Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Abstract

Mitochondriale disfunctie in perifere zenuwen gaat gepaard met verschillende ziekten geassocieerd met perifere neuropathie, die kan worden veroorzaakt door meerdere oorzaken, waaronder auto-immuunziekten, diabetes, infecties, erfelijke aandoeningen en tumoren. Het beoordelen van de mitochondriale functie in perifere zenuwen van muizen kan een uitdaging zijn vanwege de kleine steekproefomvang, een beperkt aantal mitochondriën in het weefsel en de aanwezigheid van een myelineschede. De techniek die in dit werk wordt beschreven, minimaliseert deze uitdagingen door een uniek permeabilisatieprotocol te gebruiken dat is aangepast aan een protocol dat wordt gebruikt voor spiervezels, om de mitochondriale functie van de heupzenuw te beoordelen in plaats van de mitochondriën uit het weefsel te isoleren. Door de productie van fluorimetrische reactieve soorten te meten met Amplex Red / Peroxidase en verschillende mitochondriale substraten en remmers in saponine-permeabilized zenuwen te vergelijken, was het mogelijk om mitochondriale ademhalingstoestanden, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de activiteit van mitochondriale complexen tegelijkertijd te detecteren. Daarom biedt de hier gepresenteerde methode voordelen in vergelijking met de beoordeling van de mitochondriale functie door andere technieken.

Introduction

Mitochondriën zijn essentieel voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen en voeren tal van celfuncties uit, zoals energiemetabolisme (glucose-, aminozuur-, lipide- en nucleotidemetabolismeroutes). Als de primaire plaats van productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), staan mitochondriën centraal in verschillende celsignaleringsprocessen zoals apoptose en nemen ze deel aan de synthese van ijzer-zwavel (Fe-S) clusters, mitochondriale eiwitimport en -rijping, en onderhoud van hun genoom en ribosomen 1,2,3. Het mitochondriale membraandynamicanetwerk wordt gecontroleerd door fusie- en splijtingsprocessen en ze hebben ook machines voor kwaliteitscontrole en mitofagie 4,5,6.

Mitochondriale disfunctie wordt geassocieerd met het verschijnen van verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, diabetes en obesitas7. Verstoringen in de mitochondriale functie worden gedetecteerd bij neurodegeneratieve aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals bij de ziekte van Alzheimer 8,9, de ziekte van Parkinson10,11, amyotrofische laterale sclerose12,13 en de ziekte van Huntington14,15 . In het perifere zenuwstelsel wordt verlies van mitochondriale functie in axonen waargenomen bij immuunneuropathieën, zoals Guillain-Barré-syndroom16,17, en in combinatie met een hoge mitochondriale ROS-productie in axonen leiden deze gebeurtenissen tot MAP Kinase-activering in Schwann-cellen18. Dit toont aan dat mitochondriale fysiologie niet alleen essentieel kan zijn voor een plaatsspecifieke cel, maar voor een heel weefsel. Bij HIV-geassocieerde distale sensorische polyneuropathie (HIV-DSP) spelen mitochondriën een rol in het mechanisme waarmee het trans-activator van transcriptie (HIV-TAT) eiwit HIV in staat stelt zich efficiënt te repliceren, evenals verschillende andere rollen in hiv-infectie pathogenese19,20.

Evaluatie van de mitochondriale fysiologie van de heupzenuw is naar voren gekomen als een essentieel doelwit voor het onderzoeken van neuropathie 7,21,22. Bij diabetische neuropathie suggereren proteomische en metabolomische analyses dat de meeste moleculaire veranderingen in diabetes de mitochondriale oxidatieve fosforylering van de heupzenuw en het lipidenmetabolisme beïnvloeden7. Deze veranderingen lijken ook vroege tekenen te zijn van door obesitas veroorzaakte diabetes21. In een muismodel van door chemotherapie geïnduceerde pijnlijke neuropathie wordt mitochondriale stoornissen in de heupzenuw gedetecteerd als een afname van oxidatieve fosforylering22 en een vermindering van mitochondriale complexenactiviteiten, membraanpotentiaal en ATP-gehalte23. Hoewel verschillende groepen mitochondriale disfunctie in neuropathieën hebben aangehaald, zijn deze studies beperkt tot de metingen van activiteit in mitochondriale complexen zonder behoud van de mitochondriale membranen, zonder evaluatie van mitochondriale integriteit of metingen van ATP-inhoud als parameter voor mitochondriale ATP-productie. Over het algemeen vereist een goede beoordeling van mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie de isolatie van mitochondriën door differentiële centrifugatie in een percoll / sucrosegradiënt. Isolatie van mitochondriën kan ook een beperkende factor zijn voor ischiaszenuwweefsel vanwege de grote hoeveelheid weefsel die nodig is en mitochondriaal verlies en verstoring.

