un aumento del 8,7% en la respiración, lo que indica una buena calidad de la preparación del tejido (Tabla 1). La titulación con oligomicina (OLIGO) debe realizarse con dosis mínimas para evitar alcanzar una concentración de OLIGO que pueda interferir en la evaluación de la capacidad máxima30. La inhibición de la ATP sintasa por OLIGO - o la respiración de estado 4 por oligomicina26 - resultó en una disminución del flujo de consumo de oxígeno. La titulación con FCCP, un reactivo desacoplador mitocondrial, disipa el potencial de la membrana mitocondrial, estimulando el flujo respiratorio y mostrando la capacidad máxima para la transferencia de electrones (capacidad máxima ETS). Al final del experimento, se inyecta antimicina A (AA), un inhibidor del complejo III, para inhibir la respiración mitocondrial y registrar el consumo de oxígeno no mitocondrial (respiración residual) (Figura 2). Los flujos absolutos de oxígeno registrados en este experimento representativo se calculan en la Tabla 1.

La posibilidad de analizar el consumo de oxígeno mitocondrial simultáneamente con la producción reactiva de oxígeno (ROS) -determinada mediante la detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) por Amplex Red con sensores de fluorescencia- es una gran ventaja para determinar un perfil bioenergético y una herramienta estándar para la detección de disfunción mitocondrial en diversas patologías. La adición de diferentes sustratos para diferentes complejos para alimentar el ETS mitocondrial también puede proporcionar más información sobre los sitios específicos para la disfunción mitocondrial. La Figura 3 se muestra con la medición simultánea del consumo de oxígeno (Figura 3A) y la producción de ROS (Figura 3B) en presencia de diferentes sustratos que proporcionan combustible para el ETS. Después de registrar la respiración basal, se agrega piruvato + malato (PM) a la cámara como sustrato para el complejo mitocondrial I, aumentando el flujo del consumo de oxígeno. La adición de SUCC, el sustrato del complejo II, también aumenta la respiración, pero la adición adicional de palmitoil-carnitina (PC) no aumenta el flujo de oxígeno en comparación con las adiciones de sustrato anteriores, lo que sugiere que PM y SUCC ya pueden haber saturado el sitio mitocondrial de ubiquinona o una falta de oxidación de ácidos grasos. Como era de esperar, la producción de ROS también aumenta después de la adición de sustratos, lo que representa la fuga de oxígeno que escapa de ETS y forma ROS (Figura 3B, traza verde). La adición de ADP en la concentración de saturación aumenta el consumo de oxígeno, impulsando la formación de ATP (traza roja en la Figura 3A) y disminuyendo la producción de ROS (Figura 3B, traza verde). La adición de CYTC solo aumenta el flujo de oxígeno en un 6,8%, confirmando la integridad de la membrana mitocondrial. La titulación con OLIGO disminuye el flujo de consumo de oxígeno (traza roja en la Figura 3A) y aumenta la producción de ROS (traza verde en la Figura 3B). Los efectos ADP y OLIGO sugieren que el nervio ciático permeabilizado en este protocolo puede replicar la relación estándar en la fisiología mitocondrial, en la que un aumento en el consumo de oxígeno conduce a una disminución en el potencial de membrana e impide la producción de ROS31,32.

La adición de FCCP, como se espera para un desacoplador, aumenta el consumo de oxígeno a su velocidad máxima y, como resultado de la disipación del potencial de membrana, la producción de ROS disminuye. La adición de rotenona, un inhibidor de los complejos I y AA, reduce el consumo de oxígeno y aumenta la formación de ROS (Figura 3A, B), confirmando que se conservan la fisiología mitocondrial y el perfil bioenergético en el nervio ciático permeabilizado. Los valores absolutos para los flujos de oxígeno registrados en este experimento se calculan en la Tabla 2.

