Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vurdering av mitokondriefunksjon i isjiasnerven ved høyoppløselig respirometri

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

Høyoppløselig respirometri koblet til fluorescenssensorer bestemmer mitokondrie oksygenforbruk og reaktiv oksygenart (ROS) generasjon. Den nåværende protokollen beskriver en teknikk for å vurdere mitokondrie respiratoriske rater og ROS-produksjon i permeabilisert isjiasnerve.

Abstract

Mitokondrie dysfunksjon i perifere nerver følger med flere sykdommer forbundet med perifer nevropati, som kan utløses av flere årsaker, inkludert autoimmune sykdommer, diabetes, infeksjoner, arvelige lidelser og svulster. Vurdering av mitokondriefunksjon i mus perifere nerver kan være utfordrende på grunn av den lille prøvestørrelsen, et begrenset antall mitokondrier tilstede i vevet, og tilstedeværelsen av en myelinhylse. Teknikken beskrevet i dette arbeidet minimerer disse utfordringene ved å bruke en unik permeabiliseringsprotokoll tilpasset en som brukes til muskelfibre, for å vurdere isjiasnerve mitokondriefunksjon i stedet for å isolere mitokondriene fra vevet. Ved å måle fluorimetrisk reaktiv artsproduksjon med Amplex Red/Peroxidase og sammenligne forskjellige mitokondrie-substrater og hemmere i saponin-permeabiliserte nerver, var det mulig å oppdage mitokondrie-respiratoriske tilstander, reaktive oksygenarter (ROS) og aktiviteten til mitokondriekomplekser samtidig. Derfor gir metoden som presenteres her fordeler sammenlignet med vurderingen av mitokondriefunksjon ved andre teknikker.

Introduction

Mitokondrier er avgjørende for å opprettholde celle levedyktighet og utføre mange cellefunksjoner som energimetabolisme (glukose, aminosyre, lipid og nukleotid metabolisme veier). Som det primære stedet for reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon, er mitokondrier sentrale i flere cellesignaleringsprosesser som apoptose og deltar i syntesen av jern-svovel (Fe-S) klynger, mitokondrieprotein import og modning, og vedlikehold av deres genom og ribosomer 1,2,3. Det mitokondriemembrandynamikknettverket styres av fusjons- og fisjonsprosesser, og de har også maskiner for kvalitetskontroll og mitophagy 4,5,6.

Mitokondrie dysfunksjon er forbundet med utseendet av flere patologiske tilstander som kreft, diabetes og fedme7. Forstyrrelser i mitokondriefunksjonen oppdages i nevrodegenerative lidelser som påvirker sentralnervesystemet, som ved Alzheimers sykdom 8,9, Parkinsons sykdom 10,11, amyotrofisk lateral sklerose12,13 og Huntington sykdom14,15 . I det perifere nervesystemet observeres tap av mitokondriefunksjon i axoner i immun nevropatier, som Guillain-Barré syndrom16,17, og i forbindelse med høy mitokondrie ROS-produksjon i axoner, fører disse hendelsene til MAP Kinase-aktivering i Schwann-cellene18. Dette viser at mitokondriefysiologi kan være viktig, ikke bare for en stedsspesifikk celle, men for et helt vev. I HIV-assosiert distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en rolle i mekanismen der transaktivatoren for transkripsjon (HIV-TAT) protein gjør det mulig for HIV å replikere effektivt, samt flere andre roller i HIV-infeksjonspatogenese19,20.

Evaluering av isjias nerve mitokondrie fysiologi har dukket opp som et viktig mål for å undersøke nevropati 7,21,22. I diabetisk nevropati tyder proteomiske og metabolomiske analyser på at de fleste molekylære endringer i diabetes påvirker isjiasnerven mitokondrie oksidativ fosforylering og lipidmetabolisme7. Disse endringene synes også å være tidlige tegn på fedme-indusert diabetes21. I en musemodell av kjemoterapiindusert smertefull nevropati oppdages mitokondriehemming i isjiasnerven som en reduksjon i oksidativ fosforylering22, og en reduksjon av mitokondriekomplekser aktiviteter, membranpotensial og ATP-innhold23. Men selv om flere grupper har sitert mitokondriedysfunksjon i nevropatier, er disse studiene begrenset til målinger av aktivitet i mitokondriekomplekser uten bevaring av mitokondriemembranene, uten evaluering av mitokondrieintegritet eller målinger av ATP-innhold som en parameter for mitokondrie-ATP-produksjon. Generelt krever en riktig vurdering av mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon isolering av mitokondrier ved differensial sentrifugering i en percoll / sukrose gradient. Isolering av mitokondrier kan også være en begrensende faktor for isjiasnervevev på grunn av den store mengden vev som trengs og mitokondrier tap og forstyrrelser.

Den nåværende studien tar sikte på å gi en protokoll for å måle mitokondriefysiologi som mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon i isjiasnerven, bevare mitokondriemembraner og uten behov for å isolere mitokondrier. Denne protokollen er tilpasset fra oksygenforbruksmålinger i permeabiliserte muskelfibre24 ved høyoppløselig respirometri (HRR). Fordelene ved denne prosedyren er muligheten for å evaluere mitokondrier i små mengder vev som isjiasnerven og evaluere mitokondrieparametere in situ, og dermed bevare mitokondriemiljøet, strukturen og bioenergetisk profil, for å oppnå et fysiologisk pålitelig resultat. Mitokondrie-luftveiene ble bestemt med substrater og hemmere etter isjiasnervens permeabilisering for å vurdere mitokondriebioenergetikk og cytokrom c koeffisient for mitokondriemembranintegritet på riktig måte, og gir en guide for trinn i mitokondrie-elektrontransportsystemet (ETS) evaluering og beregning av essensielle parametere. Denne studien kan gi verktøy for å svare på spørsmål i patofysiologiske mekanismer der isjias nervemetabolisme er implisert, for eksempel perifere nevropatier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nåværende protokollen er godkjent av Etikkutvalget for bruk av dyr i forskning, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) og Nasjonale helseinstitutter retningslinjer for pleie og bruk av eksperimentelle dyr. Isjiasnerven er isolert fra fire måneder gamle mannlige C57BL/6 mus, euthanized av cervical dislocation i henhold til institusjonelle retningslinjer. Protokolltrinnene er optimalisert for å unngå mitokondrieforringelse. Derfor, i denne protokollen, ble kalibrering av polarografiske oksygensensorer utført før musisjias nervevev disseksjon og permeabilisering.

1. Utarbeidelse av reagenser

  1. Klargjør vevsbevaringsbufferen (TP-buffer).
    1. Forbered følgende reagenser i ultrarent vannløsning: 10 mM Ca-EGTA buffer med 0,1 μM fritt kalsium, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM fosfokreatin (se Materialtabellen), pH 7.1. Oppbevars ved -20 °C.
  2. Klargjør Mitochondria Respiration Buffer (MR Buffer).
    1. Forbered følgende reagenser i ultrarent vannløsning: 0,5 mM K2EGTA, 3 mM mgcl2, 60 mM MES, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sukrose, 1 mg/ml BSA (fettsyrefri) (se Materialtabell), pH 7,4. Oppbevars ved -20 °C.
  3. Forbered saponinlagerløsning ved å oppløse 5 mg saponin (se materialtabellen) i 1 ml TP Buffer (trinn 1.1) og hold den på is. Saponin er tilberedt ferskt.
  4. Forbered Amplex Red ved å bruke pulveret på nytt (se Materialtabell) med DMSO for å oppnå en lagerkonsentrasjon på 2 mM og oppbevar ved -20 °C i et hetteglass beskyttet mot lys.
    MERK: For å unngå å slite ut sonden ved å fryse og tine, må du lage små aliquots for oppbevaring ikke lenger enn 6 måneder25.

2. Kalibrering av polarografiske oksygensensorer for høyoppløselig respirometri (HRR)

  1. Rengjør HRR-kamrene på instrumentet og sprøytene (se Materialfortegnelser).
    1. Åpne HRR-kamrene, fyll med destillert vann opp til toppen og rør i 5 min 3x. Gjenta med etanol og deretter igjen med vann. Vask stoppere og sprøyter med vann/etanol/vann 3 ganger hver.
  2. Bruk følgende kalibreringsinnstillinger i HRR-programvaren (se Materialfortegnelser).
    1. I HRR-programvarekontroll legger du til den eksperimentelle temperaturen (37 °C), parametrene for oksygensensor (forsterkning, 2; polariseringsspenning, 800 mV) og for amperometrisk sensor (forsterkning, 1000; polariseringsspenning, 100 mV).
  3. Kalibrer oksygensensorene.
    1. Pipette 2,1 ml MR-buffer (trinn 1.2) inn i hvert kammer. Lukk med stopperne og trekk luft inn i kammeret til en boble dannes. Rør ved 37 °C i 1 time i kalibreringsmodus til oksygenstrømmen per masse er stabil.
    2. Utfør en luftkalibrering av de polarografiske oksygensensorene i programvaren i henhold til produsentens protokoll24.
      MERK: Kalibreringstrinnet utføres bare én gang før et eksperiment. Ytterligere eksperimenter i samme åndedrettsmedium og temperatur kan utføres etter bare vaskekamre (trinn 2.1).

