Summary
تمثل محللات الصفائح الدموية أداة ناشئة لعلاج أمراض سطح العين. هنا ، نقترح طريقة لإعداد وتوزيع وتخزين وتوصيف محللات الصفائح الدموية التي تم جمعها من المتبرعين بالصفائح الدموية.
Abstract
يتم علاج أمراض سطح العين المختلفة بقطرات العين المشتقة من الدم. تم إدخال استخدامها في الممارسة السريرية بسبب محتواها من المستقلب وعامل النمو ، مما يعزز تجديد سطح العين. يمكن تحضير قطرات العين القائمة على الدم من مصادر مختلفة (أي التبرع بالدم الكامل أو فصادة الصفائح الدموية) ، وكذلك مع بروتوكولات مختلفة (على سبيل المثال ، التخفيفات المختلفة ودورات التجميد / الذوبان). هذا التباين يعوق توحيد البروتوكولات السريرية ، وبالتالي تقييم فعاليتها السريرية. وقد يسهم تفصيل الإجراءات المنهجية وتبادلها في تحديد مبادئ توجيهية مشتركة. على مدى السنوات الماضية ، تم نشر المنتجات الخيفية كبديل للعلاجات الذاتية لأنها تضمن معايير فعالية أعلى. من بينها ، يتم تحضير قطرات العين الغنية بالبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP-L) بإجراءات تصنيع بسيطة. في وحدة طب نقل الدم في AUSL-IRCCS di Reggio Emilia ، إيطاليا ، يتم الحصول على PRP-L من التبرع بفصادة الصفائح الدموية. يتم تخفيف هذا المنتج في البداية إلى 0.3 × 10 9 صفائح دموية / مل (بدءا من متوسط تركيز 1 × 10 9 صفائح دموية / مل) في0.9٪ كلوريد الصوديوم. يتم تجميد / إذابة الصفائح الدموية المخففة ، وبالتالي يتم طردها بالطرد المركزي لإزالة الحطام. ينقسم الحجم النهائي إلى 1.45 مل من القسمة ويخزن عند -80 درجة مئوية. قبل صرفها للمرضى ، يتم اختبار قطرات العين للعقم. يمكن للمرضى تخزين محللات الصفائح الدموية في -15 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. يتم تقييم تكوين عامل النمو أيضا من القسمة المختارة عشوائيا ، ويتم الإبلاغ عن القيم المتوسطة هنا.
Introduction
تستخدم المنتجات المشتقة من الدم على نطاق واسع في العناية بالجروح1 ، وجراحة الوجه والفكين والعظام ، ولعلاج أمراض سطح العين المختلفة2 مثل مرض جفاف العين (DED) 3. في DED ، يضعف توازن الفيلم المسيل للدموع نتيجة للأداء غير الطبيعي للعوامل المختلفة المشاركة في إنتاج المسيل للدموع وسلامة سطح العين 4,5.
تتميز DED بعدم التجانس في الأسباب والشدة6،7،8 وقد تكون نتيجة لعوامل مختلفة مثل الشيخوخة أو الجنس9 أو العدسات اللاصقة أو الأدوية الموضعية أو الجهازية 10 أو الحالات الموجودة مسبقا مثل متلازمة سجوجرن10. على الرغم من وجود أعراض خفيفة ، تؤثر دائرة التنمية الاقتصادية على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم ، مما يؤثر على نوعية حياتهم والنظام الصحي أيضا6.
تم الإبلاغ عن العديد من العلاجات لهذا المرض ، ولكن لا يوجد حتى الآن توافق في الآراء حول الحل الأكثر فعالية12. حتى الآن ، الدموع الاصطناعية هي الخط الأول من العلاج الذي يهدف إلى استعادة التركيب المائي للفيلم المسيل للدموع ، وإن كانت هذه البدائل لا تحتوي على المواد المذابة النشطة بيولوجيا الرئيسية للدموع الطبيعية 6,11. تعتبر المنتجات القائمة على الصفائح الدموية بديلا صالحا12,13 للدموع الاصطناعية ، على الرغم من أن فعاليتها السريرية وتوصيات الاستخدام وطرق التحضير لا تزال موضع نقاش3.
تشترك المنتجات القائمة على الدم مع الدموع في تركيبة مماثلة من حيث المستقلبات14 والبروتينات والدهون والفيتامينات والأيونات وعوامل النمو (GFs) والمركبات المضادة للأكسدة 11 والأسمولية (300 mOsm / L)11. من خلال النشاط التآزري لمكوناتها ، فإنها تعزز تجديد ظهارة القرنية ، وتمنع إطلاق السيتوكينات الالتهابية ، وتزيد من عدد الخلايا الكأسية والتعبير عن الميوسين في الملتحمة 2,3.
حتى الآن ، تم توثيق عدم التجانس في المنتجات القائمة على الدم العينية في الأدبيات. يمكن تصنيف هذه المنتجات وفقا لأصل المتبرعين بالدم ، أي ذاتي أو خيفي ، وكذلك مصدر الدم ، أي الدم المحيطي أو دم الحبل السري أو المصل أو الصفائح الدموية.
على الرغم من أن المنتجات الذاتية كانت الأكثر انتشارا3 ، إلا أن المنتجات الخيفية أصبحت الآن الخيار المفضل ، لأنها تضمن معايير فعالية وسلامة أعلى 15 ، إلى جانب انخفاض كبير في التكاليف16,17. أثبتت الدراسات السابقة ، في الواقع ، أن المنتجات القائمة على الدم التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية و / أو الجهازية قد تظهر جودة ووظائف متغيرة6،16،17. على الرغم من حقيقة أن قطرات العين القائمة على المصل هي الأكثر انتشارا ، إلا أن المنتجات القائمة على الصفائح الدموية أصبحت مؤخرا مؤكدة كبديل صالح ، حيث يمكن تحضيرها بسهولة مع الحفاظ على مستويات كبيرة من الفعالية 3,11. يمكن تقسيم المنتجات القائمة على الصفائح الدموية المتاحة حاليا إلى بلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP) ، ومحللة بلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP-L) ، وبلازما غنية بعوامل النمو (PRGF)3.
من بينها ، يتمتع PRP-L بميزة كونه منتجا مجمدا طويل العمر. يمكن تحضير PRP-L من الفصادة أو المعاطف أو حتى من الصفائح الدموية منتهية الصلاحية (PLTs)18,19 ، مما يقلل من هدرها. يمكن تخزين القسمة لعدة أشهر في مراكز نقل الدم عند -80 درجة مئوية أو حتى في منازل المرضى عند -15 درجة مئوية لفترات أقصر.
PRP-L غني للغاية في GFs ، والتي ثبت أنها تحفز تجديد سطح العين12،20،21. ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات السريرية المبلغ عنها في هذا المجال ، وكلها تستخدم مصادر ذاتية 3,22. لا يزال PRP-L بحاجة إلى مزيد من التحقق والتوصيف قبل أن يتم استخدامه بشكل روتيني لعلاج أمراض سطح العين ، حيث لا توجد إرشادات موحدة لإعداده وتوزيعه وتخزينه3.
هنا ، يتم مشاركة بروتوكول مفصل لإنتاج PRP-L المستخدم في وحدة طب نقل الدم في AUSL-IRCCS di Reggio Emilia ، إيطاليا ، والاستغناء عن المرضى الذين يعانون من DED. نهدف إلى مساعدة المجتمع العلمي على تطوير طرق قياسية للتحضير ، والتي قد تزيد من التجانس والاتساق في الدراسات والأساليب السريرية في جميع أنحاء العالم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع PRP-L المستخدم للتقييم الكمي لعوامل النمو ضمن دراسة أوسع حول توصيف منتجات PRP لأغراض التجديد ، والتي أجريت في AUSL-IRCCS di Reggio Emilia ووافقت عليها لجنة أخلاقيات المنطقة Vasta Emilia Nord في 10 يناير 2019 (رقم البروتوكول 2019/0003319). أعطى المانحون موافقتهم المستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي. لم تكن الموافقة الأخلاقية ضرورية لجمع البيانات المجمعة والمجهولة لاستبيان مؤشر أمراض سطح العين (OSDI) ، والذي يستخدمه الأطباء بشكل روتيني لمراقبة أعراض متلازمة العين الجافة. يوضح الشكل 1 أ مخططا للبروتوكول المتبع ، بينما توضح الصور في الشكل 1 ب الخطوات الرئيسية للإجراء.
1. مجموعة البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP)
- فصادة PRP
- بالنسبة لهذا البروتوكول ، حدد المتبرعين بالصفائح الدموية وفقا للقوانين الإيطالية: يجب أن يتراوح عمر المتبرعين بالصفائح الدموية بين 18 و 65 عاما ، مع الضغط الطبيعي ومعلمات تعداد الدم وعدد الصفائح الدموية لا يقل عن 180 × 109 صفائح دموية / لتر23. لا يمكن للمتبرعين المؤهلين تناول الأدوية المضادة للصفيحات أو مضادات التخثر في غضون 1 أسبوع قبل التبرع.
- إجراء فصادة البلازما والصفائح الدموية باستخدام نظام آلي لجمع الدم ، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة والقوانين الوطنية23 ، للحصول على 1 وحدة من البلازما الغنية بالصفائح الدموية من متبرع واحد (PRP). جمع PRP في الأدينين سيترات سكر العنب الحل A (ACD-A) محلول مضاد للتخثر.
ملاحظة: يتم إجراء فصادة الصفائح الدموية مع إجراء مستمر. يتراوح وقت التجميع بين 40 دقيقة و 90 دقيقة. تعتمد كمية ACD التي يتم تسليمها إلى المتبرعين ووقت الإجراءات على خصائص المتبرع ، على سبيل المثال ، مقياس الهيماتوكريت والإبرة.
- خصائص وحدات PRP
ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ الخطوة التالية تلقائيا بواسطة نظام جمع الدم الآلي أثناء إجراء فصادة البلازما والصفائح الدموية. يرجى مراجعة دليل تعليمات الشركة المصنعة.- إعادة تعليق وحدات PRP التي تم جمعها عن طريق الفصادة في كمية كافية من محلول حافظة مع الحد الأدنى من كمية البلازما المتبقية ، اللازمة للحفاظ على درجة الحموضة > 6.4 خلال فترة التخزين بأكملها ، إلى متوسط حجم نهائي يبلغ 180 مل صافي من المحلول المضاد للتخثر (حوالي 40 مل).
ملاحظة: وفقا للقانون الإيطالي ، يجب أن تقيم ضوابط الجودة أن عدد الصفائح الدموية (PLTs) لا يقل عن 2.0 × 10 11 PLTs / وحدة ، في حين أن الكريات البيض المتبقية يجب أن تكون أقل من 1 ×10 6 خلايا / وحدة. - قم بتخزين البلازما الغنية بالصفائح الدموية المشعة والمشعة لمدة أقصاها 5 أيام عند 22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية على شاكر الصفائح الدموية قبل مزيد من التلاعب23.
- إعادة تعليق وحدات PRP التي تم جمعها عن طريق الفصادة في كمية كافية من محلول حافظة مع الحد الأدنى من كمية البلازما المتبقية ، اللازمة للحفاظ على درجة الحموضة > 6.4 خلال فترة التخزين بأكملها ، إلى متوسط حجم نهائي يبلغ 180 مل صافي من المحلول المضاد للتخثر (حوالي 40 مل).
- تخفيف PRP
- مباشرة قبل بدء تخفيف PRP ، قم بإجراء عدد PLT باستخدام مقياس الدم باستخدام العينة التي تم جمعها من الكيس الرئيسي من خلال مسمار ثقب.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في العقم تحت غطاء الخطر البيولوجي من الفئة الثانية. ارتد معدات الحماية الشخصية (معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية) أثناء العملية. - تمييع PRP بكمية كافية من 0.9٪ كلوريد الصوديوم المعقم إلى تركيز نهائي قدره 0.32 × 10 9 ± 0.03 × 109 PLTs / مل ، والذي يحاكي متوسط تركيز PLT في الدم المحيطي.
- الاستفادة من ارتفاع ثقب لأكياس الدم ، قسم PRP المخفف إلى أكياس تجميع فارغة 300 مل للوصول إلى حجم صاف يبلغ 190 مل / كيس.
- استخدم حصة من PRP المخفف المتبقي (عادة 1 مل) لإجراء ضوابط الجودة لتقييم الملوثات الميكروبية المحتملة. قم بإجراء فحص العقم باتباع تعليمات الشركة المصنعة في مختبر الأحياء الدقيقة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: استخدم قوارير الاستزراع الخاصة بمزارع الدم الهوائية ، والتي تكون قادرة على إجراء الثقافة النوعية واستعادة الكائنات الحية الدقيقة الهوائية (البكتيريا والخميرة بشكل أساسي) من عينات الدم صغيرة الحجم. - قم بتخزين أكياس PRP المخففة عند -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 أشهر قبل الذوبان.
- مباشرة قبل بدء تخفيف PRP ، قم بإجراء عدد PLT باستخدام مقياس الدم باستخدام العينة التي تم جمعها من الكيس الرئيسي من خلال مسمار ثقب.
2. إعداد محللة البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP-L)
- ذوبان الجليد
- قبل البدء في إجراء الإذابة ، تأكد من ضبط الحمام الدافئ على 37 درجة مئوية. ضع أكياس PRP في الحمام الدافئ وانتظر حتى تذوب تماما.
- مجموعة PRP-L
- أجهزة الطرد المركزي أكياس PRP في 3000 × غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في العقم تحت غطاء الخطر البيولوجي من الفئة الثانية. - استغلال السنبلة الخارقة لحقيبة النقل ، قم بتوصيل كيس الطرد المركزي بكيس نقل معقم فارغ سعة 300 مل. بعناية ، انقل طافي PRP-L ، مع تجنب الحطام ، إلى الكيس الجديد. عندما يكون ذلك ممكنا ، استخدم مكبس الأكياس.
- أغلق أنبوب التوصيل لوحدة PRP-L باستخدام كيس مانع السدادة.
- أجهزة الطرد المركزي أكياس PRP في 3000 × غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- PRP-L aliquote
ملاحظة: وحدة البدء التي تحتوي على 190 مل من PRP (انظر الخطوة 1.3.3.) كافية لملء مجموعتين من قطرات العين (للحصول على تفاصيل حول الأجهزة الطبية المحددة المستخدمة لتطبيق وحفظ قطرات العين من مكونات الدم ، انظر جدول المواد). يجب فتح مجموعات قطرات العين تحت غطاء من الفئة الثانية مع وضع قوارير السلسلة بأكملها فوق المحقنة المتصلة مسبقا والسهم المركزي لمحبس يشير إلى اليسار لاستبعاد المرشح المضاد للبكتيريا.- اجمع 30-60 مل من PRP-L باستخدام حقنة معقمة واربط المحقنة بوصلة Luer / lock على خط التعبئة.
- وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، أدر المحبس بمقدار نصف دورة لفتح الخط الفاصل بين المحقنة المحتوية على PRP-L والمحقنة المتصلة مسبقا. املأ المحقنة المتصلة مسبقا ب PRP-L.
- افصل حقنة PRP-L ، وأغلق غطاء الأنبوب الخاص بوصلة luer / lock وقم بتدوير محبس إلى الموضع الأصلي. استخدم حقنة مجموعة قطرات العين لملء القوارير ب PRP-L.
- كرر الإجراء من الخطوات 2.3.1.-2.3.3. حتى يتم ملء جميع قوارير قضيب. تأكد من ملء كل قضيب بشكل صحيح ، ثم أغلقه بشكل فردي باستخدام كيس مانع التسرب.
- كرر الإجراء مع مجموعة قطرات العين الجديدة.
- استخدم حصة صغيرة من PRP-L المخفف المتبقي لتقييم التلوث الميكروبي المحتمل (انظر الخطوة 1.3.4).
ملاحظة: إذا وصل السائل عن طريق الخطأ إلى المرشح المضاد للبكتيريا في نهاية الخيط ، فقد تقاوم حقنة الشفط المقاومة ، مما يعيق الحشوة. لمواصلة دورة التعبئة ، ارفع الجزء النهائي من السلسلة لحوالي 5/6 حصص من المرشح المضاد للبكتيريا الكارهة للماء في نهاية الخيط. في هذا الوضع ، استخدم حقنة معقمة جديدة (بحجم 30 مل) مملوءة بالفعل بالهواء. قم بتوصيل القفل الأنثوي للمرشح المضاد للبكتيريا واضغط بقوة وبشكل متكرر على مكبس المحقنة لإزالة جميع بقايا مكون الدم وجعل غشاء المرشح المضاد للبكتيريا خاليا من السائل. إزالة حقنة وملء قوارير المتبقية.
- تخزين PRP-L
- قم بتسمية كل قضيب بشكل صحيح وضعه في كيس بلاستيكي. قم بتسمية الكيس البلاستيكي أيضا ، مع الحرص على إبراز فصيلة دم المتبرع.
- يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 24 شهرا قبل تعيين المريض ، وفقا للقانون الإيطالي23 والإرشادات24.
3. الاستغناء عن PRP-L
- أداء مهمة المريض ويفضل أن يكون ذلك عن طريق مطابقة فصيلة الدم PRP-L. قم بتوصيل قوارير قضيب PRP-L باستخدام صندوق بارد وتأكد من أن كل قارورة قضيب تحتوي على 1.45 مل من PRP-L ، وهو ما يعادل حوالي 45 نقطة. إرشاد المريض إلى أنه يمكن تخزين قوارير القضيب في منازل المرضى لمدة تصل إلى شهر واحد عند -15 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يكمن الأساس المنطقي لاستخدام قطرات العين المشتقة من المصل (وهو المنتج القائم على الدم الأكثر استخداما لعلاج أمراض سطح العين) في محتواها من GFs ، والتي يتم اشتقاقها بالكامل تقريبا من الصفائح الدموية المتداولة. يحتوي PRP على عدد أكبر بكثير من الصفائح الدموية (وبالتالي ، من GFs المشتقة من الصفائح الدموية) مقارنة بمصل الدم المحيطي ، يتراوح بين 0.15 × 10 9-0.45 × 109 PLTs / مل. وفقا للقوانين الإيطالية ، يجب أن يكون عدد الصفائح الدموية في وحدات PRP على الأقل 0.9 × 10 9-1 × 109 PLTs / مل. لذلك ، للحصول على منتج يحاكي فعالية قطرات العين في الدم ، يجب تخفيف PRP إلى محتوى الصفائح الدموية الفسيولوجية قبل تحضير المحللة.
ومع ذلك ، نظرا لأن إصلاح الأنسجة مدفوع بشكل أساسي ب GFs المشتقة من الصفائح الدموية ، فقد يكون عدد PLT وحده مضللا لعلاج فعال لأمراض سطح العين. في DED ، وهو مرض العين الأكثر شيوعا الذي يتم علاجه باستخدام قطرات العين المشتقة من الدم ، يضعف إنتاج الفيلم المسيل للدموع والتوازن. وبالتالي ، فإن المنتجات القائمة على الصفائح الدموية لعلاج DED يجب أن تحاكي أيضا المحتوى الفسيولوجي للدموع.
لتحديد أنسب PRP-L لعلاج أمراض سطح العين ، الموضحة في الخطوة 1.3.2. من البروتوكول الحالي ، قمنا بشكل مبدئي بتقييم تخفيفات PRP المختلفة ، وفقا لمحتواها من PLTs (بين 0.7 × 10 9 / مل و 0.3 × 109 / مل) ، وبعض GFs التمثيلية من تلك المعروفة بمشاركتها في إصلاح أنسجة العين12،20،21.
تم إجراء عدد الصفائح الدموية باستخدام مقياس الدم ، بينما تم تقييم GFs عن طريق مقايسة كمية البروتين المتعددة. تم إجراء الفحص كما هو موضح سابقا25 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم اختيار GFs الموضحة في هذه المخطوطة للقياس الكمي بعد فحص أولي ل 36 GFs و GFRs التي أجريت على محلول PRP مع مجموعة بروتين شبه كمية. تم إجراء القياس الكمي ل Luminex على 3 من أصل 36 GFs التي تم فحصها: EGF و PDGF (والتي تبين أنها الأكثر وفرة في lysates PRP لدينا) و TGFβ-1،2،3 isoforms (التي يكون المحتوى مهما لها لمعالجة سطح العين21). تم قياس محتوى EGF و PDGF لأنها قد تؤثر على فعالية PRP-L22 ، بينما تم اختيار الأشكال المتساوية TGFβ لدورها المعروف في تنظيم الإشارات المناعية21.
نظرا لأن مصفوفات البروتين هي جزء من دراسة أخرى في المختبر حول توصيف PRP26 المختلفة ، فإن هذه البيانات غير معروضة في هذه المخطوطة.
قمنا بتقييم كمي EGF و PDGF و TGFβ في محللات PRP من مانحين مختلفين (D1 و D2) ، تم تخفيفهما سابقا بين 0.7 × 10 9-0.3 × 10 9 PLTs / مل في0.9٪ كلوريد الصوديوم. يوضح الشكل 2 نتائج التخفيف 0.3 × 109 PLTs / mL ، والتي تبين أنها تشبه إلى حد كبير تركيبة المسيل للدموع.
تم اختيار التخفيف 0.3 × 109 PLTs / mL بناء على بيانات الأدبيات حول تكوين الدموع. تم العثور على قيم EGF منخفضة جدا مقارنة بمتوسط قيمة المسيل للدموع ولكنها لا تزال في نطاق الحالة الطبيعية27. حتى PDGF ، على الرغم من كونه متغيرا للغاية بين المتبرعين ، كان دائما مشابها للتركيز الموجود في الدموع العادية20. أخيرا ، تم العثور على TGFβ-1 ليكون الشكل الأكثر وفرة في PRP-L ، على غرار الدموع21.
بمجرد تحديد تخفيف PLT الأنسب لإعداد الفصادة PRP-L ، بدأت وحدة طب نقل الدم في توزيع هذه المنتجات على المرضى المصابين باضطرابات سطح العين في عام 2015. قام أطباء العيون بشكل روتيني بجمع استبيانات OSDI لمراقبة أعراض DED. يقيم اختبار OSDI مقاييس جودة الحياة ، مثل إدراك تهيج العين وكيف يؤثر على الأداء المرتبط بالرؤية. يتم تقديم الاستبيان ، الذي أنشأته مجموعة أبحاث النتائج في Allergan Inc. في عام 1995 وتم قبوله الآن كأداة صالحة لمراقبة DED ، للمرضى وتحليله كما هو موضح سابقا28,29.
هنا ، نعرض النتائج الإجمالية لاختبارات OSDI لمرضى دائرة التنمية الاقتصادية الذين عولجوا بين يناير 2020 ويناير 2021 (ن = 27). بعد علاج لمدة 6 أشهر باستخدام PRP-L ، انخفضت درجات OSDI من 56 ± 21 إلى 45 ± 21 ، مما يشير إلى تحسن في نوعية حياة المرضى (الشكل 3).
على الرغم من أن هذه البيانات لا تزال في النطاق الشديد ولا تتعلق بالنتائج السريرية للفعالية ، إلا أنها تشير إلى أن مرضى DED يعتبرون PRP-L منتجا مفيدا يخفف من عدم الراحة في العين. يجب إجراء مزيد من التحقيق في هذا الجانب في التجارب السريرية المستقبلية التي تهدف إلى تقييم فعاليته في علاج أمراض سطح العين.
في الجدول 1 ، نبلغ عن مقارنة طريقة الإنتاج الحالية مع طريقة أخرى لإعداد PRP-L الخيفي لقطرات العين30 ولأغراض أخرى22. على حد علمنا ، فإن بروتوكول Zhang30 والبروتوكول الحالي هما الطريقتان الوحيدتان المنشورتان لإنتاج PRP-L لسطح العين. في كليهما ، يتم الحصول على PRP-L من الفصادة. يجب مقارنة الاختلافات بين البروتوكولين ، المتعلقة بشكل أساسي بعدد دورات التجميد والذوبان وخطوات الطرد المركزي ، من أجل تحسين إنتاج PRP-L. ومع ذلك ، لم يثبت أن هذه الاختلافات المنهجية ضارة بالقدرة التجديدية ل PRP-L التي تم اختبارها على الأنسجة الأخرى22.
الشكل 1: الخطوات الرئيسية للبروتوكول لإعداد PRP-L. (أ) مخطط البروتوكول ، من جمع PRP إلى إعداد PRP-L والاستغناء عنه. (ب) صور تمثيلية للخطوات الرئيسية للبروتوكولات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: القياس الكمي ل Luminex لعوامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية لتخفيف 0.3 × 109 / مل من PRP-L. (أ) عامل نمو البشرة (EGF) ؛ (ب) عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) ؛ (ج) تحويل عامل النمو - بيتا إيزوفورم 1 (TGFβ1) ؛ (د) تحويل عامل النمو - بيتا إيزوفورم 2 (TGFβ2)؛ (ه) تحويل عامل النمو - بيتا إيزوفورم 3 (TGFβ3). يتم التعبير عن القيم ك pg / mL ، متوسط ± الانحراف المعياري لثلاثة قياسات مستقلة. D1 و D2 هما متبرعان مختلفان بالصفائح الدموية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إجمالي درجات OSDI لمرضى DED الذين عولجوا ب PRP-L بين يناير 2020 ويناير 2021 في وحدة طب العيون في AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. ن = 27 مريضا. يتم تمثيل النتائج الإجمالية لدرجة OSDI كمتوسط ± خطأ قياسي ، تم حساب قيمة p باستخدام اختبار t مقترن مع برنامج تحليل البيانات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| هذا المقال | PRP-L للعين (دراسة مخبرية )29 | PRP-L لأغراض أخرى21 | |
| مصدر | فصادة PLTs | فصادة PLTs | الفصادة والدم الكامل |
| دورات التجميد والذوبان | 1 (عند -80 درجة مئوية) | 2 (عند -80 درجة مئوية) | 1-3 (عند -20 درجة مئوية و -80 درجة مئوية) |
| درجة حرارة التخزين | عند -80 درجة مئوية | عند -80 درجة مئوية | عند -20 درجة مئوية و -80 درجة مئوية |
| سرعة الطرد المركزي قبل التخزين | 3000 × جم / 30 دقيقة | 3500 × ز / 30 دقيقة | 400-3000 × ز / 6 دقائق -30 دقيقة |
| الترشيح قبل التخزين | لا | نعم | لا/نعم |
الجدول 1: مقارنة بين بروتوكولات تحضير PRP-L الخيفي من المنتجات القائمة على الصفائح الدموية التي تم جمعها عن طريق الفصادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في السنوات الأخيرة ، زاد الاستخدام السريري للمنتجات القائمة على الصفائح الدموية لأمراض سطح العين ، ولكن انتشارها يعوقه الافتقار إلى المتانة العلمية. ويعزى ذلك أساسا إلى عدم التجانس الواسع في مصادر المانحين وبروتوكولات الإعداد، التي غالبا ما لا يتم الكشف عنها بالكامل أو لا تصمم خصيصا للغرض الذي تصرف من أجله. على وجه الخصوص ، لا تزال المعلومات حول المنتجات القائمة على الصفائح الدموية التي تم جمعها عن طريق الفصادة غير متوفرة. لذلك ، كان الهدف من هذا العمل هو وصف المعالجة خطوة بخطوة لمحللات البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP-L) التي تم الحصول عليها عن طريق الفصادة لعلاج DED.
PRP-L هو المصدر الأمثل لإنتاج قطرات العين لأنه يحتوي على GFs أكثر من المنتجات الأخرى القائمة على الدم22 ، وعند مقارنته بالمصل أو PRP ، فإن إنتاجه أو تخزينه غير مكلف وبسيط. للحصول على PRP-L ، تتعرض الصفائح الدموية للتحلل (عادة من خلال دورة تجميد وذوبان واحدة أو أكثر) لتحرير محتواها. تضمن هذه العملية حلا مخصب بالجزيئات النشطة التي تحفز تجديد الأنسجة22,26. تم علاج عدد متزايد من الأمراض باستخدام PRP-L 22 ، لكن مؤشر الاستخدام في طب العيون لا يزال ضعيفا بسبب انخفاض معايير التوحيد في جمع الصفائح الدموية وإنتاج PRP-L 3,22.
يجب تفضيل المنتجات القائمة على الصفائح الدموية الخيفية لأنها أكثر قابلية للتوحيد من المنتجات الذاتية ، سواء من حيث خصائص المتبرع أو طريقة التحضير. قد تؤثر الحالة الصحية للمريض على جودة المنتج6،16،17 ، في حين أن المجموعات الداخلية لجمع الصفائح الدموية الذاتية من الدم الكامل عندما لا تكون خدمات نقل الدم متاحة بشكل مباشر لا تفي بالجودة القياسية المطلوبة في طب نقل الدم31.
على حد علمنا ، لا توجد دراسات سريرية تميز استخدام PRP-L الخيفي في طب العيون 3 ، في حين أن هناك تقارير قليلة بشأن قطرات العين ذاتية المنشأ PRP-L3 ودراسة واحدة فقط باستخدام PRP-L الخيفي التي تم الحصول عليها من دم الحبل السري لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض سطح العين32. على الرغم من أن PRP-L الخيفي مدرج في الإرشادات السريرية24 وتم اقتراح استخدامه3،30 ، لا يزال هناك نقص في الأدلة على فعاليته مقارنة بالعلاجات الأخرى والمنتجات الأخرى القائمة على الدم (مثل المصل). هنا ، يهدف البروتوكول المقدم إلى مساعدة المجتمع العلمي على تطوير طرق إنتاج مشتركة وإلقاء الضوء على الاختلافات المنهجية.
هنا ، وصفنا إنتاج PRP-L بدءا من PRP الخيفي الذي تم جمعه عن طريق الفصادة. يمكن أيضا جمع المنتجات الخيفية القائمة على الصفائح الدموية للحصول على محللات الصفائح الدموية من المعاطف الملتفة (BCs) ، وقد تم الإبلاغ عن كلا المصدرين بالتساوي31. يتم الحصول على BCs من المانحين المجمعة (عادة أربعة أو خمسة) ، وبالتالي تقليل الاختلافات بين الأفراد. على العكس من ذلك ، يزيد التجميع من خطر نقل العوامل المعدية أو البريونات أو تحفيز استجابة خيفية31,33. الفصادة هي إجراء معقد وجراحي ، وأقلية فقط من المتبرعين مؤهلون أو متوافقون معها34. ومع ذلك ، فإن المنتجات القائمة على الصفائح الدموية التي يتم الحصول عليها عن طريق الفصادة خالية من خلايا الدم المتداولة المتبقية الأخرى وتحتوي على كمية أعلى من PLTs35. لهذه الأسباب ، يركز العمل الحالي على تطوير الدراسات السريرية لمقارنة PRP-L من هذين المصدرين المختلفين.
في هذا البروتوكول ، كان التركيز الأولي ل PLTs في وحدات PRP التي تم جمعها عن طريق الفصادة في المتوسط 1 × 109 / مل ، وهو ما يتوافق مع التركيزات المبلغ عنها للمنتجات الأخرى القائمة على الصفائح الدموية22. في هذه الطريقة ، يتم تخفيف PLTs بعد ذلك بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ إلى 0.3 × 109 / مل. تشير بروتوكولات أخرى إلى استخدام البلازما للتخفيف22.
أبلغت دراسات قليلة عن استخدام PRP-L في طب العيون. في هذه الحالات ، تم تحضير قطرات العين الذاتية بتركيزات PLTs تتراوح من 0.5 × 10 9 / mL-1 x 109 / mL36،37،38. كما نوقش سابقا ، فإن علامات التقييس مرغوبة وستساعد أيضا في تحديد التخفيف المناسب. هنا ، على سبيل المثال ، نبلغ عن تركيز بعض GFs المحورية في PRP-L. يؤثر محتوى EGF و PDGF على فعالية PRP-L22 ، بينما تشارك الأشكال المتماثلة TGFβ في تنظيم الإشارات المناعية 21,39 ، ويتم تنظيم تركيزها بدقة. لذلك ، قد يؤثر تركيز TGFβ في قطرات العين القائمة على الصفائح الدموية ليس فقط على الفعالية ولكن أيضا على الآثار الضارة المحتملة39 ؛ وبالتالي ، ينبغي التحقيق بعناية قبل تحديد التخفيف المناسب. ومع ذلك ، فإن التخفيف المحدد - 0.3 × 109 PLTs / mL - كان يعتمد على محتوى GFs في الدموع21,25. قارن Zhang et al. سابقا قطرات العين القائمة على المصل ، الذاتية والخيفية ، والمحللات القائمة على الصفائح الدموية لمحتواها في GFs ولقدرتها على تعزيز تجديد خلايا القرنية في المختبر30. أظهرت الدراسة كيف أن هذه المنتجات لها ميزات قابلة للمقارنة ، مع PRP-L لديها تركيز EGF أعلى ولكن أقل فيبرونيكتين. في بروتوكولهم ، تكررت عملية التجميد / الذوبان مرتين ، وتم تنفيذ أجهزة الطرد المركزي عند 3500 × جم لمدة 30 دقيقة ، وتم تخزين محللات الصفائح الدموية عند -80 درجة مئوية30.
التجميد والذوبان هو في الواقع خطوة حاسمة. تم تطوير معظم البروتوكولات (بما في ذلك هذا البروتوكول) مع تجميد -80 درجة مئوية وذوبان 37 درجة مئوية ، ولكن تم الإبلاغ عن التجميد أيضا عند -24 درجة مئوية ، -196 درجة مئوية ، و -150 درجة مئوية 22,33 حتى عدد دورات التجميد / الذوبان التي يتم إجراؤها متغير ، يتراوح من 1 إلى 522,33. أبلغ عدد محدود من الدراسات أيضا عن صوتنة أو معالجة المذيبات / المنظفات للحصول على محللات الصفائح الدموية22,33. المتغيرات المنهجية الأخرى التي تم الإبلاغ عنها سابقا في إعداد PRP-L تتعلق بخطوة الطرد المركزي - بين 300 × جم و 10000 × جم ، من 2 دقيقة إلى 60 دقيقة - والتخزين طويل الأجل ، والذي ، في معظم الحالات ، عند -80 درجة مئوية ، وإن كان قد تم أيضا تخزين منتجات مماثلة مباشرة عند -20 درجة مئوية22. وينبغي رصد ظروف التخزين، على وجه الخصوص، رصدا دقيقا لأنها قد تؤثر على توافر ونشاط الأطر العالمية المحتوية في المحللات. في هذا السياق غير المتجانس للغاية ، يجب تقييم ضوابط الجودة والدراسات السريرية مع مراعاة إطلاق العوامل الحيوية والاختلافات في التأثير العلاجي على وجه السرعة.
أخيرا ، نوضح هنا كيف تم تقييم هذه الطريقة بشكل كبير بنتيجة إيجابية من التحليل الكلي للمرضى الذين يعانون من مرض جفاف العين الذين يتلقون PRP-L لمدة 6 أشهر (استبيان OSDI3). على الرغم من أنها واعدة ، إلا أن OSDI وحدها ليست كافية لتحديد فعالية PRP-L في علاج DED وأمراض سطح العين الأخرى ، وهناك ما يبرر الدراسات السريرية حول استخدام PRP-L الخيفي. علاوة على ذلك ، يجب مقارنة الاختلافات المحتملة في تكوين المنتج بسبب الخطوات المنهجية البديلة (أي التجميد والذوبان ، والطرد المركزي ، والتخزين) من أجل تحسين الإجراء المنهجي.
في الختام ، لا يزال عدم التجانس العالي لمصادر الدم والبروتوكولات يعيق الترجمة النهائية للمنتجات القائمة على الدم إلى العلاج السريري لأمراض سطح العين. على الرغم من أن PRP-L هو منتج ناشئ مع بعض الميزات المفيدة ، إلا أنه من الضروري إجراء مزيد من الدراسات للتحقق من صحة استخدامه ووضع إرشادات مشتركة. قد تؤدي مشاركة بروتوكول الإعداد وتفصيله إلى توسيع قابلية الاستخدام وإلقاء الضوء على الخطوات الحاسمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا "Casa del Dono di Reggio Emilia" على توفير مركزات الصفائح الدموية المشتقة من المانحين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