Figure 1
Figura 1: Preparación del nervio ciático para la permeabilización de las mitocondrias. Todos los procedimientos deben realizarse sobre hielo. (A) El nervio ciático se extrae de un ratón sacrificado y se coloca en una placa de Petri que contiene tampón de preservación de tejidos a 4 ° C. (B) Separación de los haces de nervios ciáticos con fórceps. (C,D) El tejido está listo cuando se disecciona en mechones translúcidos, en lugar de la estructura tubular opaca blanca (A) original. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultado representativo del consumo de oxígeno mitocondrial en el nervio ciático permeabilizado del ratón. El experimento es un rastro representativo de un extracto de nervio ciático de un ratón sacrificado. El nervio ciático se permeabilizó antes, como se describe en la sección de protocolo. Las inyecciones están indicadas como flechas en momentos específicos. SUCC: succinato; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; AA: antimicina A. Se muestra la concentración de oxígeno en tiempo real como [nmol/mL] (traza azul) y la tasa de consumo de oxígeno como flujo por unidad de masa [pmol/(s.mg)] (traza roja). Los brackets negros representan ventanas de las tasas de consumo de oxígeno seleccionadas para los resultados después de cada inyección. Basal se refiere a la respiración sin sustratos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El resultado del consumo de oxígeno mitocondrial acoplado a la producción de ROS en el nervio ciático de ratón permeabilizado. Se muestra un rastro representativo de un extracto de nervio ciático de un ratón sacrificado. El nervio ciático se permeabilizó antes, como se describe en la sección de protocolo. Las inyecciones están indicadas como flechas en momentos específicos. H2O2: peróxido de hidrógeno; PM: piruvato/malato; SUCC: succinato; PC: palmitoil-carnitina; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona; ROT: rotenona; AA: antimicina A. (A) Se muestra la concentración de oxígeno en tiempo real como [nmol/mL] (traza azul) y la tasa de consumo de oxígeno como flujo por unidad de masa [O2 pmol/(s.mg)] (traza roja). (B) La producción de ROS se demuestra como fluorescencia H2O2 (traza púrpura) y pendiente de producción H2O2 [pmol/(s.mg)] (traza verde), después de la calibración. Los brackets negros representan ventanas de las tasas de consumo de oxígeno seleccionadas para los resultados después de cada inyección. Basal se refiere a la respiración sin sustratos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sustratos Adiciones Tasa de consumo de oxígeno
Flujo por masa (pmol/[s.mg])
Basal (sin adición) ninguno 5.9
Succinato (SUCC) Una adición de 10 mM 16.9
ADP Una adición de 1 μM 28.5
Citocromo c (CYTC) Una adición de 10 μM 31
Oligomicina A (OLIGO) Valoración con adiciones de 0,2 μg/ml 21.9
FCCP Valoración con adiciones de 0,5 μM 31.1
Antimicina A (AA) Una adición de 5 μM 11.3

Tabla 1: Protocolo sustratos/desacoplador/inhibidores/titulación (SUIT) y resultados de las tasas de consumo de oxígeno en el nervio ciático permeabilizado de ratón. El consumo de oxígeno se representa en [O2pmol/(s.mg)], después de cada adición del protocolo SUIT. Los resultados se obtienen por el promedio de ventanas seleccionadas marcado en la Figura 2.

Sustratos Adiciones Consumo de oxígeno (O2 pmol/[s.mg]) Producción de ROS (H2O2 pmol/[s.mg])
Basal (sin adición) ninguno 5.77 0.53
Piruvato + Malato (PM) Un pulso de 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinato (SUCC) Una adición de 10 mM 14.06 0.75
Palmitoil carnitina (PC) Dos pulsos de 25 μM 14.68 0.79
ADP Una adición de 1 μM 22.9 0.25
Citocromo c (CYTC) Una adición de 10 μM 24.36 0.09
Oligomicina A (OLIGO) Valoración con adiciones de 0,2 μg/ml 17.03 0.5
FCCP Valoración con adiciones de 0,5 μM 23.98 0.16
Rotenona (ROT) Una adición de 1μM 19.75 0.48
Antimicina A (AA) Una adición de 5 μM 4.08 0.53

Tabla 2: Protocolo sustratos/desacoplador/inhibidores/titulación (SUIT) y resultados de la producción de ROS acoplado a las tasas de consumo de oxígeno del nervio ciático permeabilizado del ratón. El consumo de oxígeno está representado en [O2 pmol/(s.mg)] y la producción de ROS por [H2O2 pmol/(s.mg)] después de cada adición del protocolo SUIT. Los resultados se obtienen por el promedio de ventanas seleccionadas marcado en la Figura 3.

Parámetros para la función mitocondrial Cálculos a partir de las tasas de consumo de oxígeno
Respiración basal Respiración basal (flujo sin adición de sustratos)28
Consumo residual de oxígeno (ROX) [Flujo después de la adición de AA] 28
Complejo I fuga de respiración [Flujo después de la adición de PM] – [ROX]28,37
Respiración por fugas del Complejo II [Flujo después de la adición de SUCC] – [ROX]28,37
Estado fosforilativo ( capacidad de Oxphos) [Flujo después de la adición de ADP] – [ROX]28,43
Estado no fosforilativo (respiración por fugas) [Flujo después de la adición de oligomicina] – [ROX]28
Relación de control respiratorio [Estado fosforilativo / No -fosforilativo] 28,43
Capacidad de ETS [Flujo después de la adición de FCCP] – [ROX]28,37

Tabla 3: Cálculo de parámetros para la evaluación de la función mitocondrial en nervio ciático permeabilizado de ratón. Parámetros para la fórmula de evaluación de la fisiología mitocondrial por tasas de consumo de oxígeno.

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Discussion

Varias enfermedades o afecciones que acompañan a las neuropatías tienen la disfunción mitocondrial como factor de riesgo. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos es esencial para dilucidar cómo actúan las mitocondrias en estas condiciones neurodegenerativas. La evaluación de la función mitocondrial es laboriosa debido a la dificultad del método de aislamiento y la escasez de material. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de permeabilización tisular que no requieran el aislamiento de las mitocondrias es esencial.

Para evaluar la función mitocondrial en tejidos permeabilizados, es fundamental elegir una sustancia química que pueda permeabilizar la membrana plasmática celular sin interferir con la respiración celular. En los nervios periféricos como el nervio ciático, la composición de mielina es de aproximadamente el 70% de lípidos, la mayoría de los cuales son colesterol33,34. La elección de agentes permeabilizantes como la saponina y la digitonina que interactúan con las moléculas de colesterol da como resultado poros que permiten el acceso del sustrato a la maquinaria mitocondrial sin interferir con otros compartimentos celulares35,36. En este protocolo, el método bien establecido para la permeabilización de la fibra muscular por saponina descrito por Pesta y Gnaiger24 está adaptado para los nervios ciáticos. El procedimiento de permeabilización incluye otro paso crítico con respecto a la separación de tejidos para permitir el acceso de sustratos según sea necesario para registrar los parámetros mitocondriales de interés. El presente trabajo describe los pasos, y las ilustraciones se proporcionan para una separación satisfactoria de los tejidos en la Figura 1.

Los registros de frecuencia respiratoria mitocondrial son esenciales para establecer diferencias con respecto al mal funcionamiento de los complejos de mitocondrias, la alteración de la fosforilación oxidativa o las mitocondrias alteradas. Las afecciones respiratorias y los parámetros mitocondriales están definidos por Chance y Williams26. En este artículo, la respiración de rutina se define como la respiración basal cuando se registra el consumo de oxígeno mitocondrial sin adición de sustratos exógenos; capacidad de complejos: cuando se agregan sustratos para complejos I o II para alimentar el consumo de oxígeno mitocondrial, también denominado respiración por fuga; estado fosforilativo: cuando se agrega ADP en la secuencia de sustratos complejos e impulsa la síntesis de ATP; estado no fosforilativo: cuando todo el ADP se forma en ATP o con la adición de un inhibidor de la ATP sintasa, oligomicina (o estado 4); Capacidad máxima de ETS - cuando se agrega el desacoplador mitocondrial FCCP y; consumo de oxígeno residual (ROX) después de la adición de rotenona y antimicina A, cuando el consumo de oxígeno no está relacionado con las mitocondrias. La técnica descrita en este trabajo para la evaluación de la función mitocondrial en tejido nervioso ciático mediante HRR permite determinar numerosos estados respiratorios y calcular la función mitocondrial intrínseca dentro de una misma muestra. Los resultados de una prueba de protocolo de sustrato/desacoplamiento/inhibidores se pueden utilizar para derivar parámetros de la función mitocondrial a partir de los cuales se pueden calcular las relaciones/factores de control respiratorio37, como se demuestra en la Tabla 3. La evaluación de estos parámetros combina tasas de fuga absolutas, junto con la respiración mitocondrial máxima, y eleva los datos para un valor diagnóstico 24,35,36,37,38,39.

Aunque la disfunción mitocondrial en los nervios periféricos se cita en la literatura, existen limitaciones para demostrar estos parámetros. En un modelo de neuropatía inducida por quimioterapia, se observa una disminución del potencial de la membrana mitocondrial en el tratamiento con el agente quimioterapéutico, oxaliplatino, y una reducción de la actividad in vitro de los complejos I, II y III en los axones sensoriales del nervio periférico (nervio safeno)40,41. Sin embargo, existe una falta de información sobre el control ejercido por el potencial de membrana sobre las actividades de los complejos y la formación de ATP por fosforilación oxidativa, un parámetro esencial en la evaluación de la función mitocondrial. Además, en los nervios ciáticos disociados de ratas Sprague-Dawley permeabilizadas con digitonina, el registro del consumo de oxígeno solo se demuestra para el estado fosforilado, pero no se compara con el consumo de oxígeno en presencia de un inhibidor de la ATPasa o un desacoplador22. En el presente método, es posible calcular la relación de control respiratorio en el nervio permeabilizado (Tabla 3) en comparación con la relación de control respiratorio de las mitocondrias aisladas, generalmente calculada a partir del estado3/estado4 (o estado fosforilativo/no fosforilativo). Con el método proporcionado en este trabajo, es posible evaluar las capacidades complejas I, II - mantenimiento de la integridad de la membrana mitocondrial - y las relaciones de control de flujo, y lograr la máxima capacidad de respiración y el consumo de oxígeno residual.

En la literatura se describen diferentes métodos para la permeabilización del nervio ciático para la evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial. Una técnica para la permeabilización del nervio ciático se demuestra en un protocolo con tratamiento con saponina y permeabilización por pulso de vórtice; sin embargo, sólo se demostró el estado fosforilativo y la capacidad máxima41. Además, comparando los valores aquí presentados para los mismos parámetros, el flujo de oxígeno observado por Cooper et al.41 es un 70% menor, demostrando que existe daño a la membrana mitocondrial relacionado con el método de agitación. En el presente protocolo, la separación tisular preserva la integridad de la membrana mitocondrial, confirmada por el pequeño aumento en el flujo de oxígeno después de la adición del citocromo c. Esta es una característica que permite registrar todos los parámetros mitocondriales, proporcionando un registro completo de la fosforilación y función oxidativa mitocondrial. A pesar de que en un método de permeabilización del nervio ciático con colagenasa, los valores de flujo de oxígeno son comparables a los presentados aquí, se observa un aumento de casi el 20% después de agregar el citocromo c, lo que sugiere algún nivel de daño a la membrana mitocondrial21. Con el protocolo descrito en este artículo, se observó un aumento de solo el 6,3%-8,7% del flujo de oxígeno después de la adición del citocromo c, lo que confirma la ventaja del método actual para preservar la integridad de la membrana mitocondrial y optimizar el registro del consumo de oxígeno.

Las mitocondrias son el sitio primario de generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) asociadas con diversos procesos de señalización en el tejido nervioso ciático y mecanismos relacionados con la fisiopatología en neuropatías42,43. Este protocolo permitió acceder a la generación de peróxido de hidrógeno con un sensor de fluorescencia simultáneamente con el consumo de oxígeno. Como se observa en la Figura 3, la producción de ROS es sensible a las alteraciones de los estados respiratorios mitocondriales, confirmando el estado de integridad mitocondrial y optimizando el registro de la función mitocondrial.

Otros métodos, como el analizador de flujo extracelular (EFA), basado en sensores de fluorescencia para registrar el consumo de oxígeno, pueden evaluar la función mitocondrial del nervio periférico en células cultivadas, como células de Schwann o axones, en un dispositivo automatizado de detección de alto rendimiento. Sin embargo, hay algunas ventajas en el uso de sensores polarográficos como HRR, incluyendo en particular la capacidad de seguir el experimento en tiempo real, para hacer múltiples inyecciones de sustratos / inhibidores; por lo tanto, esto permite la evaluación de un mayor número de funciones complejas en las mitocondrias en un experimento, y el menor costo de los consumibles 24,35,38,39. Una desventaja del uso de HRR en comparación con EFA es la ausencia de un sensor para la acidificación de medios (para el análisis del flujo glicolítico) y la capacidad limitada del flujo de trabajo, que permite el uso de solo dos muestras a la vez.

Las limitaciones de las técnicas de permeabilización tisular requeridas para la HRR son bien conocidas. Incluyen la incapacidad de evaluar las mitocondrias cuando la ADP es limitante y una frecuencia respiratoria desacoplada reducida en comparación con las mitocondrias aisladas. Sin embargo, el protocolo de permeabilización del nervio ciático de saponina descrito aquí, como una adaptación del protocolo de permeabilización de la fibra muscular por Pesta y Gnaiger24 , permite la evaluación de los estados respiratorios mitocondriales y los parámetros mitocondriales sin dañar la integridad mitocondrial. También permite registrar simultáneamente el consumo de oxígeno y la producción de ROS en el nervio ciático, un tejido con notorias limitaciones para aislar las mitocondrias. Por lo tanto, este protocolo permite una mejor evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos y puede proporcionar ventajas a los investigadores en la investigación de los roles mitocondriales en las condiciones fisiopatológicas que afectan a los nervios periféricos.

Solución de problemas
Si hay un aumento en el consumo de O2 después de agregar citocromo c a más del 15% del flujo de consumo de oxígeno, indica que el procedimiento de permeabilización fue muy fuerte y causó daño a la estructura mitocondrial. Si ese es el caso, descarte y reinicie la disección con una separación nerviosa más suave y repita los pasos. Si algunos reactivos inyectados no demuestran el efecto esperado en el consumo de oxígeno de las mitocondrias o en la producción de H2O2 , probablemente se deba a la contaminación de la cámara con inhibidores mitocondriales. En este caso, se pueden tomar dos acciones: (1) reiniciar el experimento después de lavar las cámaras y jeringas (paso 2.1) o (2) agregar una muestra de cualquier mitocondria aislada de tejido u homogeneizar antes de realizar el paso 2.1. Las adiciones de estas muestras absorberán los inhibidores mitocondriales y mejorarán el paso de limpieza.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por el Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Agradecemos al Dr. Antonio Galina Filho, a la Dra. Mónica Montero Lomeli y al Dr. Claudio Masuda por el apoyo con las instalaciones del laboratorio, y a la Dra. Martha Sorenson por los amables y valiosos comentarios para mejorar el artículo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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Bioquímica Número 183
Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución
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Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

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