3. Disseksjon og permeabilisering av isjiasnerven

  1. Fjern isjiasnerven ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Euthanize dyret ved cervical dislokasjon etter fjerning fra buret og forsiktig begrenset til hvile på benken.
    2. I det euthanized dyret, gjør et snitt med saks i nedre rygg, starter nær ryggraden og fortsetter ned låret mot foten. Fjern hud og muskler festet til nerven, og kutt deretter og fjern hele isjiasnerven.
    3. Vei vevet umiddelbart og legg det i et hetteglass fylt med kald TB Buffer (4 °C). Utfør trinn 3.2-3.3 på is.
      MERK: Vekten av våtvevet brukes til å normalisere oksygenforbruket og ROS-produksjonsstrømmen i følgende trinn. Hvis vevet ikke kan veies umiddelbart, må du spare det i kald TB Buffer. Prosedyren utføres i friskt vev og må ikke fryses for å unngå mitokondrieskade.
  2. For vevsforberedelse, plasser isjiasnerven i en Petri-tallerken med nok TP Buffer til å dekke den. Hold den ene enden av nerven med tang, og med et annet par tang trekker du ut nervebuntene horisontalt.
    MERK: Denne prosedyren må gjøres på mindre enn 10 minutter for å unngå vevsforringelse. Vevet vil være klart når det kan visualiseres som gjennomsiktige tåkete lag, motsatt det forrige hvite ugjennomsiktige vevet (figur 1).
  3. Først overfører du det splayed vevet til en liten tallerken som inneholder 1 ml TP Buffer for vevspermeabilisering. For å starte permeabilisering, overfør vevet med tang til en tallerken som inneholder 1 ml TP-buffer og 10 μL saponin (fra lageroppløsning, trinn 1,3).
    1. Rist forsiktig i en mikroplate shaker i 30 min, overfør deretter vevet med tang til en fersk tallerken som inneholder MR Buffer (1 ml) og rist forsiktig i 10 minutter. Overfør vevet med tang til et kalibrert HRR-kammer.

4. Oksygenforbruk og ROS-produksjonsbestemmelse

  1. Fyll HRR-kamrene med 2,1 ml MR-buffer, tilsett Amplex Red (trinn 1.4) i en endelig konsentrasjon på 5 μM og peroksidase til 2 U/ml, og tilsett den permeabiliserte isjiasnerven (trinn 3).
    1. Fest instrumentets fluorescenssensorer, slå av lysene i kontrolldelen av programvaren og trykk koble til oksygraf. I "rediger protokoller" i programvaren setter du inn vevsvekten målt i trinn 3.1.3.
  2. Gå til "layout", velg alternativet "spesifikk flux per enhet prøve", og velg Tomter for samtidig tilgang til oksygenforbrukets avlesning og om ønskelig H2O2-produksjonen . Vent ~10 min.
    MERK: Denne tiden er nødvendig for å stabilisere basalstrømmen av oksygenforbruk uten tilsatt substrat (basal). Før ytterligere injeksjoner, sørg for at oksygenstrømmen stabiliseres.
  3. Injiser to pulser på H2O2, hver til en endelig konsentrasjon på 260 μM, for senere kalibrering i kammeret.
  4. Injiser 20 μL succinat (se Materialtabell), et mitokondriekompleks II-substrat, for å aktivere mitokondrieelektrontransportsystemet.
    MERK: Ulike mitokondrie substrater kan legges til på dette tidspunktet for å evaluere mitokondriefunksjon av forskjellige komplekser. Representative resultater med varierende substrater for mitokondriekomplekser I og II er vist i figur 2 og figur 3. På dette tidspunktet observeres en økning i O2-forbruket og H2O2-produksjonen samtidig i figur 3.
  5. Tilsett 20 μL adenosindifosfat (ADP) for å aktivere adenosin tripfosfat (ATP) syntese.
    MERK: ADP stimulerer ATP-syntesen og reduserer membranpotensialet. En økning i O2-forbruket og en nedgang i produksjonen av H2O2 forventes å bli observert26,27.
  6. I rekkefølge tilsettes 5 μL cytokrom c (se Materialfortegnelse) som en indikator på membranintegritet.
    MERK: Hvis vevet er godt forberedt og permeabilisert, bør cytokrom c ikke øke oksygenforbruket med mer enn 15%. Hvis dette skjer, kan du se i feilsøkingsdelen for å få anbefalinger.
  7. Titrat med aliquots på 0,2 μg/ml oligomycin (se materialfortegnelser) inntil det ikke observeres ytterligere reduksjon i O2-forbruket .
    MERK: Oligomycin virker ved å hemme ATP-syntese som fører til en reduksjon i O2-strømning og en forbedring i H2O2-formasjonen favorisert av det høye membranpotensialet26,27.
  8. Titrat med aliquots på 0,5 μmol/L karbonylcyanid 4-(trifluorometoksy)fenylhydrazon (FCCP) (se Materialfortegnelse), mitokondrie-uncoupler, til det ikke er mulig å observere ytterligere økning i O 2-forbruket. For å fullføre eksperimentet, injiser 2 μl antimycin A til en endelig konsentrasjon på 5 μM og vent på strømningstabilisering.
    MERK: En reduksjon i H2O2-produksjonen observeres på grunn av membranpotensialspredningen etter injisering av FCCP. Antimycin A hemmer kompleks III, og forhindrer dermed strømmen av elektroner. Derfor er mitokondriavhengig O2-forbruk svekket, reduserer oksygenfluks per masse og stimulerer elektronlekkasje, og øker H2O2-produksjonen 26,27.
  9. Gå til kommandolinjen, søk etter "multisensorisk" i programvaren, klikk på Kontroll > Lagre fil og Koble fra.
    MERK: Tilsetningen av andre substrater og inhibitorer kan utføres i henhold til spørsmålet som studeres. Et eksempel er beskrevet i de representative resultatene. H2O2-kalibrering utføres etter at eksperimentet er fullført, i henhold til produsentens protokoll28.
  10. Åpne den lagrede filen og velg sporet "Oksygenfluks per masse" for å oppnå de eksperimentelle oksygenforbruksresultatene. Velg vinduet manuelt mellom injeksjoner ved å trykke på Skift + Venstre museknapp.
    1. Gå til Merker > statistikk for å visualisere resultatene for hver injeksjon av substrat/hemmere/ikke-sammenkoplet protokoll. For H2O2 produksjon, utfør samme prosedyre med "Amp-Slope" sporet.
      MERK: Når du velger vinduet, må du unngå artefakter av voluminjeksjoner ved å velge et vindu der oksygen (eller H2O2) er mer stabilt og konstant. Eksempler på valgte vinduer representeres av svarte klammeparenteser i de representative resultatene (figur 2 og figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mitokondrie oksygenforbruket av permeabilisert isjiasnerv er representert i figur 2. Det røde sporet representerer O 2-fluksen per enhetsmasse i pmol/s.mg. Etter å ha registrert et basalt oksygenforbruk med endogene substrater (rutinemessig respirasjon), injiseres succinate (SUCC) for å registrere kompleks II (succinat dehydrogenase)-drevet åndedrett, noe som resulterer i en økning i oksygenforbruket. I rekkefølge tilsettes en mettende konsentrasjon av ADP, aktiverer ATP-syntase og driver oksidativ fosforylering. Dette resulterer i en fosforylativ tilstand av mitokondrie respirasjon. Fosforylativ tilstandsrespirasjon betyr at ATP-syntase kan produsere ATP fra ADP + Pi (uorganisk fosfat) ved hjelp av membranpotensialet dannet av protongradienten som en protonmotivkraft for å generere ATP26. Med nedgangen i membranpotensialet fremmet av ATP-syntaseaktivitet, akselereres oksygenforbruket, og en økning i oksygenstrømmen observeres. Tilsetningen av eksogen cytokrom c (CYTC) fremmet bare minimal stimulering av respirasjon, sertifiserende mitokondrie ytre membranintegritet for dette preparatet. Permeabilisering av vev kan skade membranintegriteten og tap av cytokrom c. Økte respirasjonsrater på mer enn 10% -15% indikerer skadede mitokondrier og utilstrekkelig vevspreparat 28,29. I dette representative resultatet er det en økning på 8,7% i åndedrett, noe som indikerer god kvalitet på vevspreparatet (tabell 1). Titreringen med oligomycin (OLIGO) må gjøres med minimale doser for å unngå å nå en konsentrasjon av OLIGO som kan forstyrre maksimal kapasitetsevaluering30. Hemming av ATP-syntase ved OLIGO - eller tilstand 4 respirasjon ved oligomycin26 - resulterte i redusert oksygenforbruksstrøm. Titrering med FCCP, et mitokondrie-reagens, sprer mitokondrielt membranpotensial, stimulerer respirasjonsfluksen og viser maksimal kapasitet for elektronoverføring (ETS maksimal kapasitet). På slutten av eksperimentet injiseres antimycin A (AA), en hemmer av kompleks III, for å hemme mitokondrie-respirasjon og registrere ikke-mitokondrie oksygenforbruk (rest respirasjon) (figur 2). Absolutte oksygenstrømmer registrert i dette representative eksperimentet beregnes i tabell 1.

Muligheten for å analysere mitokondrie oksygenforbruk samtidig med reaktiv oksygenproduksjon (ROS) - bestemt ved å oppdage hydrogenperoksid (H2O2) av Amplex Red med fluorescenssensorer - er en stor fordel for å bestemme en bioenergetisk profil og et standardverktøy for påvisning av mitokondrie dysfunksjon i forskjellige patologier. Tilsetningen av forskjellige substrater for forskjellige komplekser for å drivstoff mitokondrie ETS kan også gi mer informasjon om de spesifikke stedene for mitokondrie dysfunksjon. Figur 3 vises med samtidig måling av oksygenforbruk (figur 3A) og ROS-produksjon (figur 3B) i nærvær av ulike underlag som gir drivstoff til kvotesystemet. Etter opptak av basal respirasjon legges pyruvat + malate (PM) til kammeret som et substrat for mitokondriekompleks I, noe som øker oksygenforbruket flux. Tilsetningen av SUCC, substratet til komplekse II, øker også åndedrett, men ytterligere tilsetning av palmitoylkarnitin (PC) øker ikke oksygenstrømmen sammenlignet med de tidligere substrattilsetningene, noe som tyder på at PM og SUCC allerede kan ha mettet mitokondrie ubiquinone-stedet eller mangel på fettsyreoksidasjon. Som forventet øker ROS-produksjonen også etter tilsetning av substrater, som representerer lekkasjen av oksygen som unnslipper fra ETS og danner ROS (figur 3B, grønn spor). Tilsetningen av ADP i mettende konsentrasjon øker oksygenforbruket, driver ATP-formasjon (rødt spor i figur 3A) og reduserer ROS-produksjonen (figur 3B, grønt spor). Tilsetningen av CYTC øker bare oksygenstrømmen med 6,8%, noe som bekrefter mitokondriemembranintegriteten. Titrering med OLIGO reduserer oksygenforbruksstrømmen (rød spor i figur 3A) og øker ROS-produksjonen (grønt spor i figur 3B). ADP- og OLIGO-effekter tyder på at permeabilisert isjiasnerve i denne protokollen kan gjenskape standardrelasjonen i mitokondriefysiologi, der en økning i oksygenforbruket fører til en reduksjon i membranpotensialet og forhindrer ROS-produksjon31,32.

Tilsetningen av FCCP, som forventet for en uncoupler, øker oksygenforbruket til maksimal hastighet, og som et resultat av membranpotensialspredning reduseres ROS-produksjonen. Tilsetningen av rotenon, en hemmer av kompleks I og AA, reduserer oksygenforbruket og øker ROS-formasjonen (figur 3A,B), som bekrefter at mitokondriefysiologi og bioenergetisk profil i permeabilisert isjiasnerve bevares. Absolutte verdier for oksygenstrømmer som er registrert i dette eksperimentet, beregnes i tabell 2.

Figure 1
Figur 1: Isjiasnervepreparat for permeabilisering av mitokondrier. Alle prosedyrene må utføres på is. (A) Isjiasnerven ekstraheres fra en euthanized mus og plasseres i en Petri-tallerken som inneholder vevsbevaringsbuffer ved 4 °C. (B) Separasjon av isjiasnervebunter med tang. (C,D) Vevet er klart når det dissekeres til gjennomsiktige tufts, i stedet for den opprinnelige hvite ugjennomsiktige rørformede strukturen (A). Skalastang = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt resultat av mitokondrie oksygenforbruk i musens permeabiliserte isjiasnerve. Eksperimentet er et representativt spor av en isjias nerve ekstrakt fra en euthanized mus. Isjiasnerven ble permeabilisert før, som beskrevet i protokollseksjonen. Injeksjoner er angitt som piler på bestemte tidspunkter. SUCC: succinate; ADP: adenosin difosfat; Cyt c: cytokrom c; OLIGO: oligomycin; FCCP: carbonylcyanid 4-(trifluorometoksy)fenylhydrazon; AA: antimycin A. Oksygenkonsentrasjon i sanntid som [nmol/ml] (blå spor) og oksygenforbruk som fluss per enhetsmasse [pmol/(s.mg)] (rød spor) vises. Svarte reguleringer representerer vinduer med oksygenforbrukshastigheter valgt for resultater etter hver injeksjon. Basal refererer til åndedrett uten substrater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Resultatet av mitokondrielt oksygenforbruk koblet til ROS-produksjon i permeabilisert mus isjiasnerven. Et representativt spor av en isjias nerve ekstrakt fra en euthanized mus er vist. Isjiasnerven ble permeabilisert før, som beskrevet i protokollseksjonen. Injeksjoner er angitt som piler på bestemte tidspunkter. H2O2: hydrogenperoksid; PM: pyruvat/malate; SUCC: succinate; PC: palmitoyl-karnitin; ADP: adenosin difosfat; Cyt c: cytokrom c; OLIGO: oligomycin; FCCP: carbonylcyanid 4-(trifluorometoksy)fenylhydrazon; ROT: rotenon; AA: antimycin A. (A) Oksygenkonsentrasjon i sanntid som [nmol/ml] (blå spor) og oksygenforbruk som flux per enhetsmasse [O2 pmol/(s.mg)] (rød spor) vises. (B) ROS-produksjon er demonstrert som H2O2 fluorescens (lilla spor) og H2O2 produksjonshelling [pmol/(s.mg)] (grønn spor), etter kalibrering. Svarte reguleringer representerer vinduer med oksygenforbrukshastigheter valgt for resultater etter hver injeksjon. Basal refererer til åndedrett uten substrater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Underlag Tillegg Oksygenforbruk
Flux per masse (pmol/[s.mg])
Basal (ingen tillegg) ingen 5.9
Succinate (SUCC) Ett tillegg på 10 mM 16.9
Adp Ett tillegg på 1 μM 28.5
Cytokrom c (CYTC) Ett tillegg på 10 μM 31
Oligomycin A (OLIGO) Titrering med tillegg på 0,2 μg/ml 21.9
FCCP Titrering med tillegg på 0,5 μM 31.1
Antimycin A (AA) Ett tillegg på 5 μM 11.3