De huidige studie heeft tot doel een protocol te bieden om mitochondriale fysiologie te meten als mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie in de heupzenuw, met behoud van mitochondriale membranen en zonder de noodzaak van isolerende mitochondriën. Dit protocol is aangepast van zuurstofverbruiksmetingen in gepermeabiliseerde spiervezels24 door middel van hoge resolutie respirometrie (HRR). De voordelen van deze procedure zijn de mogelijkheid om mitochondriën in kleine hoeveelheden weefsel zoals de heupzenuw te evalueren en mitochondriale parameters in situ te evalueren, waardoor de mitochondriale omgeving, structuur en bio-energetisch profiel behouden blijven, om een fysiologisch betrouwbaar resultaat te verkrijgen. De mitochondriale ademhalingstoestanden werden bepaald met substraten en remmers na ischiaszenuwpermeabilisatie om mitochondriale bio-energetica en cytochroom c-coëfficiënt voor mitochondriale membraanintegriteit goed te beoordelen, wat een gids biedt voor stappen van de mitochondriale elektronentransportsysteem (ETS) evaluatie en berekening van essentiële parameters. Deze studie kan hulpmiddelen bieden voor het beantwoorden van vragen in pathofysiologische mechanismen waarbij het metabolisme van de heupzenuw betrokken is, zoals perifere neuropathieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren in onderzoek, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) en de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De heupzenuw wordt geïsoleerd van vier maanden oude mannelijke C57BL / 6-muizen, geëuthanaseerd door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen. De protocolstappen zijn geoptimaliseerd om mitochondriale achteruitgang te voorkomen. Daarom werd in dit protocol kalibratie van polarografische zuurstofsensoren uitgevoerd voorafgaand aan de dissectie en permeabilisatie van heupzenuwweefsel bij muizen.

1. Bereiding van reagentia

  1. Bereid de Tissue Preservation Buffer (TP Buffer) voor.
    1. Bereid de volgende reagentia in ultraruur wateroplossing: 10 mM Ca-EGTA-buffer met 0,1 μM vrij calcium, 20 mM imidazol, 20 mM taurine, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM fosfocreatine (zie Materiaaltabel), pH 7,1. Bewaren bij -20°C.
  2. Bereid de mitochondriale ademhalingsbuffer (MR-buffer) voor.
    1. Bereid de volgende reagentia in ultrapuur wateroplossing: 0,5 mM K2EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM MES, 20 mM taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sucrose, 1 mg/ml BSA (vetzuurvrij) (zie Materiaaltabel), pH 7,4. Bewaren bij -20 °C.
  3. Bereid saponine stockoplossing door 5 mg saponine (zie tabel met materialen) op te lossen in 1 ml TP-buffer (stap 1.1) en houd het op ijs. Saponine wordt vers bereid.
  4. Bereid Amplex Red door het poeder (zie materiaaltabel) te resuspenderen met DMSO om een voorraadconcentratie van 2 mM te verkrijgen en bewaar het bij -20 °C in een injectieflacon beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de sonde verslijt door invriezen en ontdooien, maakt u kleine aliquots voor opslag niet langer dan 6 maanden25.

2. Kalibratie van polarografische zuurstofsensoren voor hoge resolutie respirometrie (HRR)

  1. Reinig de HRR-kamers van het instrument en de spuiten (zie materiaaltabel).
    1. Open HRR-kamers, vul met gedestilleerd water tot aan de bovenkant en roer gedurende 5 minuten 3x. Herhaal met ethanol en dan nogmaals met water. Wasstoppers en spuiten met water/ethanol/water 3x per stuk.
  2. Pas de volgende kalibratie-instellingen toe in de HRR-software (zie Materiaaltabel).
    1. Voeg in HRR-softwarebesturing de experimentele temperatuur (37 °C), de parameters voor zuurstofsensor (versterking, 2; polarisatiespanning, 800 mV) en voor amperometrische sensor (versterking, 1000; polarisatiespanning, 100 mV) toe.
  3. Kalibreer de zuurstofsensoren.
    1. Pipetteer 2,1 ml MR-buffer (stap 1.2) in elke kamer. Sluit met de stoppen en zuig lucht in de kamer totdat er een bel is gevormd. Roer bij 37 °C gedurende 1 uur in de kalibratiemodus totdat de zuurstofflux per massa stabiel is.
    2. Voer een luchtkalibratie uit van de polarografische zuurstofsensoren in de software volgens het protocol van de fabrikant24.
      OPMERKING: De kalibratiestap wordt slechts één keer vóór een experiment uitgevoerd. Aanvullende experimenten in hetzelfde ademhalingsmedium en dezelfde temperatuur kunnen worden uitgevoerd na alleen het wassen van kamers (stap 2.1).

3. Dissectie en permeabilisatie van de heupzenuw

  1. Verwijder de heupzenuw volgens de onderstaande stappen.
    1. Euthanaseer het dier door cervicale dislocatie na verwijdering uit zijn kooi en voorzichtig vastgehouden om op de bank te rusten.
    2. Maak bij het geëuthanaseerde dier een incisie met een schaar in de onderrug, beginnend bij de wervelkolom en langs de dij naar de voet. Verwijder huid en spieren die aan de zenuw zijn bevestigd en snijd en verwijder vervolgens de hele heupzenuw.
    3. Weeg het weefsel onmiddellijk en plaats het in een injectieflacon gevuld met koude TB-buffer (4 °C). Voer stap 3.2-3.3 uit op ijs.
      OPMERKING: Het gewicht van het natte weefsel wordt gebruikt om het zuurstofverbruik en de ROS-productiestroom in de volgende stappen te normaliseren. Als het weefsel niet onmiddellijk kan worden gewogen, bewaar het dan in koude TB Buffer. De procedure wordt uitgevoerd in vers weefsel en mag niet worden ingevroren om mitochondriale schade te voorkomen.
  2. Plaats voor de weefselvoorbereiding de heupzenuw in een petrischaaltje met voldoende TP-buffer om het te bedekken. Houd het ene uiteinde van de zenuw vast met een tang en trek met een ander paar tangen de zenuwbundels horizontaal uit.
    OPMERKING: Deze procedure moet in minder dan 10 minuten worden uitgevoerd om weefselverslechtering te voorkomen. Het weefsel zal klaar zijn wanneer het kan worden gevisualiseerd als transparante mistige lagen, tegenover het vorige witte ondoorzichtige weefsel (figuur 1).
  3. Breng eerst het gespreide weefsel over in een kleine schaal met 1 ml TP-buffer voor weefselpermeabilisatie. Om de permeabilisatie te starten, brengt u het weefsel met een tang over naar een schaal met 1 ml TP-buffer en 10 μl saponine (uit voorraadoplossing, stap 1.3).
    1. Schud in een microplate shaker voorzichtig gedurende 30 minuten, breng het weefsel vervolgens met een tang over naar een verse schaal met MR Buffer (1 ml) en schud voorzichtig gedurende 10 minuten. Breng het weefsel met een tang over naar een gekalibreerde HRR-kamer.

4. Bepaling van het zuurstofverbruik en de ROS-productie

  1. Vul de HRR-kamers met 2,1 ml MR-buffer, voeg Amplex Red (stap 1.4) toe aan een eindconcentratie van 5 μM en peroxidase tot 2 U/ml en voeg de permeabiliseerde heupzenuw toe (stap 3).
    1. Bevestig de fluorescentiesensoren van het instrument, schakel de lichten uit in het besturingsgedeelte van de software en druk op Verbinden met oxygraph. In "bewerkingsprotocollen" in de software voegt u het weefselgewicht in dat is gemeten in stap 3.1.3.
  2. Ga naar "lay-out", kies de optie "specifieke flux per eenheid monster" en selecteer Plots om tegelijkertijd toegang te krijgen tot de uitlezing van het zuurstofverbruik en, indien gewenst, de H2O2-productie . Wacht ~10 min.
    OPMERKING: Deze tijd is nodig om de basale stroom van zuurstofverbruik te stabiliseren zonder toegevoegd substraat (basaal). Zorg er voordat u verder injectiet voor dat de zuurstofstroom is gestabiliseerd.
  3. Injecteer twee pulsen van H2O2, elk tot een eindconcentratie van 260 μM, voor latere kalibratie in de kamer.
  4. Injecteer 20 μL succinaat (zie Tabel van Materialen), een mitochondriaal complex II substraat, om het mitochondriale elektronentransportsysteem te activeren.
    OPMERKING: Verschillende mitochondriale substraten kunnen op dit punt worden toegevoegd om de mitochondriale functie door verschillende complexen te evalueren. Representatieve resultaten met verschillende substraten voor mitochondriale complexen I en II zijn weergegeven in figuur 2 en figuur 3. Op dit punt wordt tegelijkertijd een toename van het O2-verbruik en de productievan H2 O 2 waargenomen in figuur 3.
  5. Voeg 20 μL adenosinedifosfaat (ADP) toe om de synthese van adenosinetrifosfaat (ATP) te activeren.
    OPMERKING: ADP stimuleert de ATP-synthese en vermindert het membraanpotentiaal. Een toename van het O2-verbruik en een afname van de productie van H2O2 zullen naar verwachting worden waargenomen26,27.
  6. Voeg achtereenvolgens 5 μL cytochroom c toe (zie Tabel met materialen) als indicator voor de membraanintegriteit.
    OPMERKING: Als het weefsel goed is voorbereid en doorlaatbaar, mag cytochroom c het zuurstofverbruik niet met meer dan 15% verhogen. Als dit gebeurt, raadpleegt u het gedeelte probleemoplossing voor aanbevelingen.
  7. Titreer met aliquots van 0,2 μg/ml oligomycine (zie materiaaltabel) totdat er geen verdere afname van het O2-verbruik wordt waargenomen.
    OPMERKING: Oligomycine werkt door atp-synthese te remmen, wat leidt tot een afname van de O2-stroom en een verbetering van de H2O2-formatie die de voorkeur geniet van het hoge membraanpotentiaal26,27.
  8. Titreer met aliquots van 0,5 μmol/L carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP) (zie Materiaaltabel), de mitochondriale ontkoppelaar, totdat het mogelijk is om geen verdere toename van het O2-verbruik waar te nemen. Om het experiment te voltooien, injecteert u 2 μl antimycine A tot een eindconcentratie van 5 μM en wacht u op stroomstabilisatie.
    OPMERKING: Een afname van de productie van H2O2 wordt waargenomen als gevolg van de potentiële dissipatie van het membraan na het injecteren van FCCP. Antimycine A remt complex III, waardoor de stroom van elektronen wordt voorkomen. Daarom is het mitochondriale afhankelijke O2-verbruik verminderd, waardoor de zuurstofflux per massa afneemt en elektronenlekkage wordt gestimuleerd, waardoor de productie van H2O2 26,27 toeneemt.
  9. Ga naar de opdrachtbalk, zoek naar "multisensorisch" in de software, klik op Control > Save file en Disconnect.
    OPMERKING: De toevoeging van andere substraten en remmers kan worden uitgevoerd volgens de vraag die wordt bestudeerd. Een voorbeeld wordt beschreven in de representatieve resultaten. H2O2 kalibratie wordt uitgevoerd na het beëindigen van het experiment, volgens het protocol van de fabrikant28.
  10. Open het opgeslagen bestand en selecteer het traceren van de "Zuurstofflux per massa" om de resultaten van het experimentele zuurstofverbruik te verkrijgen. Selecteer handmatig het venster tussen injecties door op Shift + Linkermuisknop te drukken.
    1. Ga naar Marks > Statistics om de resultaten voor elke injectie van substraat/remmers/ontkoppeld protocol te visualiseren. Voer voor H2O2-productie dezelfde procedure uit met het traceer "Amp-Slope".
      OPMERKING: Vermijd bij het selecteren van het venster artefacten van volume-injecties door een venster te kiezen waar zuurstof (of H2O2) stabieler en constanter is. Voorbeelden van geselecteerde vensters worden weergegeven door zwarte accolades in de representatieve resultaten (figuur 2 en figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het mitochondriale zuurstofverbruik door de gepermeabiliseerde heupzenuw is weergegeven in figuur 2. Het rode spoor vertegenwoordigt de O2 flux per massa-eenheid in pmol/s.mg. Na het registreren van een basaal zuurstofverbruik met endogene substraten (routinematige ademhaling), wordt succinaat (SUCC) geïnjecteerd om complexe II (succinaatdehydrogenase) aangedreven ademhaling te registreren, wat resulteert in een toename van het zuurstofverbruik. In volgorde wordt een verzadigingsconcentratie van ADP toegevoegd, waardoor ATP-synthase wordt geactiveerd en oxidatieve fosforylering wordt gestimuleerd. Dit resulteert in een fosforylatieve toestand van mitochondriale ademhaling. Fosforylatieve toestandsademhaling betekent dat ATP-synthase ATP kan produceren uit ADP + Pi (anorganisch fosfaat) met behulp van de membraanpotentiaal gevormd door de protongradiënt als een proton-aandrijfkracht om ATP26 te genereren. Met de afname van het membraanpotentieel bevorderd door ATP-synthaseactiviteit, wordt het zuurstofverbruik versneld en wordt een toename van de zuurstofstroom waargenomen. De toevoeging van exogene cytochroom c (CYTC) bevorderde slechts minimale stimulatie van de ademhaling, waardoor de mitochondriale buitenmembraanintegriteit voor dit preparaat werd gecertificeerd. Permeabilisatie van weefsels kan de membraanintegriteit en het verlies van cytochroom c. beschadigen. Verhoogde ademhalingssnelheden van meer dan 10% -15% wijzen op beschadigde mitochondriën en onvoldoende weefselvoorbereiding28,29. In dit representatieve resultaat is er een toename van 8,7% in de ademhaling, wat wijst op een goede kwaliteit van het weefselpreparaat (tabel 1). De titratie met oligomycine (OLIGO) moet worden uitgevoerd met minimale doses om te voorkomen dat een concentratie oligo wordt bereikt die kan interfereren met de maximale capaciteitsevaluatie30. Remming van ATP-synthase door OLIGO - of toestand 4 ademhaling door oligomycine26 - resulteerde in een verminderde zuurstofconsumptiestroom. Titratie met FCCP, een mitochondriaal uncoupler-reagens, dissipeert mitochondriaal membraanpotentiaal, stimuleert de ademhalingsflux en toont de maximale capaciteit voor elektronenoverdracht (maximale ETS-capaciteit). Aan het einde van het experiment wordt antimycine A (AA), een remmer van complex III, geïnjecteerd om mitochondriale ademhaling te remmen en om niet-mitochondriaal zuurstofverbruik (resterende ademhaling) te registreren (figuur 2). De absolute zuurstofstromen die in dit representatieve experiment zijn geregistreerd, zijn berekend in tabel 1.

De mogelijkheid om mitochondriaal zuurstofverbruik gelijktijdig met reactieve zuurstofproductie (ROS) te analyseren - bepaald door waterstofperoxide (H2O2) door Amplex Red met fluorescentiesensoren te detecteren - is een groot voordeel voor het bepalen van een bio-energetisch profiel en een standaard hulpmiddel voor de detectie van mitochondriale disfunctie in verschillende pathologieën. De toevoeging van verschillende substraten voor verschillende complexen om mitochondriaal ETS van brandstof te voorzien, kan ook meer informatie opleveren over de specifieke locaties voor mitochondriale disfunctie. Figuur 3 wordt getoond met gelijktijdige meting van het zuurstofverbruik (figuur 3A) en de ROS-productie (figuur 3B) in aanwezigheid van verschillende substraten die brandstof leveren voor het ETS. Na het registreren van basale ademhaling wordt pyruvaat + malaat (PM) aan de kamer toegevoegd als substraat voor mitochondriaal complex I, waardoor de zuurstofverbruiksflux toeneemt. De toevoeging van SUCC, het substraat van complex II, verhoogt ook de ademhaling, maar verdere toevoeging van palmitoyl-carnitine (PC) verhoogt de zuurstofstroom niet in vergelijking met de eerdere substraattoevoegingen, wat suggereert dat PM en SUCC de mitochondriale ubiquinonplaats of een gebrek aan oxidatie van vetzuren al hebben verzadigd. Zoals verwacht neemt de ROS-productie ook toe na de toevoeging van substraten, wat het zuurstoflek vertegenwoordigt dat uit ETS ontsnapt en ROS vormt (figuur 3B, groen spoor). De toevoeging van ADP in de verzadigingsconcentratie verhoogt het zuurstofverbruik, waardoor ATP-vorming wordt gestimuleerd (rood spoor in figuur 3A) en de ROS-productie afneemt (figuur 3B, groen spoor). De toevoeging van CYTC verhoogt slechts de zuurstofstroom met 6,8%, wat de mitochondriale membraanintegriteit bevestigt. Titratie met OLIGO vermindert de zuurstofverbruiksstroom (rood spoor in figuur 3A) en verhoogt de ROS-productie (groen spoor in figuur 3B). ADP- en OLIGO-effecten suggereren dat gepermeabiliseerde heupzenuw in dit protocol de standaardrelatie in de mitochondriale fysiologie kan repliceren, waarbij een toename van het zuurstofverbruik leidt tot een afname van het membraanpotentieel en de ROS-productie voorkomt31,32.

De toevoeging van FCCP, zoals verwacht voor een ontkoppelaar, verhoogt het zuurstofverbruik tot zijn maximale snelheid, en als gevolg van membraanpotentiaaldissipatie wordt de ROS-productie verlaagd. De toevoeging van rotenon, een remmer van complex I en AA, vermindert het zuurstofverbruik en verhoogt de ROS-vorming (figuur 3A, B), wat bevestigt dat mitochondriale fysiologie en bio-energetisch profiel in de permeabiliseerde heupzenuw behouden blijven. De absolute waarden voor de zuurstofstromen die in dit experiment zijn geregistreerd, zijn berekend in tabel 2.

Figure 1
Figuur 1: Ischiaszenuwvoorbereiding voor permeabilisatie van mitochondriën. Alle procedures moeten op ijs worden uitgevoerd. (A) De heupzenuw wordt geëxtraheerd uit een geëuthanaseerde muis en geplaatst in een petrischaal met weefselconserveringsbuffer bij 4 °C. (B) Scheiding van heupzenuwbundels met een tang. (C,D) Het weefsel is klaar wanneer het wordt ontleed in doorschijnende plukjes, in plaats van de oorspronkelijke witte ondoorzichtige buisstructuur (A). Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatief resultaat van mitochondriaal zuurstofverbruik in de permeabiliseerde heupzenuw van de muis. Het experiment is een representatief spoor van één heupzenuwextract van een geëuthanaseerde muis. De heupzenuw was eerder gepermeabiliseerd, zoals beschreven in de protocolsectie. Injecties worden op specifieke tijdstippen als pijlen aangegeven. SUCC: succinaat; ADP: adenosinedifosfaat; Cyt c: cytochroom c; OLIGO: oligomycine; FCCP: carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; AA: antimycine A. Real-time zuurstofconcentratie als [nmol/ml] (blauw spoor) en zuurstofverbruik als flux per massa-eenheid [pmol/(s.mg)] (rood spoor) worden weergegeven. Zwarte beugels vertegenwoordigen vensters van zuurstofverbruik die na elke injectie zijn geselecteerd voor resultaten. Basaal verwijst naar ademhaling zonder substraten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Het resultaat van mitochondriaal zuurstofverbruik gekoppeld aan ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw van de muis. Een representatief spoor van één heupzenuwextract van een geëuthanaseerde muis wordt getoond. De heupzenuw was eerder gepermeabiliseerd, zoals beschreven in de protocolsectie. Injecties worden op specifieke tijdstippen als pijlen aangegeven. H2O2: waterstofperoxide; PM: pyruvaat/malaat; SUCC: succinaat; PC: palmitoyl-carnitine; ADP: adenosinedifosfaat; Cyt c: cytochroom c; OLIGO: oligomycine; FCCP: carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; ROT: rotenon; AA: antimycine A. (A) Real-time zuurstofconcentratie als [nmol/ml] (blauw spoor) en zuurstofverbruik als flux per massa-eenheid [O2 pmol/(s.mg)] (rood spoor) worden weergegeven. B) De ROS-productie wordt na kalibratie gedemonstreerd als H2O2 fluorescentie(paars spoor) en H2 O 2-productiehelling [pmol/(s.mg)] (groen spoor). Zwarte beugels vertegenwoordigen vensters van zuurstofverbruik die na elke injectie zijn geselecteerd voor resultaten. Basaal verwijst naar ademhaling zonder substraten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Substraten Toevoegingen Zuurstofverbruik
Flux per massa (pmol/[s.mg])
Basaal (geen toevoeging) geen 5.9
Succinaat (SUCC) Eén toevoeging van 10 mM 16.9
Adp Eén toevoeging van 1 μM 28.5
Cytochroom c (CYTC) Eén toevoeging van 10 μM 31
Oligomycine A (OLIGO) Titratie met toevoegingen van 0,2 μg/ml 21.9
Fccp Titratie met toevoegingen van 0,5 μM 31.1
Antimycine A (AA) Eén toevoeging van 5 μM 11.3

Tabel 1: Substraten/Ontkoppelaar/Remmers/Titratie (SUIT) protocol en resultaten van zuurstofverbruik in muis gepermeabiliseerde heupzenuw. Het zuurstofverbruik wordt weergegeven in [O2pmol/(s.mg)], na elke toevoeging van het SUIT-protocol. De resultaten worden verkregen door het gemiddelde van de geselecteerde vensters die in figuur 2 zijn gemarkeerd.

Substraten Toevoegingen Zuurstofverbruik (O2 pmol/[s.mg]) ROS Productie (H2O2 pmol/[s.mg])
Basaal (geen toevoeging) geen 5.77 0.53
Pyruvaat + Malaat (PM) Eén puls van 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinaat (SUCC) Eén toevoeging van 10 mM 14.06 0.75
Palmitoyl carnitine (PC) Twee pulsen van 25 μM 14.68 0.79
Adp Eén toevoeging van 1 μM 22.9 0.25
Cytochroom c (CYTC) Eén toevoeging van 10 μM 24.36 0.09
Oligomycine A (OLIGO) Titratie met toevoegingen van 0,2 μg/ml 17.03 0.5
Fccp Titratie met toevoegingen van 0,5 μM 23.98 0.16
Rotenon (ROT) Eén toevoeging van 1μM 19.75 0.48
Antimycine A (AA) Eén toevoeging van 5 μM 4.08 0.53

Tabel 2: Substraten/Uncoupler/Inhibitors/Titratie (SUIT) protocol en resultaten van ROS productie gekoppeld aan zuurstofverbruikssnelheden muis gepermeabiliseerde heupzenuw. Het zuurstofverbruik wordt in [O2 pmol/(s.mg)] en ROS productie weergegeven door [H2O2 pmol/(s.mg)] na elke toevoeging van het SUIT-protocol. De resultaten worden verkregen door het gemiddelde van de geselecteerde vensters die in figuur 3 zijn gemarkeerd.

Parameters voor mitochondriale functie Berekeningen op basis van zuurstofverbruik
Basale ademhaling Basale ademhaling (flux zonder toevoeging van substraten)28
Resterend zuurstofverbruik (ROX) [Flux na toevoeging van AA] 28
Complex I lek ademhaling [Flux na toevoeging van PM] – [ROX]28,37
Complex II lekademhaling [Flux na toevoeging van SUCC] – [ROX]28,37
Fosforylatieve toestand ( Oxphos capaciteit) [Flux na toevoeging van ADP] – [ROX]28,43
Niet-fosforylatieve toestand (lekademhaling) [Flux na toevoeging van oligomycine] – [ROX]28
Respiratoire controle ratio [Fosforylatieve toestand / Niet-fosforylatief] 28,43
ETS-capaciteit [Flux na toevoeging van FCCP] – [ROX]28,37

Tabel 3: Parameters berekening voor evaluatie van mitochondriale functie in muis gepermeabiliseerde heupzenuw. Parameters voor mitochondriale fysiologie evaluatie formule door zuurstofverbruik tarieven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verschillende ziekten of aandoeningen die gepaard gaan met neuropathieën hebben mitochondriale disfunctie als risicofactor. De evaluatie van de mitochondriale functie in perifere zenuwen is essentieel om op te helderen hoe de mitochondriën werken in deze neurodegeneratieve aandoeningen. De beoordeling van de mitochondriale functie is bewerkelijk vanwege de moeilijkheid van de isolatiemethode en de schaarste aan materiaal. De ontwikkeling van weefselpermeabilisatietechnieken die geen isolatie van mitochondriën vereisen, is dus essentieel.

Om de mitochondriale functie in gepermeabiliseerde weefsels te evalueren, is het van cruciaal belang om een chemische stof te kiezen die het celplasmamembraan kan doordringen zonder de celademhaling te verstoren. In perifere zenuwen zoals de heupzenuw is de myelinesamenstelling ongeveer 70% lipide, waarvan de meeste cholesterol33,34 zijn. De keuze van permeabiliserende middelen zoals saponine en digitonine die interageren met cholesterolmoleculen resulteert in poriën die substraattoegang tot mitochondriale machines mogelijk maken zonder te interfereren met andere cellulaire compartimenten35,36. In dit protocol is de gevestigde methode voor spiervezelpermeabilisatie door saponine beschreven door Pesta en Gnaiger24 aangepast voor de heupzenuwen. De permeabilisatieprocedure omvat nog een kritieke stap met betrekking tot weefselscheiding om toegang tot substraten mogelijk te maken zoals vereist voor het registreren van mitochondriale parameters van belang. Het huidige werk beschrijft de stappen en de illustraties zijn voorzien van een bevredigende weefselscheiding in figuur 1.

Mitochondriale respiratoire snelheden zijn essentieel om verschillen vast te stellen met betrekking tot mitochondriale complexen storing, oxidatieve fosforyleringsstoornis of verstoorde mitochondriën. Ademhalingsaandoeningen en mitochondriale parameters worden gedefinieerd door Chance en Williams26. In dit artikel wordt de routinematige ademhaling gedefinieerd als basale ademhaling wanneer mitochondriaal zuurstofverbruik wordt geregistreerd zonder toevoeging van exogene substraten; complexe capaciteit - wanneer substraten voor complex I of II worden toegevoegd aan het mitochondriale zuurstofverbruik van brandstof, ook wel lekademhaling genoemd; fosforylatieve toestand - wanneer ADP wordt toegevoegd in de reeks complexen substraten en aandrijft ATP synthese; niet-fosforylatieve toestand - wanneer alle ADP wordt gevormd in ATP of met de toevoeging van ATP-synthaseremmer, oligomycine (of toestand 4); Maximale capaciteit van ETS - wanneer de mitochondriale ontkoppelaar FCCP wordt toegevoegd en; resterend zuurstofverbruik (ROX) na toevoeging van rotenon en antimycine A - wanneer het zuurstofverbruik niet gerelateerd is aan mitochondriën. De techniek die in dit werk wordt beschreven voor mitochondriale functie-evaluatie in ischiaszenuwweefsel door HRR maakt het mogelijk om talrijke ademhalingstoestanden te bepalen en de intrinsieke mitochondriale functie binnen hetzelfde monster te berekenen. Testresultaten van een substraat/ontkoppeld/remmersprotocol kunnen worden gebruikt om parameters van de mitochondriale functie af te leiden waaruit respiratoire controleverhoudingen/-factoren kunnen worden berekend37, zoals aangetoond in tabel 3. Evaluatie van deze parameters combineert absolute leksnelheden, gekoppeld aan maximale mitochondriale ademhaling, en verhoogt gegevens voor een diagnostische waarde 24,35,36,37,38,39.

Hoewel mitochondriale disfunctie in perifere zenuwen in de literatuur wordt aangehaald, zijn er beperkingen bij het aantonen van deze parameters. In een chemotherapie-geïnduceerd neuropathiemodel wordt een afname van het mitochondriale membraanpotentieel waargenomen bij de behandeling met het chemotherapiemiddel oxaliplatine en een vermindering van de in vitro activiteit van complexen I, II en III bij sensorische axonen van de perifere zenuw (saphenus)40,41. Er is echter een gebrek aan informatie over de controle uitgeoefend door membraanpotentiaal op de activiteiten van de complexen en de vorming van ATP door oxidatieve fosforylering, een essentiële parameter bij mitochondriale functie-evaluatie. Ook in gedissocieerde heupzenuwen van Sprague-Dawley-ratten gepermeabiliseerd met digitonine, wordt de registratie van zuurstofverbruik alleen aangetoond voor de gefosforyleerde toestand, maar wordt niet vergeleken met zuurstofverbruik in de aanwezigheid van een ATPase-remmer of een ontkoppelaar22. In de huidige methode is het mogelijk om de respiratoire controleverhouding in de gepermeabiliseerde zenuw (tabel 3) te berekenen in vergelijking met de respiratoire controleverhouding van geïsoleerde mitochondriën, meestal berekend uit toestand3 / toestand4 (of fosforylatieve / niet-fosforylatieve toestanden). Met de methode die in dit werk wordt geboden, is het mogelijk om complexe I- en II-capaciteiten te beoordelen - met behoud van mitochondriale membraanintegriteit - en fluxcontroleverhoudingen, en maximale capaciteitsademhaling en restzuurstofverbruik te bereiken.

Verschillende methoden voor ischiaszenuwpermeabilisatie voor mitochondriale zuurstofverbruiksevaluatie worden beschreven in de literatuur. Een techniek voor ischiaszenuwpermeabilisatie wordt gedemonstreerd in een protocol met saponinebehandeling en permeabilisatie door vortexpuls; alleen fosforylatieve toestand en maximale capaciteit werden echter aangetoond41. Bovendien, als we de hier gepresenteerde waarden voor dezelfde parameters vergelijken, is de zuurstofflux waargenomen door Cooper et al.41 70% lager, wat aantoont dat er schade is aan het mitochondriale membraan gerelateerd aan de agitatiemethode. In het huidige protocol behoudt de weefselscheiding de mitochondriale membraanintegriteit, bevestigd door de kleine toename van de zuurstofflux na de toevoeging van cytochroom c. Dit is een functie waarmee alle mitochondriale parameters kunnen worden geregistreerd, waardoor een volledig overzicht van mitochondriale oxidatieve fosforylering en -functie wordt verkregen. Hoewel in een ischiaszenuwpermeabilisatiemethode met collagenase de zuurstoffluxwaarden vergelijkbaar zijn met die hier gepresenteerd, wordt een toename van bijna 20% waargenomen na toevoeging van cytochroom c, wat wijst op een bepaald niveau van mitochondriale membraanbeschadiging21. Met het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, werd een toename van slechts 6,3% -8,7% van de zuurstofflux na cytochroom c-toevoeging waargenomen, wat het voordeel van de huidige methode bevestigt bij het behoud van de mitochondriale membraanintegriteit en het optimaliseren van de registratie van het zuurstofverbruik.

Mitochondriën zijn de primaire plaats van reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie geassocieerd met diverse signaleringsprocessen in ischias zenuwweefsel en mechanismen gerelateerd aan pathofysiologie in neuropathieën42,43. Dit protocol maakte het mogelijk om gelijktijdig met zuurstofverbruik toegang te krijgen tot waterstofperoxidegeneratie met een fluorescentiesensor. Zoals waargenomen in figuur 3, is de ROS-productie gevoelig voor veranderingen van mitochondriale ademhalingstoestanden, wat de mitochondriale integriteitsstatus bevestigt en de mitochondriale functieregistratie optimaliseert.

Andere methoden zoals extracellulaire flux analyzer (EFA), gebaseerd op fluorescentiesensoren om het zuurstofverbruik te registreren, kunnen de mitochondriale functie van perifere zenuwen in gekweekte cellen - zoals Schwann-cellen of axonen - evalueren in een geautomatiseerd screeningapparaat met hoge doorvoer. Er zijn echter enkele voordelen aan het gebruik van polarografische sensoren zoals HRR, waaronder met name de mogelijkheid om het experiment in realtime te volgen, om meerdere injecties van substraten / remmers te maken; hierdoor kan een groter aantal complexe functies in mitochondriën in één experiment worden geëvalueerd en kunnen de lagere kosten van verbruiksartikelen 24,35,38,39 worden berekend. Een nadeel van het gebruik van HRR in vergelijking met EFA is de afwezigheid van een sensor voor mediaverzuring (voor analyse van glycolytische flux) en de beperkte workflowcapaciteit, die het gebruik van slechts twee monsters tegelijk mogelijk maakt.

Beperkingen van weefselpermeabilisatietechnieken die nodig zijn voor HRR zijn bekend. Ze omvatten het onvermogen om mitochondriën te evalueren wanneer ADP beperkend is en een verminderde ontkoppelde ademhalingsfrequentie in vergelijking met geïsoleerde mitochondriën. Het saponine-ischiaszenuwpermeabilisatieprotocol dat hier wordt beschreven - als een aanpassing van het spiervezelpermeabilisatieprotocol door Pesta en Gnaiger24 - maakt echter de beoordeling van mitochondriale ademhalingstoestanden en mitochondriale parameters mogelijk zonder de mitochondriale integriteit te beschadigen. Het maakt het ook mogelijk om tegelijkertijd het zuurstofverbruik en de ROS-productie in de heupzenuw te registreren, een weefsel met beruchte beperkingen voor het isoleren van mitochondriën. Dit protocol maakt dus een betere beoordeling van de mitochondriale functie in perifere zenuwen mogelijk en kan voordelen bieden aan onderzoekers bij het onderzoek naar mitochondriale rollen in pathofysiologische aandoeningen die perifere zenuwen treffen.

Probleemoplossing
Als er een toename is van het O2-verbruik na het toevoegen van cytochroom c aan meer dan 15% van de zuurstofverbruiksflux, geeft dit aan dat de permeabilisatieprocedure zeer sterk was en schade aan de mitochondriale structuur veroorzaakte. Als dat het geval is, gooit u de dissectie weg en initieert u deze opnieuw met een zachtere zenuwscheiding en herhaalt u de stappen. Als sommige geïnjecteerde reagentia niet het verwachte effect op het mitochondriale zuurstofverbruik of de productie van H2O2 aantonen, is dit waarschijnlijk te wijten aan kamerbesmetting met mitochondriale remmers. In dit geval kunnen twee acties worden ondernomen: (1) het experiment opnieuw starten na het wassen van de kamers en spuiten (stap 2.1) of (2) een monster van weefselgeïsoleerde mitochondriën of homogenaat toevoegen voordat stap 2.1 wordt uitgevoerd. De toevoegingen van deze monsters zullen mitochondriale remmers absorberen en de reinigingsstap verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). We zijn Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli en Dr. Claudio Masuda dankbaar voor de ondersteuning met laboratoriumfaciliteiten, en Dr. Martha Sorenson voor vriendelijke en waardevolle opmerkingen bij het verbeteren van het artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Tags

Biochemie Nummer 183
Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira,… More

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter