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Biochemistry

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Abstract

A disfunção mitocondrial nos nervos periféricos acompanha várias doenças associadas à neuropatia periférica, que podem ser desencadeadas por múltiplas causas, incluindo doenças autoimunes, diabetes, infecções, doenças hereditárias e tumores. Avaliar a função mitocondrial nos nervos periféricos do camundongo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho da amostra, a um número limitado de mitocôndrias presentes no tecido e a presença de uma bainha de mielina. A técnica descrita neste trabalho minimiza esses desafios usando um protocolo único de permeabilização adaptado de um usado para fibras musculares, para avaliar a função mitocondrial do nervo ciático em vez de isolar as mitocôndrias do tecido. Medindo a produção fluormétrica de espécies reativas com Amplex Vermelho/Peroxidase e comparando diferentes substratos mitocondriais e inibidores em nervos de saponina-permeabilized, foi possível detectar estados respiratórios mitocondriais, espécies reativas de oxigênio (ROS) e a atividade de complexos mitocondriais simultaneamente. Portanto, o método aqui apresentado oferece vantagens em relação à avaliação da função mitocondrial por outras técnicas.

Introduction

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos 1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por processos de fusão e fissão, e também possui máquinas para controle de qualidade e mitofagia 4,5,6.

A disfunção mitocondrial está associada ao aparecimento de várias condições patológicas, como câncer, diabetes e obesidade7. Distúrbios na função mitocondrial são detectados em distúrbios neurodegenerativos que afetam o sistema nervoso central, como na doença de Alzheimer 8,9, doença de Parkinson10,11, esclerose lateral amiotrófica12,13 e doença de Huntington14,15 . No sistema nervoso periférico, a perda da função mitocondrial em axônios é observada em neuropatias imunológicas, como a síndrome de Guillain-Barré16,17, e em associação com a alta produção de ROS mitocondrial em axônios, esses eventos levam à ativação do MAP Kinase em células schwann18. Isso demonstra que a fisiologia mitocondrial pode ser essencial não apenas para uma célula específica do local, mas para um tecido inteiro. Na polineuuropatia sensorial distal associada ao HIV (HIV-DSP), as mitocôndrias têm um papel no mecanismo pelo qual o trans-ativador da proteína de transcrição (HIV-TAT) permite que o HIV se replique eficientemente, bem como vários outros papéis na patogênese de infecção pelo HIV19,20.

A avaliação da fisiologia mitocondrial do nervo ciático emergiu como um alvo essencial para investigar a neuropatia 7,21,22. Na neuropatia diabética, análises proteômicas e metabolômicas sugerem que a maioria das alterações moleculares no diabetes afetam a fosforilação oxidativa do nervo ciático e o metabolismo lipídico7. Essas alterações também parecem ser sinais precoces de diabetes induzido pela obesidade21. Em um modelo de camundongos de neuropatia dolorosa induzida pela quimioterapia, o comprometimento mitocondrial no nervo ciático é detectado como uma diminuição na fosforilação oxidativa22, e uma redução das atividades de complexos mitocondriais, potencial de membrana e conteúdo ATP23. No entanto, embora vários grupos tenham citado disfunção mitocondrial em neuropatias, esses estudos estão limitados às medições de atividade em complexos mitocondriais sem preservação das membranas mitocondriais, sem avaliação da integridade mitocondrial ou medições de conteúdo ATP como parâmetro para a produção mitocondrial da ATP. Em geral, uma avaliação adequada do consumo mitocondrial de oxigênio e da produção de ROS requer o isolamento das mitocôndrias por centrifugação diferencial em um gradiente percoll/sacarose. O isolamento das mitocôndrias também pode ser um fator limitante para o tecido nervoso ciático devido à grande quantidade de tecido necessário e à perda e perturbação das mitocôndrias.

O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para medir a fisiologia mitocondrial como consumo mitocondrial de oxigênio e produção de ROS no nervo ciático, preservando membranas mitocondriais e sem a necessidade de isolar mitocôndrias. Este protocolo é adaptado a partir de medidas de consumo de oxigênio em fibras musculares permeabilizadas24 por respirometria de alta resolução (HRR). As vantagens desse procedimento são a possibilidade de avaliar mitocôndrias em pequenas quantidades de tecido, como o nervo ciático e avaliar parâmetros mitocondriais in situ, preservando assim o ambiente mitocondrial, estrutura e perfil bioenergésico, para obter um resultado fisiologicamente confiável. Os estados respiratórios mitocondriais foram determinados com substratos e inibidores após a permeabilização do nervo ciático para avaliar adequadamente o bioenergetics mitocondrial e o coeficiente c citocromo para a integridade da membrana mitocondrial, fornecendo um guia para etapas da avaliação do sistema de transporte eletrônico mitocondrial (ETS) e cálculo de parâmetros essenciais. Este estudo pode fornecer ferramentas para responder a perguntas em mecanismos fisiopatológicos nos quais o metabolismo do nervo ciático está implicado, como neuropatias periféricas.

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Protocol

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) e Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais experimentais. O nervo ciático é isolado de camundongos C57BL/6 machos de quatro meses de idade, eutanizados por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais. As etapas do protocolo são otimizadas para evitar a deterioração mitocondrial. Portanto, neste protocolo, a calibração dos sensores polarográficos de oxigênio foi realizada antes da dissecção do tecido nervoso ciático do camundongo e da permeabilização.

1. Preparação de reagentes

  1. Prepare o Tampão de Preservação do Tecido (Tampão TP).
    1. Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 10 mM de tampão Ca-EGTA com 0,1 μM de cálcio livre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de DTT, 6,56 mM de MgCl2, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabela de Materiais), pH 7.1. Armazene a -20°C.
  2. Prepare o Tampão de Respiração mitocôndria (Buffer MR).
    1. Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 0,5 mM de K2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarose, 1 mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos) (ver Tabela de Materiais), pH 7.4. Armazenar a -20 °C.
  3. Prepare a solução de estoque de saponin dissolvendo 5 mg de saponina (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de Tampão TP (passo 1.1) e mantenha-a no gelo. Saponina está preparada recentemente.
  4. Prepare o Amplex Red reutilizando o pó (ver Tabela de Materiais) com DMSO para obter uma concentração de estoque de 2 mM e armazenar a -20 °C em um frasco protegido contra a luz.
    NOTA: Para evitar o desgaste da sonda congelando e descongelando, faça pequenas alíquotas para armazenamento não superior a 6 meses25.

2. Calibração de sensores polarográficos de oxigênio para respirometria de alta resolução (HRR)

  1. Limpe as câmaras hrr do instrumento e das seringas (ver Tabela de Materiais).
    1. Abra as câmaras hrr, encha com água destilada até o topo e mexa por 5 min 3x. Repita com etanol e depois novamente com água. Lave rolhas e seringas com água/etanol/água 3x cada.
  2. Aplique as seguintes configurações de calibração no software HRR (ver Tabela de Materiais).
    1. No controle de software HRR, adicione a temperatura experimental (37 °C), os parâmetros para sensor de oxigênio (ganho, 2; tensão de polarização, 800 mV) e para sensor amperométrico (ganho, 1000; tensão de polarização, 100 mV).
  3. Calibrar os sensores de oxigênio.
    1. Pipeta 2,1 mL de Mr Buffer (passo 1.2) em cada câmara. Feche com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 °C por 1 h no modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa esteja estável.
    2. Realize uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio no software de acordo com o protocolo24 do fabricante.
      NOTA: A etapa de calibração só é realizada uma vez antes de um experimento. Experimentos adicionais no mesmo meio de respiração e temperatura podem ser realizados após mera lavagem de câmaras (etapa 2.1).

3. Dissecção e permeabilização do nervo ciático

  1. Remova o nervo ciático seguindo os passos abaixo.
    1. Eutanize o animal por deslocamento cervical depois de remover de sua gaiola e suavemente contido para descansar no banco.
    2. No animal eutanizado, faça uma incisão com uma tesoura na parte inferior das costas, começando perto da coluna e descendo a coxa em direção ao pé. Remova a pele e o músculo ligados ao nervo, e depois corte e remova todo o nervo ciático.
    3. Pesar o tecido imediatamente e colocá-lo em um frasco cheio de tampão de TB frio (4 °C). Faça as etapas 3.2-3.3 no gelo.
      NOTA: O peso do tecido molhado é usado para normalizar o consumo de oxigênio e o fluxo de produção de ROS nas etapas seguintes. Se o tecido não puder ser pesado imediatamente, conserva-o em tampão frio de TB. O procedimento é realizado em tecido fresco e não deve ser congelado para evitar danos mitocondriais.
  2. Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps, e com outro par de fórceps, puxe os feixes nervosos horizontalmente.
    NOTA: Este procedimento precisa ser feito em menos de 10 minutos para evitar a deterioração do tecido. O tecido estará pronto quando puder ser visualizado como camadas nebulosas transparentes, em frente ao tecido opaco branco anterior (Figura 1).
  3. Primeiro, transfira o tecido jogado em um pequeno prato contendo 1 mL de TP Buffer para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para um prato contendo 1 mL de TP Buffer e 10 μL de saponina (a partir da solução de estoque, passo 1.3).
    1. Agite em um agitador de microplaca suavemente por 30 minutos, depois transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo MR Buffer (1 mL) e agite suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada.

4. Consumo de oxigênio e determinação da produção de ROS

  1. Encha as câmaras hrr com 2,1 mL de Buffer MR, adicione Amplex Red (passo 1.4) a uma concentração final de 5 μM e peroxidase a 2 U/mL, e adicione o nervo ciático permeabilized (passo 3).
    1. Conecte os sensores de fluorescência do instrumento, desligue as luzes na seção de controle do software e pressione Conecte-se ao oxígrafo. Em "protocolos de edição" no software, insira o peso do tecido medido na etapa 3.1.3.
  2. Vá para "layout", escolha a opção "fluxo específico por amostra de unidade" e selecione Plots para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se desejar, a produção H2O2 . Espere ~10 min.
    NOTA: Este tempo é necessário para estabilizar o fluxo basal do consumo de oxigênio sem substrato adicionado (basal). Antes de novas injeções, certifique-se de que o fluxo de oxigênio esteja estabilizado.
  3. Injete dois pulsos de H2O2, cada um a uma concentração final de 260 μM, para calibração posterior na câmara.
  4. Injete 20 μL de succinato (ver Tabela de Materiais), um substrato complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial.
    NOTA: Diferentes substratos mitocondriais podem ser adicionados neste momento para avaliar a função mitocondrial por diferentes complexos. Os resultados representativos com substratos variados para os complexos mitocondriais I e II são mostrados nas Figuras 2 e Figura 3. Neste ponto, observa-se um aumento no consumo de O2 e H2O2 , simultaneamente, na Figura 3.
  5. Adicione 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para ativar a síntese de triptosfato de adenosina (ATP).
    NOTA: A ADP estimula a síntese de ATP e reduz o potencial da membrana. Espera-se que seja observado um aumento no consumo de O2 e uma diminuição na produção de H2O2.
  6. Em sequência, adicione 5 μL de citocromo c (ver Tabela de Materiais) como um indicador de integridade da membrana.
    NOTA: Se o tecido estiver bem preparado e permeabilizado, o citocromo c não deve aumentar o consumo de oxigênio em mais de 15%. Se ocorrer, verifique se há recomendações na seção de solução de problemas.
  7. Titulação com alíquotas de 0,2 μg/mL de oligomicina (ver Tabela de Materiais) até que não seja observada nenhuma diminuição adicional no consumo de O2 .
    NOTA: A oligomicina age inibindo a síntese de ATP levando a uma diminuição no fluxo O2 e um aprimoramento na formação H2O2 favorecida pelo potencial de alta membrana26,27.
  8. Titrate com alíquotas de 0,5 μmol/L de cianeto carbonil 4-(trifluorometoxy)fenilhydrazone (FCCP) (ver Tabela de Materiais), o uncoupler mitocondrial, até que seja possível não observar nenhum aumento adicional no consumo de O2 . Para terminar o experimento, injete 2 μl de antimicina A até uma concentração final de 5 μM e aguarde a estabilização do fluxo.
    NOTA: Observa-se uma diminuição na produção de H2O2 devido à dissipação potencial da membrana após a injeção de FCCP. A antimicina A inibe o complexo III, impedindo assim o fluxo de elétrons. Portanto, o consumo de O2 dependente de mitocôndrias é prejudicado, diminuindo o fluxo de oxigênio por massa e estimulando o vazamento de elétrons, aumentando a produção de H2O2 2 26,27.
  9. Vá para a barra de comando, procure por "multissensorial" no software, clique em Controle > Salvar arquivo e Desconecte.
    NOTA: A adição de outros substratos e inibidores pode ser realizada de acordo com a questão em estudo. Um exemplo é descrito nos resultados representativos. A calibração H2O2 é realizada após o término do experimento, de acordo com o protocolo28 do fabricante.
  10. Abra o arquivo salvo e selecione o traço "Fluxo de Oxigênio por Massa" para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio. Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando shift + botão esquerdo do mouse.
    1. Vá para Marks > Statistics para visualizar os resultados de cada injeção de substrato/inibidores/protocolo desacoplado. Para a produção de H2O2 , realize o mesmo procedimento com o traço "Amp-Slope".
      NOTA: Ao selecionar a janela, evite artefatos de injeções de volume escolhendo uma janela onde o oxigênio (ou H2O2) é mais estável e constante. Exemplos de janelas selecionadas são representados por aparelhos pretos nos resultados representativos (Figura 2 e Figura 3).

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Representative Results

O consumo mitocondrial de oxigênio pelo nervo ciático permeabilizado está representado na Figura 2. O traço vermelho representa o fluxo O2 por unidade em pmol/s.mg. Após registrar um consumo basal de oxigênio com substratos endógenos (respiração de rotina), o succinato (SUCC) é injetado para registrar a respiração complexa II (succinato deshidrogenase), resultando em um aumento na taxa de consumo de oxigênio. Em sequência, adiciona-se uma concentração saturada de ADP, ativando a synthase ATP e conduzindo a fosforilação oxidativa. Isso resulta em um estado fosforilativo da respiração mitocondrial. A respiração do estado fosforilativo significa que a synthase ATP pode produzir ATP a partir de ADP + Pi (fosfato inorgânico) usando o potencial de membrana formado pelo gradiente de prótons como uma força motivo de prótons para gerar ATP26. Com a diminuição do potencial de membrana promovida pela atividade de sinthase ATP, o consumo de oxigênio é acelerado, e observa-se um aumento no fluxo de oxigênio. A adição de citocromo exógeno c (CYTC) promoveu apenas uma estimulação mínima da respiração, certificando a integridade da membrana externa mitocondrial para esta preparação. A permeabilização dos tecidos pode danificar a integridade da membrana e a perda de citocromo c. O aumento das taxas de respiração de mais de 10%-15% indica mitocôndrias danificadas e preparação inadequada de tecidos28,29. Nesse resultado representativo, há um aumento de 8,7% na respiração, indicando boa qualidade da preparação do tecido (Tabela 1). A titulação com oligomicina (OLIGO) precisa ser feita com doses mínimas para evitar atingir uma concentração de OLIGO que pode interferir na avaliação máxima da capacidade30. A inibição da synthase ATP pelo OLIGO - ou respiração do estado 4 por oligomicina26 - resultou na diminuição do fluxo de consumo de oxigênio. A titulação com FCCP, um reagente não-acoupler mitocondrial, dissipa o potencial da membrana mitocondrial, estimulando o fluxo respiratório e exibindo a capacidade máxima de transferência de elétrons (capacidade máxima de ETS). Ao final do experimento, a antimicina A (AA), inibidora do complexo III, é injetada para inibir a respiração mitocondrial e registrar o consumo de oxigênio não mitocondrial (respiração residual) (Figura 2). Os fluxos absolutos de oxigênio registrados neste experimento representativo são calculados na Tabela 1.

A possibilidade de analisar o consumo mitocondrial de oxigênio simultaneamente com a produção reativa de oxigênio (ROS) - determinada pela detecção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por Amplex Red com sensores de fluorescência - é uma grande vantagem para determinar um perfil bioenergénico e uma ferramenta padrão para a detecção de disfunção mitocondrial em diversas patologias. A adição de diferentes substratos para diferentes complexos para alimentar o ETS mitocondrial também pode produzir mais informações sobre os locais específicos para disfunção mitocondrial. A Figura 3 é mostrada com medição simultânea do consumo de oxigênio (Figura 3A) e produção ros (Figura 3B) na presença de diferentes substratos que fornecem combustível para o ETS. Após a gravação da respiração basal, o piruvato + malato (PM) é adicionado à câmara como um substrato para o complexo mitocondrial I, aumentando o fluxo de consumo de oxigênio. A adição de SUCC, o substrato do complexo II, também aumenta a respiração, mas a adição adicional de palmitoyl-carnitina (PC) não aumenta o fluxo de oxigênio em comparação com as adições anteriores de substrato, sugerindo que pm e SUCC podem já ter saturado o sítio mitocondrial ubiquinona ou a falta de oxidação de ácidos graxos. Como esperado, a produção de ROS também aumenta após a adição de substratos, representando o vazamento de oxigênio que escapa do ETS e forma ROS (Figura 3B, traço verde). A adição de ADP na concentração saturada aumenta o consumo de oxigênio, impulsionando a formação de ATP (traço vermelho na Figura 3A) e diminuindo a produção de ROS (Figura 3B, traço verde). A adição de CYTC só aumenta o fluxo de oxigênio em 6,8%, confirmando a integridade da membrana mitocondrial. A titulação com OLIGO diminui o fluxo de consumo de oxigênio (traço vermelho na Figura 3A) e aumenta a produção de ROS (traço verde na Figura 3B). Os efeitos ADP e OLIGO sugerem que o nervo ciático permeabilizizado neste protocolo pode replicar a relação padrão na fisiologia mitocondrial, na qual um aumento no consumo de oxigênio leva a uma diminuição do potencial de membrana e impede a produção de ROS31,32.

A adição de FCCP, como esperado para um desacoplador, aumenta o consumo de oxigênio para sua taxa máxima, e como resultado da dissipação potencial da membrana, a produção de ROS é diminuída. A adição de rotenona, um inibidor do complexo I e AA, reduz o consumo de oxigênio e aumenta a formação de ROS (Figura 3A,B), confirmando que a fisiologia mitocondrial e o perfil bioenergéstico no nervo ciático permeabilized são preservados. Os valores absolutos para os fluxos de oxigênio registrados neste experimento são calculados na Tabela 2.

Figure 1
Figura 1: Preparação do nervo ciático para permeabilização das mitocôndrias. Todos os procedimentos precisam ser realizados no gelo. (A) O nervo ciático é extraído de um rato eutanizado e colocado em uma placa de Petri contendo tampão de preservação do tecido a 4 °C. (B) Separação de feixes de nervo ciático com fórceps. (C,D) O tecido está pronto quando é dissecado em tufos translúcidos, em vez da estrutura tubular branca original (A). Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultado representativo do consumo mitocondrial de oxigênio no nervo ciático permeabilized do camundongo. O experimento é um traço representativo de um extrato de nervo ciático de um rato eutanizado. O nervo ciático foi permeabilizado antes, como descrito na seção de protocolo. As injeções são indicadas como setas em horários específicos. SUCC: sucuccinato; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy)fenilhidrazone; AA: a concentração de oxigênio em tempo real como [nmol/mL] (traço azul) e taxa de consumo de oxigênio como fluxo por unidade de massa [pmol/(s.mg)] (traço vermelho) são mostrados. As chaves pretas representam janelas de taxas de consumo de oxigênio selecionadas para resultados após cada injeção. Basal refere-se à respiração sem substratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O resultado do consumo de oxigênio mitocondrial associado à produção de ROS no nervo ciático do camundongo permeabilizado. Um traço representativo de um extrato de nervo ciático de um rato eutanizado é mostrado. O nervo ciático foi permeabilizado antes, como descrito na seção de protocolo. As injeções são indicadas como setas em horários específicos. H2O2: peróxido de hidrogênio; PM: piruvato/malate; SUCC: sucuccinato; PC: palmitoyl-carnitina; ADP: difosfato de adenosina; Cyt c: citocromo c; OLIGO: oligomicina; FCCP: cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy)fenilhidrazone; ROT: rotenone; AA: a concentração de oxigênio em tempo real como [nmol/mL] (traço azul) e taxa de consumo de oxigênio como fluxo por massa unitária [O2 pmol/(s.mg)] (traço vermelho) são mostrados. (B) A produção de ROS é demonstrada como fluorescência H2O2 (traço roxo) e inclinação de produção H2O2 [pmol/(s.mg)] (traço verde), após calibração. As chaves pretas representam janelas de taxas de consumo de oxigênio selecionadas para resultados após cada injeção. Basal refere-se à respiração sem substratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Substratos Adições Taxa de Consumo de Oxigênio
Fluxo por massa (pmol/[s.mg])
Basal (sem adição) nenhum 5.9
Succinato (SUCC) Uma adição de 10 mM 16.9
ADP Uma adição de 1 μM 28.5
Citocromo c (CYTC) Uma adição de 10 μM 31
Oligomicina A (OLIGO) Titulação com adições de 0,2 μg/mL 21.9
FCCP Titulação com adições de 0,5 μM 31.1
Antimicina A (AA) Uma adição de 5 μM 11.3

Tabela 1: Substratos/Desacontedores/Inibidores/Titulação (SUIT) e resultados das taxas de consumo de oxigênio no nervo ciático permeabilizado do rato. O consumo de oxigênio é representado em [O2pmol/(s.mg)], após cada adição do protocolo SUIT. Os resultados são obtidos pela média das janelas selecionadas marcadas na Figura 2.

Substratos Adições Consumo de oxigênio (O2 pmol/[s.mg]) Produção ROS (H2O2 pmol/[s.mg])
Basal (sem adição) nenhum 5.77 0.53
Piruvanato + Malato (PM) Um pulso de 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinato (SUCC) Uma adição de 10 mM 14.06 0.75
Carnitina palmitoyl (PC) Dois pulsos de 25 μM 14.68 0.79
ADP Uma adição de 1 μM 22.9 0.25
Citocromo c (CYTC) Uma adição de 10 μM 24.36 0.09
Oligomicina A (OLIGO) Titulação com adições de 0,2 μg/mL 17.03 0.5
FCCP Titulação com adições de 0,5 μM 23.98 0.16
Rotenone (ROT) Uma adição de 1μM 19.75 0.48
Antimicina A (AA) Uma adição de 5 μM 4.08 0.53

Tabela 2: Substratos/Desacontedores/Inibidores/Titulação (SUIT) protocolo e resultados da produção de ROS acoplados às taxas de consumo de oxigênio que o camundongo permeabilized nervo ciático. O consumo de oxigênio é representado na produção [O2 pmol/(s.mg)] e ros por [H2O2 pmol/(s.mg)] após cada adição do protocolo SUIT. Os resultados são obtidos pela média das janelas selecionadas marcadas na Figura 3.

Parâmetros para função mitocondrial Cálculos das taxas de consumo de oxigênio
Respiração Basal Respiração Basal (fluxo sem adição de substratos)28
Consumo residual de oxigênio (ROX) [Fluxo após a adição de AA] 28
Complexo eu vazo respiração [Fluxo após adição de PM] – [ROX]28,37
Respiração de vazamento complexo II [Fluxo após adição de SUCC] – [ROX]28,37
Estado fosforilativo (capacidade oxphos) [Fluxo após adição de ADP] – [ROX]28,43
Não - estado fosforilativo (Respiração de Vazamento) [Fluxo após adição de oligomicina] – [ROX]28
Razão de Controle Respiratório [Estado fosforilativo / Não fosforilativo] 28,43
Capacidade de ETS [Fluxo após adição de FCCP] – [ROX]28,37

Tabela 3: Cálculo de parâmetros para avaliação da função mitocondrial no nervo ciático permeabilized do camundongo. Parâmetros para a fórmula de avaliação da fisiologia mitocondrial por taxas de consumo de oxigênio.

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Discussion

Várias doenças ou condições que acompanham neuropatias têm disfunção mitocondrial como fator de risco. A avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos é essencial para elucidar como as mitocôndrias agem nessas condições neurodegenerativas. A avaliação da função mitocondrial é trabalhosa devido à dificuldade do método de isolamento e à escassez de material. Assim, o desenvolvimento de técnicas de permeabilização tecidual que não requerem o isolamento das mitocôndrias é essencial.

Para avaliar a função mitocondrial em tecidos permeabilizados, escolher um produto químico que possa permeabiliizar a membrana plasmática celular sem interferir na respiração celular é fundamental. Em nervos periféricos como o nervo ciático, a composição da mielina é de cerca de 70% lipídica, a maioria dos quais são colesterol33,34. A escolha de agentes permeabilizadores como saponina e digitonina que interagem com moléculas de colesterol resulta em poros que permitem acesso substrato a máquinas mitocondriais sem interferir com outros compartimentos celulares35,36. Neste protocolo, o método bem estabelecido para permeabilização de fibra muscular por saponina descrita por Pesta e Gnaiger24 é adaptado para os nervos ciáticos. O procedimento de permeabilização inclui outra etapa crítica em relação à separação tecidual para permitir o acesso de substratos conforme necessário para o registro de parâmetros mitocondriais de interesse. O presente trabalho descreve as etapas, e as ilustrações são fornecidas para uma separação satisfatória do tecido na Figura 1.

Os registros de taxas respiratórias mitocondriais são essenciais para estabelecer diferenças em relação ao mau funcionamento dos complexos mitocôndrias, perturbação da fosforilação oxidativa ou mitocôndrias interrompidas. As condições respiratórias e os parâmetros mitocondriais são definidos por Chance e Williams26. Neste artigo, a respiração de rotina é definida como respiração basal quando o consumo mitocondrial de oxigênio é registrado sem adição de substratos exógenos; complexos capacidade - quando substratos para complexo I ou II são adicionados ao consumo de oxigênio mitocondrial de combustível, também chamado de respiração de vazamento; estado fosforilativo - quando a ADP é adicionada na sequência de substratos complexos e impulsiona a síntese de ATP; estado não fosforilativo - quando todo ADP é formado em ATP ou com a adição de inibidor de synthase ATP, oligomicina (ou estado 4); Capacidade máxima de ETS - quando o uncoupler mitocondrial FCCP é adicionado e; consumo residual de oxigênio (ROX) após a adição de rotenona e antimicina A - quando o consumo de oxigênio não está relacionado às mitocôndrias. A técnica descrita neste trabalho para avaliação da função mitocondrial no tecido nervoso ciático pelo HRR permite determinar numerosos estados respiratórios e o cálculo da função mitocondrial intrínseca dentro da mesma amostra. Os resultados do protocolo de protocolo de substrato/desacoplado/inibidor podem ser usados para derivar parâmetros da função mitocondrial a partir do qual as razões/fatores de controle respiratório podem ser calculadas37, como demonstrado na Tabela 3. A avaliação desses parâmetros combina taxas absolutas de vazamento, juntamente com respiração mitocondrial máxima, e levanta dados para um valor diagnóstico 24,35,36,37,38,39.

Embora a disfunção mitocondrial nos nervos periféricos seja citada na literatura, há limitações na demonstração desses parâmetros. Em um modelo de neuropatia induzida pela quimioterapia, observa-se uma diminuição do potencial da membrana mitocondrial no tratamento com o agente quimioterápico, oxaliplatina, e uma redução da atividade in vitro dos complexos I, II e III nos axônios sensoriais do nervo periférico (nervo safeno)40,41. No entanto, há falta de informação sobre o controle exercido pelo potencial de membrana nas atividades e formação de ATP dos complexos por fosforilação oxidativa, parâmetro essencial na avaliação da função mitocondrial. Além disso, em nervos ciáticos dissociados de ratos sprague-dawley permeabilizados com digitonina, o registro do consumo de oxigênio só é demonstrado para o estado fosforilado, mas não é comparado com o consumo de oxigênio na presença de um inibidor de ATPase ou um22 não-acoplado. No presente método, é possível calcular a razão de controle respiratório no nervo permeabilizado (Tabela 3) em comparação com a razão de controle respiratório de mitocôndrias isoladas, geralmente calculada a partir de estados3/estado4 (ou estados fosforilativos/não fosforilativos). Com o método previsto neste trabalho, é possível avaliar as capacidades complexas I, II - mantendo a integridade da membrana mitocondrial - e as relações de controle de fluxo, e alcançar a respiração máxima da capacidade e o consumo residual de oxigênio.

Diferentes métodos para permeabilização do nervo ciático para avaliação do consumo mitocondrial de oxigênio são descritos na literatura. Uma técnica de permeabilização do nervo ciático é demonstrada em protocolo com tratamento de saponina e permeabilização por pulso de vórtice; no entanto, apenas estado fosforilativo e capacidade máxima foram demonstrados41. Além disso, comparando os valores aqui apresentados para os mesmos parâmetros, o fluxo de oxigênio observado por Cooper et al.41 é 70% menor, demonstrando que há danos na membrana mitocondrial relacionados ao método de agitação. No presente protocolo, a separação do tecido preserva a integridade da membrana mitocondrial, confirmada pelo pequeno aumento do fluxo de oxigênio após a adição de citocromo c. Esta é uma característica que permite que todos os parâmetros mitocondriais sejam registrados, fornecendo um registro completo de fosforilação oxidativa mitocondrial e função. Embora em um método de permeabilização do nervo ciático com colagemnase, os valores de fluxo de oxigênio são comparáveis aos apresentados aqui, um aumento de quase 20% é observado após a adição de citocromo c, sugerindo algum nível de dano da membrana mitocondrial21. Com o protocolo descrito neste artigo, observou-se um aumento de apenas 6,3%-8,7% do fluxo de oxigênio após a adição do citocromo c, confirmando a vantagem do presente método na preservação da integridade da membrana mitocondrial e na otimização do registro do consumo de oxigênio.

Mitocôndrias são o local principal da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) associadas a diversos processos de sinalização no tecido nervoso ciático e mecanismos relacionados à fisiopatologia em neuropatias42,43. Este protocolo possibilitou o acesso à geração de peróxido de hidrogênio com um sensor de fluorescência simultaneamente com o consumo de oxigênio. Como observado na Figura 3, a produção de ROS é sensível a alterações de estados respiratórios mitocondriais, confirmando o estado de integridade mitocondrial e otimizando o registro da função mitocondrial.

Outros métodos, como o analisador de fluxo extracelular (EFA), baseado em sensores de fluorescência para registrar o consumo de oxigênio, podem avaliar a função mitocondrial do nervo periférico em células cultivadas - como células schwann ou axônios - em um dispositivo automatizado de triagem de alto rendimento. No entanto, existem algumas vantagens no uso de sensores polarográficos como o HRR, incluindo, em particular, a capacidade de seguir o experimento em tempo real, de fazer múltiplas injeções de substratos/inibidores; assim, isso permite a avaliação de um maior número de funções complexas nas mitocôndrias em um experimento, e o menor custo de consumíveis 24,35,38,39. Uma desvantagem do uso do HRR em comparação com a EFA é a ausência de um sensor para acidificação de mídia (para análise do fluxo glicóltico) e a capacidade limitada de fluxo de trabalho, que permite o uso de apenas duas amostras por vez.

As limitações das técnicas de permeabilização tecidual exigidas para o HRR são bem conhecidas. Eles incluem a incapacidade de avaliar mitocôndrias quando a ADP está limitando e uma taxa respiratória não acoplada reduzida em comparação com mitocôndrias isoladas. No entanto, o protocolo de permeabilização do nervo péptico de saponin-ciática descrito aqui - como uma adaptação do protocolo de permeabilização de fibras musculares por Pesta e Gnaiger24 - permite a avaliação de estados respiratórios mitocondriais e parâmetros mitocondriais sem prejudicar a integridade mitocondrial. Também permite o registro simultâneo do consumo de oxigênio e da produção de ROS no nervo ciático, um tecido com notórias limitações para isolar mitocôndrias. Assim, este protocolo permite uma melhor avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos e pode proporcionar vantagens aos pesquisadores na investigação de papéis mitocondriais em condições fioficológicas que afligem nervos periféricos.

Solucionando problemas
Se houver um aumento no consumo de O2 após a adição de citocromo c a mais de 15% do fluxo de consumo de oxigênio, indica que o procedimento de permeabilização foi muito forte e causou danos à estrutura mitocondrial. Se esse for o caso, descarte e reinicie a dissecção com uma separação mais suave do nervo e repita os passos. Se alguns reagentes injetados não demonstrarem o efeito esperado no consumo de oxigênio mitocôndria ou na produção de H2O2 , provavelmente é devido à contaminação da câmara com inibidores mitocondriais. Neste caso, duas ações podem ser tomadas: (1) reiniciar o experimento após lavar as câmaras e seringas (etapa 2.1) ou (2) adicionar uma amostra de qualquer mitocôndria isolada de tecido ou homogeneizar antes de realizar a etapa 2.1. As adições dessas amostras absorverão os inibidores mitocondriais e melhorarão a etapa de limpeza.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O estudo foi financiado pelo Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Antonio Galina Filho, à Dra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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Bioquímica Edição 183
Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução
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Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

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