Tabell 1: Substrater/Uncoupler/Inhibitors/Titration (SUIT)-protokoll og resultater av oksygenforbruk i muspermeabilisert isjiasnerve. Oksygenforbruket er representert i [O2pmol/(s.mg)], etter hver tilsetning av SUIT-protokollen. Resultatene oppnås ved gjennomsnittet av utvalgte vinduer som er merket i figur 2.

Underlag Tillegg Oksygenforbruk (O2 pmol/[s.mg]) ROS-produksjon (H2O2 pmol/[s.mg])
Basal (ingen tillegg) ingen 5.77 0.53
Pyruvat + Malate (PM) En puls på 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinate (SUCC) Ett tillegg på 10 mM 14.06 0.75
Palmitoylkarnitin (PC) To pulser på 25 μM 14.68 0.79
Adp Ett tillegg på 1 μM 22.9 0.25
Cytokrom c (CYTC) Ett tillegg på 10 μM 24.36 0.09
Oligomycin A (OLIGO) Titrering med tillegg på 0,2 μg/ml 17.03 0.5
FCCP Titrering med tillegg på 0,5 μM 23.98 0.16
Rotenone (ROT) Ett tillegg på 1μM 19.75 0.48
Antimycin A (AA) Ett tillegg på 5 μM 4.08 0.53

Tabell 2: Substrater/Uncoupler/Inhibitors/Titration (SUIT)-protokoll og resultater av ROS-produksjon kombinert med oksygenforbrukshastigheter muspermeabilisert isjiasnerve. Oksygenforbruket er representert i [O2 pmol/(s.mg)] og ROS-produksjon av [H2O2 pmol/(s.mg)] etter hvert tillegg av SUIT-protokollen. Resultatene oppnås ved gjennomsnittet av utvalgte vinduer som er merket i figur 3.

Parametere for mitokondriefunksjon Beregninger fra oksygenforbrukshastigheter
Basal åndedrett Basal respirasjon (flux uten tilsetning av substrater)28
Gjenværende oksygenforbruk (ROX) [Flux etter tilsetning av AA] 28
Kompleks jeg lekker åndedrett [Flux etter tilsetning av PM] – [ROX]28,37
Kompleks II-lekkasje respirasjon [Flux etter tilsetning av SUCC] – [ROX]28,37
Fosforylativ tilstand ( Oxphos kapasitet) [Flux etter tilsetning av ADP] – [ROX]28,43
Ikke - fosforylativ tilstand (lekkasje respirasjon) [Flux etter tilsetning av oligomycin] – [ROX]28
Forhold mellom åndedrettsvern [Fosforylativ tilstand / Ikke-fosforylativ] 28.43
ETS-kapasitet [Flux etter tilsetning av FCCP] – [ROX]28,37

Tabell 3: Beregning av parametere for evaluering av mitokondriefunksjon i muspermeabilisert isjiasnerve. Parametere for mitokondriefysiologi evaluering formel ved oksygenforbruk priser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere sykdommer eller tilstander som følger med nevropatier har mitokondrie dysfunksjon som en risikofaktor. Evalueringen av mitokondriefunksjon i perifere nerver er avgjørende for å belyse hvordan mitokondriene virker under disse nevrodegenerative forholdene. Vurderingen av mitokondriefunksjon er arbeidskrevende på grunn av vanskeligheten med isolasjonsmetoden og knappheten på materialet. Dermed er utviklingen av vevspermeabiliseringsteknikker som ikke krever isolering av mitokondrier viktig.

For å evaluere mitokondriefunksjon i permeabilisert vev, er det viktig å velge et kjemikalie som kan permeabilisere celleplasmamembranen uten å forstyrre cellerespirasjon. I perifere nerver som isjiasnerven er myelinsammensetning ca 70% lipid, hvorav de fleste er kolesterol 33,34. Valget av permeabiliserende midler som saponin og digitonin som samhandler med kolesterolmolekyler resulterer i porer som tillater substrat tilgang til mitokondriemaskiner uten å forstyrre andre cellulære rom35,36. I denne protokollen er den veletablerte metoden for muskelfiberpermeabilisering av saponin beskrevet av Pesta og Gnaiger24 tilpasset isjiasnervene. Permeabiliseringsprosedyren inkluderer et annet kritisk skritt angående vevsseparasjon for å gi tilgang til substrater etter behov for registrering av mitokondrieparametere av interesse. Det nåværende arbeidet beskriver trinnene, og illustrasjonene er gitt for en tilfredsstillende vevsseparasjon i figur 1.

Mitokondrie respiratoriske rater poster er avgjørende for å etablere forskjeller angående mitokondrier komplekser funksjonsfeil, oksidativ fosforyleringsforstyrrelse eller forstyrret mitokondrier. Respiratoriske forhold og mitokondrieparametere er definert av Chance og Williams26. I denne artikkelen er rutinemessig åndedrett definert som basal respirasjon når mitokondrie oksygenforbruk registreres uten tilsetning av eksogene substrater; kompleks kapasitet - når substrater for kompleks I eller II legges til drivstoff mitokondrie oksygenforbruk, også kalt lekkasje respirasjon; fosforylativ tilstand - når ADP tilsettes i sekvensen av komplekser substrater og driver ATP-syntese; ikke-fosforylativ tilstand - når all ADP dannes i ATP eller med tilsetning av ATP-syntasehemmer, oligomycin (eller tilstand 4); ETS maksimal kapasitet - når mitokondrie-uncoupler FCCP er lagt til og; gjenværende oksygenforbruk (ROX) etter tilsetning av rotenon og antimycin A - når oksygenforbruket ikke er relatert til mitokondrier. Teknikken beskrevet i dette arbeidet for mitokondriefunksjonsevaluering i isjiasnervevev av HRR gjør det mulig å bestemme mange respiratoriske tilstander og beregning av iboende mitokondriefunksjon i samme prøve. Et substrat/uncoupled/inhibitors protokolltestresultater kan brukes til å avlede parametere for mitokondriefunksjon som respiratoriske kontrollforhold/faktorer kan beregnesfra 37, som vist i tabell 3. Evaluering av disse parametrene kombinerer absolutte lekkasjerater, kombinert med maksimal mitokondrie-respirasjon, og øker data for en diagnostisk verdi 24,35,36,37,38,39.

Selv om mitokondrie dysfunksjon i perifere nerver er sitert i litteraturen, er det begrensninger i å demonstrere disse parametrene. I en kjemoterapi-indusert nevropatimodell observeres en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet i behandling med kjemoterapimiddelet, oksaliplatin og en reduksjon av in vitro-aktiviteten til komplekser I, II og III i sensoriske axoner av perifer nerve (saphenøs nerve)40,41. Det er imidlertid mangel på informasjon om kontrollen som utøves av membranpotensialet på kompleksets aktiviteter og dannelse av ATP ved oksidativ fosforylering, en viktig parameter i mitokondriefunksjonsevaluering. Også i dissosierte isjiasnerver fra Sprague-Dawley-rotter permeabilisert med digitonin, er registreringen av oksygenforbruk bare demonstrert for fosforylert tilstand, men sammenlignes ikke med oksygenforbruk i nærvær av en ATPase-hemmer eller en uncoupler22. I den nåværende metoden er det mulig å beregne respiratorisk kontrollforhold i permeabilisert nerve (tabell 3) sammenlignet med respiratorisk kontrollforhold for isolerte mitokondrier, vanligvis beregnet fra tilstand3 / state4 (eller fosforylering / ikke-fosforylende tilstander). Med metoden som er gitt i dette arbeidet, er det mulig å vurdere komplekse I, II kapasiteter - opprettholde mitokondriemembranintegritet - og fluxkontrollforhold, og oppnå maksimal kapasitetsrespirasjon og gjenværende oksygenforbruk.

Ulike metoder for isjiasnervepermeabilisering for mitokondrie oksygenforbruksevaluering er beskrevet i litteraturen. En teknikk for isjiasnervepermeabilisering er demonstrert i en protokoll med saponinbehandling og permeabilisering ved virvelpuls; Det ble imidlertid bare vist fosforylativ tilstand og maksimal kapasitetpå 41. I tillegg, sammenligning av verdiene som presenteres her for de samme parametrene, er oksygenfluksen observert av Cooper et al.41 70% lavere, noe som viser at det er skade på mitokondriemembranen relatert til agitasjonsmetoden. I den nåværende protokollen bevarer vevsseparasjonen mitokondriemembranintegritet, bekreftet av den lille økningen i oksygenfluks etter tilsetning av cytokrom c. Dette er en funksjon som gjør at alle mitokondrieparametere kan registreres, noe som gir en fullstendig oversikt over mitokondrie oksidativ fosforylering og funksjon. Selv om oksygenfluksverdiene i en isjiasnervepermeabiliseringsmetode med kollagenase er sammenlignbare med de som presenteres her, observeres en økning på nesten 20% etter å ha tilsende cytokrom c, noe som tyder på et visst nivå av mitokondriemembranskade21. Med protokollen beskrevet i denne artikkelen ble det observert en økning på bare 6,3% -8,7% oksygenfluks etter cytokrom c-tilsetning, noe som bekrefter fordelen med den nåværende metoden for å bevare mitokondriemembranintegriteten og optimalisere oksygenforbruksregistreringen.

Mitokondrier er det primære stedet for reaktiv oksygenart (ROS) generasjon forbundet med ulike signalprosesser i isjias nervevev og mekanismer relatert til patofysiologi i nevropatier42,43. Denne protokollen gjorde det mulig å få tilgang til hydrogenperoksidgenerering med en fluorescenssensor samtidig med oksygenforbruk. Som observert i figur 3 er ROS-produksjonen følsom for endringer i mitokondrie-respiratoriske tilstander, som bekrefter mitokondrieintegritetsstatusen og optimaliserer mitokondriefunksjonsopptak.

Andre metoder som ekstracellulær fluksanalysator (EFA), basert på fluorescenssensorer for å registrere oksygenforbruk, kan evaluere perifer nerve mitokondriefunksjon i dyrkede celler - som Schwann-celler eller aksoner - i en automatisert screeningenhet med høy gjennomstrømning. Det er imidlertid noen fordeler ved å bruke polarografiske sensorer som HRR, inkludert spesielt evnen til å følge eksperimentet i sanntid, for å lage flere injeksjoner av substrater / inhibitorer; Dermed tillater dette evaluering av et større antall komplekse funksjoner i mitokondrier i ett eksperiment, og lavere kostnader for forbruksvarer 24,35,38,39. En ulempe ved å bruke HRR sammenlignet med EFA er fraværet av en sensor for medieforsuring (for analyse av glykolytisk flux) og den begrensede arbeidsflytkapasiteten, som tillater bruk av bare to prøver om gangen.

Begrensninger av vevspermeabiliseringsteknikker som kreves for HRR er velkjente. De inkluderer manglende evne til å evaluere mitokondrier når ADP begrenser og redusert usammenhengende respiratorisk hastighet sammenlignet med isolerte mitokondrier. Imidlertid tillater saponin-isjiasnerven permeabiliseringsprotokollen beskrevet her - som en tilpasning av muskelfiberpermeabiliseringsprotokollen av Pesta og Gnaiger24 - vurderingen av mitokondrie respiratoriske tilstander og mitokondrieparametere uten å skade mitokondrieintegritet. Det gjør det også mulig å samtidig registrere oksygenforbruk og ROS-produksjon i isjiasnerven, et vev med beryktede begrensninger for å isolere mitokondrier. Dermed gir denne protokollen en bedre vurdering av mitokondriefunksjon i perifere nerver og kan gi fordeler for forskere i undersøkelsen av mitokondrieroller i patofysiologiske forhold som rammer perifere nerver.

Feilsøking
Hvis det er en økning i O2-forbruket etter å ha lagt cytokrom c til mer enn 15% av oksygenforbruket flux, indikerer det at permeabiliseringsprosedyren var veldig sterk og forårsaket skade på mitokondriestrukturen. Hvis det er tilfelle, kast og reiniter disseksjonen med en mildere nerveseparasjon og gjenta trinnene. Hvis noen reagenser som injiseres ikke viser forventet effekt i mitokondrienes oksygenforbruk eller H2O2-produksjon , skyldes det sannsynligvis kammerforurensning med mitokondriehemmere. I dette tilfellet kan to handlinger tas: (1) starte eksperimentet på nytt etter vask av kamrene og sprøytene (trinn 2.1) eller (2) legg til en prøve av vevisolerte mitokondrier eller homogenat før du utfører trinn 2.1. Tilleggene til disse prøvene vil absorbere mitokondriehemmere og forbedre rengjøringstrinnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi er takknemlige til Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli og Dr. Claudio Masuda for støtten med laboratoriefasiliteter, og Dr. Martha Sorenson for snille og verdifulle kommentarer for å forbedre artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Tags

Biokjemi utgave 183
Vurdering av mitokondriefunksjon i isjiasnerven ved høyoppløselig respirometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira,… More

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter