Summary
高分辨率呼吸测量与荧光传感器相结合，可测定线粒体耗氧量和活性氧 （ROS） 生成。本方案描述了一种评估透化坐骨神经中线粒体呼吸频率和ROS产生的技术。
Abstract
周围神经的线粒体功能障碍伴随着与周围神经病变相关的几种疾病，这些疾病可由多种原因引发，包括自身免疫性疾病，糖尿病，感染，遗传性疾病和肿瘤。评估小鼠周围神经中的线粒体功能可能具有挑战性，因为样本量小，组织中存在有限数量的线粒体以及髓鞘的存在。本工作中描述的技术通过使用适用于肌肉纤维的独特透化方案来评估坐骨神经线粒体功能，而不是从组织中分离线粒体，从而最大限度地减少了这些挑战。通过使用 Amplex Red/过氧化物酶测量荧光反应物的产生，并比较皂苷透化神经中的不同线粒体底物和抑制剂，可以同时检测线粒体呼吸状态、活性氧 （ROS） 和线粒体复合物的活性。因此，与通过其他技术评估线粒体功能相比，这里介绍的方法具有优势。
Introduction
线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行许多细胞功能，如能量代谢（葡萄糖，氨基酸，脂质和核苷酸代谢途径）。作为活性氧（ROS）产生的主要部位，线粒体是细胞凋亡等几个细胞信号传导过程的核心，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成，线粒体蛋白的导入和成熟，以及维持其基因组和核糖体1，2，3。线粒体膜动力学网络由融合和裂变过程控制，它们还具有质量控制和线粒体自噬4，5，6的机制。
线粒体功能障碍与几种病理状况的出现有关，例如癌症，糖尿病和肥胖症7。线粒体功能紊乱在影响中枢神经系统的神经退行性疾病中检测到，如阿尔茨海默病8，9，帕金森病10，11，肌萎缩性侧索硬化症12，13和亨廷顿舞蹈症14，15.在周围神经系统中，在免疫神经病变中观察到轴突线粒体功能的丧失，例如吉兰 - 巴雷综合征16，17，并且与轴突中的高线粒体ROS产生相关联，这些事件导致Schwann细胞中的MAP激酶激活18。这表明线粒体生理学可能不仅对位点特异性细胞至关重要，而且对整个组织也至关重要。在 HIV 相关的远端感觉多发性神经病 （HIV-DSP） 中，线粒体在转录的反式激活剂 （HIV-TAT） 蛋白允许 HIV 有效复制的机制中发挥作用，以及在 HIV 感染发病机制中的几个其他作用19，20。
坐骨神经线粒体生理学的评估已成为研究神经病变7，21，22的重要目标。在糖尿病性神经病变中，蛋白质组学和代谢组学分析表明，糖尿病中的大多数分子改变都会影响坐骨神经线粒体氧化磷酸化和脂质代谢7。这些变化似乎也是肥胖引起的糖尿病的早期迹象21。在化疗诱导的疼痛性神经病变的小鼠模型中，坐骨神经中的线粒体损伤被检测为氧化磷酸化22的减少，以及线粒体复合物活性，膜电位和ATP含量23的降低。然而，尽管一些小组引用了神经病变中的线粒体功能障碍，但这些研究仅限于线粒体复合物活性的测量，没有保留线粒体膜，缺乏线粒体完整性的评估或ATP含量的测量作为线粒体ATP产生的参数。一般来说，对线粒体耗氧量和ROS产生的正确评估需要通过在percoll/蔗糖梯度中的差异离心分离线粒体。线粒体的分离也可能是坐骨神经组织的限制因素，因为需要大量的组织以及线粒体的丢失和破坏。
本研究旨在提供一种测量线粒体生理学的方案，如坐骨神经中的线粒体耗氧量和ROS产生，保留线粒体膜并且不需要分离线粒体。该方案通过高分辨率呼吸测量（HRR）根据透化肌肉纤维24 中的耗氧量测量进行调整。该程序的优点是可以评估少量组织（例如坐骨神经）中的线粒体并 原位评估线粒体参数，从而保留线粒体环境，结构和生物能量谱，以获得生理上值得信赖的结果。坐骨神经通透后，用底物和抑制剂测定线粒体呼吸状态，以正确评估线粒体生物能量学和线粒体膜完整性的细胞色素c系数，为线粒体电子传递系统（ETS）评估和基本参数计算的步骤提供指导。这项研究可以为回答与坐骨神经代谢有关的病理生理学机制中的问题提供工具，例如周围神经病变。
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Protocol
本议定书由研究中使用的动物伦理委员会CCS / UFRJ（CEUA-101 / 19）和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南批准。坐骨神经从四个月大的雄性C57BL / 6小鼠中分离出来，根据机构指南通过宫颈脱位安乐死。方案步骤经过优化，以避免线粒体恶化。因此，在该方案中，在小鼠坐骨神经组织解剖和透化之前进行极谱法氧传感器的校准。
1. 试剂的制备
- 准备组织保存缓冲液（TP缓冲液）。
- 在超纯水溶液中制备以下试剂：10 mM Ca-EGTA缓冲液与0.1μM游离钙，20mM咪唑，20mM牛磺酸，50mMK-MES，0.5mMDTT，6.56mM氯化镁2，5.77mMATP，15mM磷酸肌酸（见 材料表），pH 7.1。储存在-20°C。
- 准备线粒体呼吸缓冲液（MR缓冲液）。
- 在超纯水溶液中制备以下试剂：0.5 mM K2EGTA，3 mM氯化镁2，60 mM MES，20 mM牛磺酸，10 mM KH2PO4，20 mM HEPES，110 mM D-蔗糖，1mg / mLBSA（无脂肪酸）（见 材料表），pH 7.4。储存在-20°C。
- 通过将5mg皂苷（参见 材料表）溶解在1mLTP缓冲液（步骤1.1）中并将其保存在冰上来制备皂苷储备溶液。皂苷是新鲜烹制的。
- 通过用DMSO重悬粉末（参见 材料表）来制备 Amplex Red，以获得 2 mM 的储备浓度，并储存在 -20 °C 的避光小瓶中。
注意：为避免冻融使探针磨损，请制作小等分试样，储存时间不超过6个月25。
2. 用于高分辨率呼吸测量（HRR）的极谱法氧传感器的校准
- 清洁仪器和注射器的HRR室（见 材料表）。
- 打开HRR室，将蒸馏水填充到顶部，搅拌5分钟3次。用乙醇重复，然后用水再次重复。用水/乙醇/水清洗塞子和注射器，每个3x。
- 在HRR软件中应用以下校准设置（参见 材料表）。
- 在HRR软件控制中，添加实验温度（37°C），氧传感器（增益，2;极化电压，800 mV）和电化学传感器（增益，1000;极化电压，100 mV）的参数。
- 校准氧传感器。
- 将2.1 mL MR缓冲液（步骤1.2）移入每个腔室。用塞子关闭并将空气吸入腔室，直到形成气泡。在校准模式下在37°C下搅拌1小时，直到每个质量的氧通量稳定。
- 根据制造商的协议24对软件中的极谱法氧传感器进行空气校准。
注意：校准步骤仅在实验前执行一次。在相同的呼吸介质和温度下，只需在洗涤室后即可进行其他实验（步骤2.1）。
3.坐骨神经的解剖和透化
- 按照以下步骤移除坐骨神经。
- 从笼子中取出后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死，并轻轻地限制在长凳上休息。
- 在安乐死的动物中，用剪刀在下背部做一个切口，从脊柱附近开始，沿着大腿向脚部走。去除附着在神经上的皮肤和肌肉，然后切除并去除整个坐骨神经。
- 立即称量组织并将其放入装有冷结核缓冲液（4°C）的小瓶中。在冰上执行步骤3.2-3.3。
注意：湿纸巾重量用于在以下步骤中使氧气消耗和ROS生产流程正常化。如果不能立即称量组织，请将其保存在冷TB缓冲液中。该过程在新鲜组织中进行，不得冷冻以避免线粒体损伤。
- 对于组织准备，将坐骨神经放入培养皿中，培养皿中有足够的TP缓冲液覆盖它。用镊子握住神经的一端，用另一对镊子水平拉出神经束。
注意：该过程需要在不到10分钟的时间内完成，以避免组织恶化。当组织可以可视化为透明的雾状层时，组织将准备就绪，与先前的白色不透明组织相反（图1）。 - 首先，将分散的组织转移到含有1mL TP缓冲液的小培养皿中以进行组织透化。为了开始透化，将带有镊子的组织转移到含有1mL TP缓冲液和10μL皂苷的培养皿中（来自储备溶液，步骤1.3）。
- 在微孔板振荡器中轻轻摇动30分钟，然后用镊子将组织转移到含有MR缓冲液（1mL）的新鲜培养皿中，轻轻摇动10分钟。用镊子将组织转移到校准的HRR室中。
4. 耗氧量和ROS生产测定
- 用2.1mL MR缓冲液填充HRR室，将Applex Red（步骤1.4）加入终浓度为5μM，过氧化物酶为2 U / mL，并加入透化的坐骨神经（步骤3）。
- 连接仪器的荧光传感器，关闭软件控制部分中的灯，然后按 连接到氧饱和度计。在软件的“编辑方案”中，插入步骤3.1.3中测量的组织重量。
- 转到“布局”，选择“每单位样品的特定通量”选项，然后选择 绘图 以同时访问氧气消耗读数，如果需要，还可以访问H2O2 生产。等待~10分钟。
注意：此时间需要稳定氧气消耗的基础流量，而无需添加底物（基础）。在进一步注射之前，请确保氧气流量稳定。 - 注入两个H2O2脉冲，每个脉冲的终浓度为260μM，以便稍后在腔室中校准。
- 注入20μL琥珀酸盐（参见 材料表），线粒体复合物II底物，以激活线粒体电子传递系统。
注意：此时可以添加不同的线粒体底物，以评估不同复合物的线粒体功能。线粒体复合物I和II具有不同底物的代表性结果如图2和图3所示。在这一点上，在图3中观察到O 2消耗量和H2 O 2产量同时增加。 - 加入20μL二磷酸腺苷（ADP）以激活三磷酸腺苷（ATP）合成。
注意：ADP刺激ATP合成并降低膜电位。预计O2 消耗量的增加和H2O2 的产量减少将达到26，27。 - 按顺序，加入5μL细胞色素c（参见 材料表）作为膜完整性的指示剂。
注意：如果组织准备充分且透化，细胞色素c不应使氧气消耗量增加超过15%。如果发生这种情况，请查看疑难解答部分以获取建议。 - 用0.2μg/mL寡霉素等分试样滴定（见 材料表），直到没有观察到O2 消耗的进一步减少。
注意：寡霉素通过抑制ATP合成起作用，导致O2流量减少和H2 O 2形成增强，高膜电位26，27有利。 - 用0.5μmol/ L羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP） 的等分试样滴定，线粒体解偶联器，直到可以观察到O2 消耗的进一步增加。为了完成实验，将2μl抗霉素A注射至终浓度为5μM并等待流量稳定。
注意：由于注射FCCP后膜电位耗散，观察到H2 O 2产量的降低。抗霉素A抑制复合物III，从而阻止电子的流动。因此，线粒体依赖性O2的消耗受损，每质量氧通量降低并刺激电子泄漏，增加H2O2的产生26，27。 - 转到命令栏，在软件中搜索“多感官”，单击“ 控制>保存文件并断开连接。
注意：可以根据正在研究的问题添加其他底物和抑制剂。代表性结果中描述了一个示例。H2O2 校准在完成实验后根据制造商的协议28进行。 - 打开保存的文件并选择“每质量氧通量”迹线以获得实验耗氧量结果。通过按 Shift + 鼠标左键手动选择注射之间的窗口。
- 转到 标记>统计 ，以可视化每次注射底物/抑制剂/非耦合方案的结果。对于 H2O2 生产，请使用“安培斜率”迹线执行相同的过程。
注意：选择窗口时，请通过选择氧气（或H2O2）更稳定和恒定的窗口来避免体积注入的伪影。所选窗口的示例在代表性结果中用黑色大括号表示（图 2 和 图 3）。
- 转到 标记>统计 ，以可视化每次注射底物/抑制剂/非耦合方案的结果。对于 H2O2 生产，请使用“安培斜率”迹线执行相同的过程。
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Representative Results
透化坐骨神经的线粒体氧消耗量如图 2所示。红色迹线表示每单位质量的O2 通量，以pmool/s.mg为单位。在用内源性底物（常规呼吸）记录基础氧消耗量后，注射琥珀酸盐（SUCC）以记录复合物II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率增加。按顺序，加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶并驱动氧化磷酸化。这导致线粒体呼吸的磷酸化状态。磷酸化状态呼吸是指ATP合酶可以从ADP + Pi（无机磷酸盐）中产生ATP，利用质子梯度形成的膜电位作为质子动力来产生ATP26。随着ATP合酶活性促进膜电位的降低，氧消耗加速，氧流量增加。外源性细胞色素c（CYTC）的添加仅促进了对呼吸的最小刺激，证明了该制剂的线粒体外膜完整性。组织的透化会破坏膜的完整性和细胞色素c的损失。呼吸速率增加超过10%-15%表明线粒体受损和组织准备不足28，29。在该代表性结果中，呼吸增加8.7%，表明组织制备质量良好（表1）。用寡霉素（OLIGO）滴定需要以最小剂量进行，以避免达到可能干扰最大容量评估30的寡核苷酸浓度。寡核苷酸抑制ATP合成酶 - 或寡霉素26 的状态4呼吸 - 导致耗氧流量减少。使用线粒体解偶联试剂FCCP滴定可消耗线粒体膜电位，刺激呼吸通量并显示电子转移的最大容量（ETS最大容量）。在实验结束时，注射复合物III的抑制剂抗霉素A（AA）以抑制线粒体呼吸并记录非线粒体氧气消耗（残余呼吸）（图2）。本代表性实验中记录的绝对氧流量计算在 表1中。
通过用荧光传感器通过 Amplex Red 检测过氧化氢 （H2O2） 来确定线粒体氧消耗量与活性氧产生 （ROS） 同时分析的可能性，对于确定生物能量谱和检测各种病理中线粒体功能障碍的标准工具是一大优势。为不同的复合物添加不同的底物来为线粒体ETS提供燃料也可以产生更多关于线粒体功能障碍的特定位点的信息。 图3 显示了在为ETS提供燃料的不同基板存在下同时测量氧气消耗量（图3A）和ROS生产（图3B）的情况。在记录基础呼吸后，将丙酮酸+苹果酸盐（PM）作为线粒体复合物I的底物添加到腔室中，增加耗氧通量。加入SUCC（复合物II的底物）也增加了呼吸，但与早期的底物添加相比，进一步添加棕榈酰肉碱（PC）不会增加氧气流量，这表明PM和SUCC可能已经饱和了线粒体泛醌位点或缺乏脂肪酸氧化。正如预期的那样，在添加基板后，ROS的产生也会增加，这代表了从ETS逸出并形成ROS的氧气泄漏（图3B，绿色迹线）。在饱和浓度中添加ADP会增加氧气消耗，驱动ATP形成（ 图3A中的红色迹线）并降低ROS产生（图3B，绿色迹线）。加入CYTC只能使氧气流量增加6.8%，证实了线粒体膜的完整性。使用OLIGO滴定可减少氧气消耗流量（ 图3A中的红色迹线）并增加ROS的产生（ 图3B中的绿色迹线）。ADP和OLIGO效应表明，该方案中的透化坐骨神经可以复制线粒体生理学中的标准关系，其中氧气消耗的增加导致膜电位降低并阻止ROS产生31，32。
正如解耦器所期望的那样，FCCP的添加将氧气消耗量增加到其最大速率，并且由于膜电位耗散，ROS的产生减少。添加鱼藤酮（复合物I和AA的抑制剂）可减少氧气消耗并增加ROS形成（图3A，B），证实透化坐骨神经中的线粒体生理学和生物能量谱得以保留。本实验中记录的氧气流量的绝对值计算在 表2中。
图1：坐骨神经制备线粒体透化。所有程序都需要在冰上进行。（A）从安乐死小鼠中提取坐骨神经，并将其置于含有4°C组织保存缓冲液的培养皿中。（三、四）当组织被解剖成半透明的簇状物时，而不是原始的白色不透明管状结构（A）时，组织就准备好了。比例尺 = 1 cm.请点击此处查看此图的放大图。
图2：小鼠透化坐骨神经中线粒体氧消耗的代表性结果。 该实验是从安乐死小鼠中提取的一种坐骨神经提取物的代表性痕迹。坐骨神经之前是透化的，如方案部分所述。注射在特定时间以箭头表示。琥珀酸钠： 琥珀酸盐;ADP：二磷酸腺苷;细胞色素c：细胞色素c;寡核苷酸：寡霉素;FCCP： 羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙;AA：抗霉素A.实时氧浓度为[nmol/mL]（蓝色痕量）和耗氧速率为每单位质量的通量[pmol/（s.mg）]（红色迹线）。黑色牙套代表每次注射后为结果选择的耗氧速率窗口。基础是指没有底物的呼吸。 请点击此处查看此图的大图。
图3：线粒体耗氧量与透化小鼠坐骨神经中ROS产生耦合的结果。 显示了来自安乐死小鼠的一种坐骨神经提取物的代表性痕迹。坐骨神经之前是透化的，如方案部分所述。注射在特定时间以箭头表示。H2O2：过氧化氢;PM：丙酮酸/苹果酸盐;琥珀酸钠： 琥珀酸盐;PC：棕榈酰肉碱;ADP：二磷酸腺苷;细胞色素c：细胞色素c;寡核苷酸：寡霉素;FCCP： 羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）苯腙;腐烂：鱼藤酮;AA：抗霉素 A. （A） 显示实时氧浓度为 [nmol/mL]（蓝色痕量）和耗氧速率作为每单位质量的通量 [O2 pmol/（s.mg）]（红色迹线）。（B）在校准后，ROS生产证明为H2O2 荧光（紫色痕量）和H2O2 生产斜率[pmol/（s.mg）]（绿色迹线）。黑色牙套代表每次注射后为结果选择的耗氧速率窗口。基础是指没有底物的呼吸。 请点击此处查看此图的大图。
| 基质 | 增加 | 耗氧率 |
| 每质量通量（二摩尔/[s.mg]） | ||
| 基础（无添加） | 没有 | 5.9 |
| 琥珀酸盐（琥珀酸） | 一次添加 10 mM | 16.9 |
| 断续器 | 一次添加 1 μM | 28.5 |
| 细胞色素 c | 一次添加 10 μM | 31 |
| 寡霉素 A（寡核苷酸） | 滴定时添加 0.2 微克/毫升 | 21.9 |
| 断续器 | 滴定，添加量为 0.5 μM | 31.1 |
| 抗霉素 A | 一次添加 5 μM | 11.3 |
表1：底物/解耦/抑制剂/滴定（SUIT）方案和小鼠透化坐骨神经耗氧速率的结果。 每次添加SUIT方案后，氧气消耗量以[O2pmol/（s.mg）]表示。结果由 图 2 中标记的所选窗口的平均值获得。
| 基质 | 增加 | 耗氧量（O2 二极摩尔/[s.mg]） | ROS 生产 （H2O2 帕莫尔/[s.mg]） |
| 基础（无添加） | 没有 | 5.77 | 0.53 |
| 丙酮酸 + 苹果酸盐 （PM） | 一个 5 mM + 2.5 mM 的脉冲 | 7.17 | 0.58 |
| 琥珀酸盐（琥珀酸） | 一次添加 10 mM | 14.06 | 0.75 |
| 棕榈酰肉碱 | 两个 25 μM 的脉冲 | 14.68 | 0.79 |
| 断续器 | 一次添加 1 μM | 22.9 | 0.25 |
| 细胞色素 c | 一次添加 10 μM | 24.36 | 0.09 |
| 寡霉素 A（寡核苷酸） | 滴定时添加 0.2 微克/毫升 | 17.03 | 0.5 |
| 断续器 | 滴定，添加量为 0.5 μM | 23.98 | 0.16 |
| 鱼藤酮（腐烂） | 一次添加 1μM | 19.75 | 0.48 |
| 抗霉素 A | 一次添加 5 μM | 4.08 | 0.53 |
表2：底物/解耦/抑制剂/滴定（SUIT）方案和ROS产生结果与小鼠坐骨神经透化耗氧率耦合的结果。 每次添加SUIT方案后，氧气消耗量以[O2 pmol/（s.mg）]和[H2O2 pmol/（s.mg）]表示。结果由 图 3 中标记的选定窗口的平均值获得。
| 线粒体功能的参数 | 根据耗氧量计算 |
| 基础呼吸 | 基础呼吸（不添加底物的助焊剂）28 |
| 残余氧气消耗量 （ROX） | [添加AA后的通量]27 |
| 复杂 I 泄漏呼吸 | [添加粉末冶金后的通量] – [ROX]28，37 |
| 复杂 II 泄漏呼吸 | [加入中国石油公司后的通量] – [ROX]28，37 |
| 磷酸化状态（奥磷容量） | [添加 ADP 后的通量] – [ROX]28，43 |
| 非磷酸化状态（呼吸泄漏） | [加入寡霉素后的通量] – [ROX]28 |
| 呼吸控制比 | [磷酸化状态/非磷酸化]28，43 |
| 排版容量 | [添加氟氯化碳后的通量] – [ROX]28，37 |
表3：用于评估小鼠透化坐骨神经线粒体功能的参数计算。 线粒体生理学参数按耗氧率评价公式。
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Discussion
伴随神经病变的几种疾病或病症将线粒体功能障碍作为危险因素。评估周围神经的线粒体功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的行为至关重要。由于分离方法的困难和材料的稀缺性，线粒体功能的评估是费力的。因此，开发不需要分离线粒体的组织透化技术至关重要。
为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸的化学物质至关重要。在周围神经如坐骨神经中，髓鞘组成约为70%的脂质，其中大部分是胆固醇33，34。选择与胆固醇分子相互作用的透化剂，如皂苷和洋地黄苷，导致孔隙允许底物进入线粒体机制而不会干扰其他细胞室35，36。在该协议中，Pesta和Gnaiger24 描述的皂苷肌纤维渗透的成熟方法适用于坐骨神经。渗透化过程包括关于组织分离的另一个关键步骤，以允许根据记录感兴趣的线粒体参数所需的底物进行访问。本工作描述了这些步骤，并在 图1中提供了令人满意的组织分离的插图。
线粒体呼吸频率记录对于确定线粒体复合物功能障碍、氧化磷酸化紊乱或线粒体破坏的差异至关重要。呼吸系统疾病和线粒体参数由机会和威廉姆斯26定义。在本文中，常规呼吸被定义为当记录线粒体氧气消耗而不添加外源性底物时的基础呼吸;络合物容量 - 当复合物I或II的底物添加到燃料线粒体氧气消耗中时，也称为泄漏呼吸;磷酸化状态 - 当ADP被添加到配合物底物的序列中并驱动ATP合成时;非磷酸化状态 - 当所有ADP形成ATP或加入ATP合酶抑制剂寡霉素（或状态4）时;ETS最大容量 - 当添加线粒体解偶联剂FCCP时;添加鱼藤酮和抗霉素A后的残余氧消耗量（ROX） - 当氧消耗量与线粒体无关时。本著作中描述的通过HRR评估坐骨神经组织中线粒体功能的技术允许确定许多呼吸状态并计算同一样品中的内在线粒体功能。底物/非耦合/抑制剂方案测试结果可用于推导线粒体功能的参数，从中可以计算出呼吸控制比/因子37，如表3所示。这些参数的评估结合了绝对泄漏率，加上最大的线粒体呼吸，并提高了诊断值24，35，36，37，38，39的数据。
虽然文献中引用了周围神经的线粒体功能障碍，但在证明这些参数方面存在局限性。在化疗诱导的神经病变模型中，在用化疗剂奥沙利铂治疗时线粒体膜电位降低，在周围神经（隐神经）的感觉轴突中观察到复合物I，II和III的体外活性降低40，41。然而，缺乏关于膜电位对配合物活性和通过氧化磷酸化形成ATP施加的控制的信息，氧化磷酸化是线粒体功能评估中的基本参数。此外，在用洋地黄素透化的斯普拉格- 道利大鼠的解离坐骨神经中，仅证明磷酸化状态下氧气消耗的记录，但未与ATP酶抑制剂或解耦合器22下的氧气消耗进行比较。在本方法中，可以计算出透化神经的呼吸控制比（表3）与分离的线粒体的呼吸控制比值的比较，通常从状态3/state4（或磷酸化/非磷酸化状态）计算。使用本工作中提供的方法，可以评估复杂的I，II容量 - 维持线粒体膜的完整性 - 和通量控制比，并实现最大容量呼吸和残余氧消耗。
文献中描述了用于线粒体耗氧评估的坐骨神经通透性的不同方法。坐骨神经透化技术在皂苷治疗和涡旋脉冲透化的方案中得到了证明;然而，仅证明了磷酸化状态和最大容量41。此外，比较此处提供的相同参数的值，Cooper等人观察到的氧通量降低了70%，表明与搅拌方法相关的线粒体膜受损。在本方案中，组织分离保留了线粒体膜的完整性，通过加入细胞色素c后氧通量的小幅增加来证实。这是一个允许记录所有线粒体参数的功能，提供了线粒体氧化磷酸化和功能的完整记录。尽管在使用胶原酶的坐骨神经通透化方法中，氧通量值与此处显示的值相当，但在添加细胞色素c后观察到近20%的增加，表明线粒体膜损伤的一定程度的21。使用本文所述的方案，观察到细胞色素c添加后氧通量仅增加了6.3%-8.7%，证实了本方法在保持线粒体膜完整性和优化耗氧记录方面的优势。
线粒体是活性氧（ROS）生成的主要部位，与坐骨神经组织中的各种信号传导过程和神经病症的病理生理学机制相关42，43。该协议使得使用荧光传感器与氧气消耗同时产生过氧化氢成为可能。如图 3所示，ROS的产生对线粒体呼吸状态的改变敏感，确认线粒体完整性状态并优化线粒体功能记录。
其他方法，如细胞外通量分析仪（EFA），基于荧光传感器来记录氧气消耗，可以在自动化高通量筛选设备中评估培养细胞（如施万氏细胞或轴突）中的周围神经线粒体功能。然而，使用HRR等极谱法传感器有一些优点，特别是能够实时跟踪实验，进行多次注射底物/抑制剂;因此，这允许在一次实验中评估线粒体中更多的复杂功能，并且消耗品的成本较低24，35，38，39。与EFA相比，使用HRR的缺点是没有用于介质酸化的传感器（用于分析糖酵解通量）和有限的工作流程能力，一次只能使用两个样品。
HRR所需的组织透化技术的局限性是众所周知的。它们包括当ADP受限时无法评估线粒体，以及与孤立的线粒体相比，未耦合的呼吸频率降低。然而，这里描述的皂苷 - 坐骨神经通透方案 - 作为Peta和Gnaiger24 对肌肉纤维透化方案的改编 - 允许评估线粒体呼吸状态和线粒体参数而不会损害线粒体完整性。它还允许同时记录坐骨神经中的氧气消耗和ROS产生，坐骨神经是一种在分离线粒体方面具有臭名昭着的限制的组织。因此，该协议允许更好地评估周围神经中的线粒体功能，并且可以为研究人员在研究折磨周围神经的病理生理学条件下的线粒体作用提供优势。
故障 排除
如果在将细胞色素c添加到超过15%的耗氧通量后O2 消耗量增加，则表明渗透过程非常强并且对线粒体结构造成损害。如果是这种情况，请丢弃并用更温和的神经分离重新开始解剖，然后重复这些步骤。如果注射的一些试剂没有显示出线粒体耗氧或H2O2 产生的预期效果，则可能是由于线粒体抑制剂的腔室污染。在这种情况下，可以采取两种操作：（1）在洗涤腔室和注射器后重新启动实验（步骤2.1）或（2）在执行步骤2.1之前添加任何组织分离的线粒体或匀浆的样品。这些样品的添加将吸收线粒体抑制剂并改善清洁步骤。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由塞拉皮拉赫拉研究所、里约热内卢国家和平保护基金会、全国公民与技术发展委员会和巴西国家经济委员会（CAPES）资助。我们感谢安东尼奥·加林娜·菲略博士、莫妮卡·蒙特罗·洛梅利博士和克劳迪奥·马苏达博士对实验室设施的支持，以及玛莎·索伦森博士在改进本文方面提出的善意和宝贵的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
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