Summary
Thrombozytenlysate stellen ein aufstrebendes Werkzeug für die Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen dar. Hier schlagen wir eine Methode zur Herstellung, Dispensation, Lagerung und Charakterisierung von Thrombozytenlysat vor, das von Thrombozytenspendern gewonnen wurde.
Abstract
Verschiedene Augenoberflächenerkrankungen werden mit Augentropfen aus Blut behandelt. Ihre Verwendung wurde aufgrund ihres Metaboliten- und Wachstumsfaktorgehalts, der die Regeneration der Augenoberfläche fördert, in die klinische Praxis eingeführt. Blutbasierte Augentropfen können aus verschiedenen Quellen (z. B. Vollblut- oder Thrombozytenapheresespende) sowie mit verschiedenen Protokollen (z. B. verschiedene Verdünnungen und Gefrier- / Tauzyklen) hergestellt werden. Diese Variabilität behindert die Standardisierung klinischer Protokolle und damit die Bewertung ihrer klinischen Wirksamkeit. Die Einzelheiten und der Austausch der methodischen Verfahren können zur Festlegung gemeinsamer Leitlinien beitragen. In den letzten Jahren haben sich allogene Produkte als Alternative zu den autologen Behandlungen verbreitet, da sie höhere Wirksamkeitsstandards garantieren. unter ihnen werden die plättchenreichen Plasmalysat (PRP-L) Augentropfen mit einfachen Herstellungsverfahren hergestellt. In der Abteilung für Transfusionsmedizin am AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, wird PRP-L aus einer Thrombozytenapheresespende gewonnen. Dieses Produkt wird zunächst auf 0,3 x 10 9 Thrombozyten/ml (ausgehend von einer durchschnittlichen Konzentration von 1 x 10 9 Thrombozyten/ml) in0,9% NaCl verdünnt. Verdünnte Blutplättchen werden eingefroren/aufgetaut und anschließend zentrifugiert, um Ablagerungen zu beseitigen. Das Endvolumen wird in 1,45 ml Aliquots aufgeteilt und bei −80 °C gelagert. Vor der Abgabe an Patienten werden Augentropfen auf Sterilität getestet. Patienten können Thrombozytenlysate bei −15 °C für bis zu 1 Monat lagern. Die Zusammensetzung des Wachstumsfaktors wird ebenfalls aus zufällig ausgewählten Aliquots bewertet, und die Mittelwerte werden hier angegeben.
Introduction
Aus Blut gewonnene Produkte werden häufig in der Wundversorgung1, in der Kiefer- und Gesichtschirurgie und orthopädischen Chirurgie sowie zur Behandlung verschiedener Augenoberflächenerkrankungen2 wie der Erkrankung des trockenen Auges (DED)3 eingesetzt. Bei DED ist die Tränenfilmhomöostase infolge der abnormalen Funktion verschiedener Faktoren, die an der Tränenproduktion und der Integrität der Augenoberfläche beteiligt sind, beeinträchtigt 4,5.
DED ist durch Heterogenität in Ursachen und Schweregrad 6,7,8 gekennzeichnet und kann eine Folge verschiedener Faktoren wie Alterung, Geschlecht 9, Kontaktlinsen, topische oder systemische Medikamente 10 oder Vorerkrankungen wie das Sjögren-Syndrom10 sein. Trotz leichter Symptome betrifft DED Millionen von Menschen weltweit und beeinträchtigt ihre Lebensqualität und dasGesundheitssystem6.
Viele Behandlungen wurden für diese Pathologie berichtet, aber es gibt immer noch keinen Konsens über die wirksamste Lösung12. Bis heute sind künstliche Tränen die erste Therapielinie, die darauf abzielt, die wässrige Zusammensetzung des Tränenfilms wiederherzustellen, obwohl diese Ersatzstoffe nicht die wichtigsten biologisch aktiven gelösten Stoffe natürlicher Tränen enthalten 6,11. Produkte auf Thrombozytenbasis gelten als gültige Alternative12,13 zu künstlichen Tränen, obwohl ihre klinische Wirksamkeit, Anwendungsempfehlungen und Zubereitungsmethoden noch umstritten sind3.
Blutbasierte Produkte teilen mit Tränen eine ähnliche Zusammensetzung in Bezug auf Metaboliten14, Proteine, Lipide, Vitamine, Ionen, Wachstumsfaktoren (GFs), antioxidative Verbindungen 11 und Osmolarität (300 mOsm / L)11. Durch die synergistische Aktivität ihrer Bestandteile fördern sie die Regeneration des Hornhautepithels, hemmen die Freisetzung entzündlicher Zytokine und erhöhen die Anzahl der Becherzellen und die Expression von Mucinen in der Bindehaut 2,3.
Bisher ist die Heterogenität in ophthalmologischen blutbasierten Produkten in der Literatur dokumentiert; Diese Produkte können nach der Herkunft der Blutspender, d.h. autolog oder allogen, sowie nach der Blutquelle, d.h. peripherem Blut, Nabelschnurblut, Serum oder Blutplättchen, klassifiziert werden.
Obwohl autologe Produkte am weitesten verbreitet waren3, werden allogene Produkte jetzt zur bevorzugten Wahl, da sie höhere Wirksamkeits- und Sicherheitsstandards15 zusammen mit einer erheblichen Kostensenkung gewährleisten16,17. Frühere Studien haben in der Tat gezeigt, dass blutbasierte Produkte, die von Patienten mit Autoimmun- und/oder systemischen Erkrankungen gewonnen wurden, eine veränderte Qualität und Funktionalität aufweisen können 6,16,17. Trotz der Tatsache, dass Serum-basierte Augentropfen am weitesten verbreitet sind, werden Produkte auf Thrombozytenbasis in letzter Zeit als gültige Alternative bestätigt, da sie leicht hergestellt werden können, während sie ein signifikantesWirksamkeitsniveau beibehalten 3,11. Derzeit verfügbare plättchenbasierte Produkte können in plättchenreiches Plasma (PRP), plättchenreiches Plasmalysat (PRP-L) und wachstumsfaktorreiches Plasma (PRGF)3 unterteilt werden.
Unter ihnen hat PRP-L den Vorteil, ein langlebiges Tiefkühlprodukt zu sein. PRP-L kann aus Apherese, Buffy-Coats oder sogar aus auslaufenden Blutplättchen (PLTs)18,19 hergestellt werden, wodurch deren Verschwendung erheblich reduziert wird. Die Aliquots können monatelang in den Bluttransfusionszentren bei −80 °C oder sogar bei Patienten zu Hause bei −15 °C für kürzere Zeiträume gelagert werden.
PRP-L sind stark angereichert in GFs, die nachweislich die Regeneration der Augenoberfläche stimulieren 12,20,21. Dennoch gibt es nur wenige berichtete klinische Studien in diesem Bereich, und alle verwendeten autologe Quellen 3,22. PRP-L muss noch weiter validiert und charakterisiert werden, bevor es routinemäßig zur Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen eingesetzt werden kann, da es keine standardisierten Richtlinien für seine Herstellung, Abgabe und Lagerung gibt3.
Hierin wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von PRP-L in der Abteilung für Transfusionsmedizin in AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, und die Abgabe an Patienten mit DED veröffentlicht. Unser Ziel ist es, die wissenschaftliche Gemeinschaft bei der Entwicklung von Standardpräparationsmethoden zu unterstützen, die die Homogenität und Konsistenz in weltweiten Studien und klinischen Ansätzen erhöhen können.
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Protocol
PRP-L, das für die quantitative Bewertung von Wachstumsfaktoren verwendet wird, wurde im Rahmen einer breiteren Studie zur Charakterisierung von PRP-Produkten für regenerative Zwecke gesammelt, die am AUSL-IRCCS di Reggio Emilia durchgeführt und am 10. Januar 2019 vom Ethikausschuss Area Vasta Emilia Nord genehmigt wurde (Protokollnummer 2019/0003319). Die Geber gaben ihre informierte Zustimmung gemäß der Deklaration von Helsinki. Für die Erfassung der aggregierten, anonymen Daten des OSDI-Fragebogens (Ocular Surface Disease Index), der routinemäßig von Klinikern zur Überwachung der Symptome des Syndroms des trockenen Auges verwendet wird, war keine ethische Genehmigung erforderlich. Abbildung 1A zeigt einen Überblick über das befolgte Protokoll, während die Bilder in Abbildung 1B die wichtigsten Schritte des Verfahrens darstellen.
1. Sammlung von plättchenreichem Plasma (PRP)
- PRP-Apherese
- Wählen Sie für dieses Protokoll Thrombozytenspender nach italienischem Recht aus: Thrombozytenspender müssen 18-65 Jahre alt sein, normale Druck- und Blutbildparameter und eine Thrombozytenzahl von mindestens 180 x 109 Blutplättchen / L23 aufweisen. Geeignete Spender können innerhalb von 1 Woche vor der Spende keine Thrombozytenaggregationshemmer oder gerinnungshemmende Medikamente einnehmen.
- Führen Sie eine Plasma-Thrombozyten-Apherese mit einem automatisierten Blutentnahmesystem gemäß den Anweisungen des Herstellers und den nationalen Gesetzen23 durch, um 1 Einheit plättchenreiches Plasma (PRP) mit einem einzigen Donor zu erhalten. Sammeln Sie PRP in Adenincitrat-Dextroselösung Eine (ACD-A) gerinnungshemmende Lösung.
HINWEIS: Die Thrombozytenapherese wird mit einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt; Die Zeit der Abholung liegt in einem Bereich zwischen 40 min und 90 min. Die Menge der ACD, die an die Spender abgegeben wird, und die Zeit der Eingriffe hängen von den Spendereigenschaften ab, z. B. Hämatokrit und Nadelstärke.
- Eigenschaften von PRP-Einheiten
HINWEIS: Der folgende Schritt wird normalerweise automatisch vom automatisierten Blutentnahmesystem während des Plasma-Thrombozyten-Apherese-Verfahrens durchgeführt. Bitte beachten Sie die Bedienungsanleitung des Herstellers.- Die durch Apherese gewonnenen PRP-Einheiten werden in einer ausreichenden Menge Konservierungslösung mit der minimalen Menge an Restplasma, die erforderlich ist, um den pH-Wert > 6,4 während der gesamten Lagerzeit aufrechtzuerhalten, auf ein mittleres Endvolumen von 180 ml netto der gerinnungshemmenden Lösung (etwa 40 ml) resuspendiert.
HINWEIS: Nach italienischem Recht müssen Qualitätskontrollen feststellen, dass die Anzahl der Thrombozyten (PLTs) mindestens 2,0 x 10 11 PLTs/Einheit beträgt, während Restleukozyten weniger als 1 x10 6 Zellen/Einheit betragen müssen. - Leukodiertes und bestrahltes PRP vor der weiteren Behandlung maximal 5 Tage bei 22 °C ± 2 °C auf einem Thrombozytenschüttler lagern23.
- Die durch Apherese gewonnenen PRP-Einheiten werden in einer ausreichenden Menge Konservierungslösung mit der minimalen Menge an Restplasma, die erforderlich ist, um den pH-Wert > 6,4 während der gesamten Lagerzeit aufrechtzuerhalten, auf ein mittleres Endvolumen von 180 ml netto der gerinnungshemmenden Lösung (etwa 40 ml) resuspendiert.
- PRP-Verdünnung
- Führen Sie unmittelbar vor Beginn der PRP-Verdünnung eine PLT-Zählung mit einem Hämozytometer durch, wobei die Probe aus dem Hauptbeutel durch einen Piercing-Spike entnommen wird.
HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte zur Sterilität unter einer Biohazard-Haube der Klasse II durch. Tragen Sie während des Eingriffs persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). - PRP wird mit einer ausreichenden Menge steriler 0,9% NaCl auf eine Endkonzentration von 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 109 PLTs/ml verdünnt, was die durchschnittliche PLT-Konzentration im peripheren Blut simuliert.
- Unter Ausnutzung eines Piercing-Spikes für Blutbeutel teilen Sie das verdünnte PRP in 300 ml leere Sammelbeutel auf, um ein Nettovolumen von 190 ml / Beutel zu erreichen.
- Verwenden Sie ein Aliquot von verdünntem Rest-PRP (normalerweise 1 ml), um Qualitätskontrollen durchzuführen, um mögliche mikrobielle Kontaminationen zu bewerten. Führen Sie einen Sterilitätstest gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem mikrobiologischen Labor durch (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Verwenden Sie Kulturfläschchen, die speziell für aerobe Blutkulturen geeignet sind, die in der Lage sind, die qualitative Kultur und Erholung von aeroben Mikroorganismen (hauptsächlich Bakterien und Hefe) aus kleinvolumigen Blutproben durchzuführen. - Verdünnte PRP-Beutel vor dem Auftauen maximal 2 Monate bei −80 °C lagern.
- Führen Sie unmittelbar vor Beginn der PRP-Verdünnung eine PLT-Zählung mit einem Hämozytometer durch, wobei die Probe aus dem Hauptbeutel durch einen Piercing-Spike entnommen wird.
2. Plättchenreiche Plasmalysat-Zubereitung (PRP-L)
- Auftauen
- Stellen Sie vor Beginn des Auftauvorgangs sicher, dass ein warmes Bad auf 37 °C eingestellt ist. Legen Sie die PRP-Beutel in das warme Bad und warten Sie, bis sie vollständig aufgetaut sind.
- Kollektion PRP-L
- Zentrifugieren Sie die PRP-Beutel bei 3000 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Die nächsten Schritte sollten in Sterilität unter einer Biohazard-Haube der Klasse II durchgeführt werden. - Verbinden Sie den zentrifugierten Beutel unter Ausnutzung des Piercing-Spikes des Transferbeutels mit einem leeren sterilen 300-ml-Transferbeutel. Übertragen Sie den PRP-L-Überstand vorsichtig unter Vermeidung von Ablagerungen in den neuen Beutel. Wenn möglich, verwenden Sie eine Beutelpresse.
- Verschließen Sie das Anschlussrohr der PRP-L-Einheit mit einer Beutelversiegelung.
- Zentrifugieren Sie die PRP-Beutel bei 3000 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
- PRP-L Alizitat
HINWEIS: Eine Starteinheit mit 190 ml PRP (siehe Schritt 1.3.3.) reicht aus, um zwei Augentropfen-Kits zu füllen (Einzelheiten zu den spezifischen Medizinprodukten, die für die Anwendung und Konservierung von Augentropfen aus Blutbestandteilen verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle). Augentropfen-Kits sollten unter einer Haube der Klasse II geöffnet werden, wobei die gesamten Durchstechflaschen über der vorangeschlossenen Spritze positioniert sind und der zentrale Pfeil des Absperrhahns nach links zeigt, um den antibakteriellen Filter auszuschließen.- Sammeln Sie 30-60 ml PRP-L mit einer sterilen Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem Luer/Lock-Anschluss an der Abfülllinie.
- Drehen Sie den Absperrhahn gemäß den Anweisungen des Herstellers um eine halbe Umdrehung, um die Leitung zwischen der PRP-L-haltigen Spritze und der vorangeschlossenen Spritze zu öffnen. Füllen Sie die vorangeschlossene Spritze mit PRP-L.
- Trennen Sie die PRP-L-Spritze, schließen Sie die Schlauchkappe der Luer/Lock-Verbindung und drehen Sie den Absperrhahn in die ursprüngliche Position. Verwenden Sie die Augentropfen-Kit-Spritze, um die Durchstechflaschen mit PRP-L zu füllen.
- Wiederholen Sie den Vorgang aus den Schritten 2.3.1.-2.3.3. bis alle Applikatorfläschchen gefüllt sind. Stellen Sie sicher, dass jeder Applikator ordnungsgemäß gefüllt ist, und verschließen Sie ihn dann einzeln mit einem Beutelverschließer.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Augentropfen-Kit.
- Verwenden Sie ein kleines Aliquot des verbleibenden verdünnten PRP-L, um eine mögliche mikrobielle Kontamination zu beurteilen (siehe Schritt 1.3.4.).
HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit versehentlich den antibakteriellen Filter am Ende der Schnur erreicht, kann die Saugspritze dem Widerstand entgegenwirken und die Füllung behindern. Um den Füllzyklus fortzusetzen, heben Sie den Endabschnitt der Schnur für etwa 5/6 Aliquots aus dem antibakteriellen hydrophoben Filter am Ende der Schnur an. Verwenden Sie in dieser Position eine neue sterile Spritze (von 30 ml Volumen), die bereits mit Luft gefüllt wurde. Schließen Sie den weiblichen Luer/Lock des antibakteriellen Filters an und drücken Sie hart und wiederholt auf den Kolben der Spritze, um alle Rückstände von Blutbestandteilen zu entfernen und die Membran des antibakteriellen Filters von der Flüssigkeit frei zu machen. Entfernen Sie die Spritze und füllen Sie die restlichen Durchstechflaschen.
- PRP-L Lagerung
- Beschriften Sie jeden Applikator richtig und legen Sie ihn in einen Plastikbeutel. Beschriften Sie auch die Plastiktüte und achten Sie darauf, die Blutgruppe des Spenders hervorzuheben.
- Lagerung bei −80 °C für maximal 24 Monate vor der Patientenzuweisung gemäß dem italienischen Gesetz23 und den Richtlinien24.
3. PRP-L Dispensation
- Führen Sie die Patientenzuordnung vorzugsweise durch Abgleich der PRP-L-Blutgruppe durch. Geben Sie PRP-L-Applikatorfläschchen in einer Kühlbox ab und stellen Sie sicher, dass jede Applikatordurchstechflasche 1,45 ml PRP-L enthält, was etwa 45 Tropfen entspricht. Weisen Sie den Patienten an, dass Applikatorfläschchen bis zu 1 Monat bei den Patienten zu Hause bei −15 °C gelagert werden können.
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Representative Results
Der Grund für die Verwendung von Serum-basierten Augentropfen (das am häufigsten zur Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen verwendete blutbasierte Produkt) liegt in ihrem Gehalt an GFs, die fast vollständig aus zirkulierenden Blutplättchen gewonnen werden. PRP enthält eine signifikant höhere Anzahl von Blutplättchen (und folglich von aus Blutplättchen gewonnenen GFs) im Vergleich zu peripherem Blutserum, zwischen 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/ml. Nach italienischem Recht sollte die Thrombozytenzahl in PRP-Einheiten mindestens 0,9 x 10 9-1 x 109 PLTs/ml betragen. Um ein Produkt zu erhalten, das die Wirksamkeit von Serumaugentropfen simuliert, sollte PRP daher vor der Lysatherstellung auf den physiologischen Thrombozytengehalt verdünnt werden.
Da die Gewebereparatur jedoch hauptsächlich durch aus Blutplättchen gewonnene GFs gesteuert wird, könnte die PLT-Anzahl allein für eine wirksame Therapie von Augenoberflächenerkrankungen irreführend sein. Bei DED, der Augenerkrankung, die am häufigsten mit Augentropfen aus Blut behandelt wird, sind die Tränenfilmproduktion und die Homöostase beeinträchtigt. Thrombozytenbasierte Produkte zur Behandlung von DED sollten daher auch den physiologischen Gehalt von Tränen nachahmen.
Identifizierung des am besten geeigneten PRP-L zur Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen, beschrieben in Schritt 1.3.2. des vorliegenden Protokolls bewerteten wir vorläufig verschiedene PRP-Verdünnungen entsprechend ihrem PLT-Gehalt (zwischen 0,7 x 10 9/ml und 0,3 x 109/ml) und einige repräsentative GFs von denen, von denen bekannt ist, dass sie an der Augengewebereparatur beteiligt sind12,20,21.
Die Thrombozytenzahl wurde mit einem Hämozytometer durchgeführt, während GFs mittels eines Multiplex-Proteinquantifizierungstests bewertet wurden. Der Assay wurde wie zuvor beschrieben25 gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die in diesem Manuskript gezeigten GFs wurden nach einem vorläufigen Screening von 36 GFs und GFRs, die an PRP-Lysat mit einem semiquantitativen Proteinarray durchgeführt wurden, zur Quantifizierung ausgewählt. Die Luminex-Quantifizierung wurde an 3 der 36 gescreenten GFs durchgeführt: EGF und PDGF (die sich als die häufigsten in unseren PRP-Lysaten herausstellten) und TGFβ-1,2,3-Isoformen (für die der Gehalt für die Augenoberflächenbehandlung wichtig ist21). Der EGF- und PDGF-Gehalt wurde gemessen, da sie die Wirksamkeit von PRP-L22 beeinflussen können, während TGFβ-Isoformen aufgrund ihrer bekannten Rolle bei der Regulierung der Immunsignalübertragung ausgewählt wurden21.
Da Proteinarrays Teil einer weiteren In-vitro-Studie zur Charakterisierung verschiedener PRP26 sind, werden diese Daten in diesem Manuskript nicht präsentiert.
Wir bewerteten EGF, PDGF und TGFβ quantitativ in PRP-Lysaten von zwei verschiedenen Donatoren (D1 und D2), zuvor verdünnt zwischen 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLTs/ml in0,9% NaCl. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der 0,3 x 109 PLTs/ml Verdünnung, die sich als der Tränenzusammensetzung am ähnlichsten erwies.
Die Verdünnung von 0,3 x 109 PLTs/ml wurde auf der Grundlage von Literaturdaten zur Tränenzusammensetzung ausgewählt. Die EGF-Werte waren im Vergleich zum mittleren Reißwert recht niedrig, aber immer noch im Bereich der Normalität27. Selbst PDGF war, obwohl sie zwischen den beiden betrachteten Spendern sehr unterschiedlich war, immer vergleichbar mit der Konzentration, die in normalen Tränen gefunden wurde20. Schließlich wurde festgestellt, dass TGFβ-1 die häufigste Isoform in PRP-L ist, ähnlich wie Tränen21.
Nachdem die am besten geeignete PLT-Verdünnung zur Herstellung von Apherese PRP-L identifiziert worden war, begann die Abteilung für Transfusionsmedizin 2015 mit der Verteilung dieser Produkte an Patienten, die von Augenoberflächenerkrankungen betroffen sind. Die Augenärzte sammelten routinemäßig die OSDI-Fragebögen, um DED-Symptome zu überwachen; Der OSDI-Test bewertet Maßnahmen zur Lebensqualität wie die Wahrnehmung von Augenreizungen und deren Auswirkungen auf die Funktion im Zusammenhang mit dem Sehvermögen. Der Fragebogen, der 1995 von der Outcomes Research Group bei Allergan Inc. erstellt wurde und nun als gültiges Instrument zur Überwachung von DED akzeptiert wird, wird den Patienten vorgelegt und wie zuvor beschrieben analysiert28,29.
Hier zeigen wir die aggregierten Ergebnisse von OSDI-Tests von DED-Patienten, die zwischen Januar 2020 und Januar 2021 behandelt wurden (n = 27). Nach einer 6-monatigen Therapie mit PRP-L sanken die OSDI-Werte von 56 ± 21 auf 45 ± 21, was auf eine Verbesserung der Lebensqualität der Patienten hinweist (Abbildung 3).
Obwohl diese Daten immer noch im schweren Bereich liegen und sich nicht auf klinische Ergebnisse der Wirksamkeit beziehen, deuten sie darauf hin, dass DED-Patienten PRP-L als ein nützliches Produkt betrachten, das Augenbeschwerden lindert; Dieser Aspekt sollte in prospektiven klinischen Studien weiter untersucht werden, um seine Wirksamkeit bei der Behandlung von Erkrankungen der Augenoberfläche zu bewerten.
In Tabelle 1 berichten wir über einen Vergleich des derzeitigen Herstellungsverfahrens mit einem anderen Verfahren zur Herstellung von allogenem PRP-L für Augentropfen30 und für andere Zwecke22. Unseres Wissens sind Zhangs30-Protokoll und das aktuelle Protokoll die einzigen veröffentlichten Methoden, um PRP-L für die Augenoberfläche zu erzeugen. In beiden wird PRP-L aus Apherese gewonnen; Die Unterschiede zwischen den beiden Protokollen, die sich hauptsächlich auf die Anzahl der Gefrier- und Auftauzyklen und die Zentrifugationsschritte beziehen, sollten verglichen werden, um die PRP-L-Produktion zu verbessern. Dennoch haben sich diese methodischen Unterschiede nicht als nachteilig für die Regenerationsfähigkeit von PRP-L erwiesen, das an anderen Geweben getestet wurde22.
Abbildung 1: Hauptschritte des Protokolls zur Herstellung von PRP-L. (A) Schema des Protokolls, von der PRP-Sammlung bis zur PRP-L-Vorbereitung und Dispensation. (B) Repräsentative Bilder der wichtigsten Schritte der Protokolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Luminex-Quantifizierung von Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktoren für die 0,3 x 109/ml Verdünnung von PRP-L. (A) Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); (B) Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF); (C) transformierende Wachstumsfaktor-beta-Isoform 1 (TGFβ1); (D) transformierende Wachstumsfaktor-beta-Isoform 2 (TGFβ2); (E) transformierende Wachstumsfaktor-beta-Isoform 3 (TGFβ3). Die Werte werden als pg/ml ausgedrückt, Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen. D1 und D2 sind zwei verschiedene Thrombozytenspender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aggregierte OSDI-Scores von DED-Patienten, die zwischen Januar 2020 und Januar 2021 in der Ophthalmology Unit des AUSL-IRCCS di Reggio Emilia mit PRP-L behandelt wurden. N = 27 Patienten. OSDI-Score-Aggregatergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt, der p-Wert wurde mit einem gepaarten t-Test mit Datenanalysesoftware berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Dieser Artikel | PRP-L für das Auge (In-vitro-Studie )29 | PRP-L für andere Zwecke21 | |
| Quelle | PLTs Apherese | PLTs Apherese | Apherese und Vollblut |
| Gefrier- und Auftauzyklen | 1 (bei -80 °C) | 2 (bei -80 °C) | 1-3 (bei -20 °C und -80 °C) |
| Lagertemperatur | bei -80 °C | bei -80 °C | bei -20 °C und -80 °C |
| Zentrifugationsgeschwindigkeit vor der Lagerung | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtration vor der Lagerung | Nein | Ja | Nein/Ja |
Tabelle 1: Vergleich der Protokolle zur Herstellung von allogenem PRP-L aus plättchenbasierten Produkten, die durch Apherese gewonnen wurden.
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Discussion
In den letzten Jahren hat die klinische Verwendung von plättchenbasierten Produkten für Augenoberflächenpathologien zugenommen, aber ihre Diffusion wird durch den Mangel an wissenschaftlicher Robustheit behindert. Dies ist vor allem auf die große Heterogenität der Spenderquellen und Präparationsprotokolle zurückzuführen, die oft nicht vollständig offengelegt oder nicht speziell für den Zweck, für den sie abgegeben werden, ausgelegt sind. Insbesondere fehlen noch Informationen über plättchenbasierte Produkte, die durch Apherese gesammelt wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die schrittweise Verarbeitung von plättchenreichen Plasmalysaten (PRP-L), die durch Apherese zur Behandlung von DED gewonnen werden, zu beschreiben.
PRP-L ist eine optimale Quelle für die Herstellung von Augentropfen, da es mehr GFs enthält als die anderen blutbasierten Produkte22, und im Vergleich zu Serum oder PRP ist seine Herstellung oder Lagerung kostengünstig und einfach. Um PRP-L zu erhalten, werden Blutplättchen einer Lyse unterzogen (normalerweise durch einen oder mehrere Gefrier- und Auftauzyklen), um ihren Inhalt freizusetzen. Dieser Prozess garantiert eine Lösung, die mit aktiven Molekülen angereichert ist, die die Geweberegeneration stimulieren22,26. Immer mehr Erkrankungen wurden mit PRP-L 22 behandelt, aber die Indikation für den Einsatz in der Augenheilkunde ist aufgrund der niedrigen Standardisierungskriterien in der Thrombozytenentnahme und PRP-L-Produktion noch schwach 3,22.
Allogene Produkte auf Thrombozytenbasis sollten bevorzugt werden, da sie sowohl in Bezug auf die Spendereigenschaften als auch auf die Zubereitungsmethode standardisierbarer sind als autologe. Der Gesundheitszustand des Patienten kann die Qualität des Erzeugnisses 6,16,17 beeinflussen, während die internen Kits zur Entnahme autologer Blutplättchen aus Vollblut, wenn Transfusionsdienste nicht direkt verfügbar sind, nicht der in der Transfusionsmedizin geforderten Standardqualität entsprechen31.
Unseres Wissens gibt es keine klinischen Studien, die die Verwendung von allogenem PRP-L in der Ophthalmologiecharakterisieren 3, während es nur wenige Berichte über autologe PRP-L-Augentropfen3 und nur eine Studie mit allogenem PRP-L aus Nabelschnurblut zur Behandlung von Patienten mit Augenoberflächenerkrankungen gibt32. Obwohl allogenes PRP-L in den klinischen Leitlinien24 aufgeführt ist und seineVerwendung 3,30 vorgeschlagen wurde, fehlt es immer noch an Evidenz für seine Wirksamkeit im Vergleich zu anderen Behandlungen und anderen blutbasierten Produkten (z. B. Serum). Hier soll das vorgestellte Protokoll der wissenschaftlichen Gemeinschaft helfen, gemeinsame Produktionsmethoden zu entwickeln und die methodischen Unterschiede zu beleuchten.
Hier beschrieben wir die PRP-L-Produktion ausgehend von allogenem PRP, das durch Apherese gesammelt wird. Thrombozytenbasierte allogene Produkte zur Gewinnung von Thrombozytenlysaten können auch aus Buffy-Coats (BCs) gewonnen werden, und beide Quellen wurden gleichermaßen berichtet31. BCs werden von gepoolten Spendern (in der Regel vier oder fünf) erhalten, wodurch die interindividuellen Unterschiede minimiert werden. Umgekehrt erhöht das Pooling das Risiko, Infektionserreger oder Prionen zu übertragen oder eine allogene Reaktion zu stimulieren31,33. Apherese ist ein komplexes und invasives Verfahren, und nur eine Minderheit der Spender ist dafür in Frage oder konform34. Dennoch sind plättchenbasierte Produkte, die durch Apherese gewonnen werden, frei von anderen verbleibenden zirkulierenden Blutzellen und enthalten eine höhere Menge anPLTs 35. Aus diesen Gründen konzentriert sich die aktuelle Arbeit auf die Entwicklung klinischer Studien zum Vergleich von PRP-L aus diesen beiden verschiedenen Quellen.
In diesem Protokoll betrug die Anfangskonzentration von PLTs in PRP-Einheiten, die durch Apherese gesammelt wurden, durchschnittlich 1 x 109/ml, was mit den berichteten Konzentrationen für andere plättchenbasierte Produkte übereinstimmt22. Bei dieser Methode werden PLTs anschließend mit 0,9% NaCl-Lösung auf 0,3 x 109/ml verdünnt. Andere Protokolle berichten über die Verwendung von Plasma für die Verdünnung22.
Nur wenige Studien haben über die Verwendung von PRP-L in der Augenheilkunde berichtet; in diesen Fällen wurden autologe Augentropfen in Konzentrationen von PLTs im Bereich von 0,5 x 10 9/ml-1 x 109/ml36,37,38 hergestellt. Wie bereits erwähnt, sind Standardisierungsmarker wünschenswert und würden auch bei der Bestimmung der richtigen Verdünnung helfen. Hier berichten wir zum Beispiel über die Konzentration einiger zentraler GFs im PRP-L. Der EGF- und PDGF-Gehalt beeinflusst die Wirksamkeit von PRP-L22, während TGFβ-Isoformen an der Regulierung der Immunsignalisierungbeteiligt sind 21,39 und ihre Konzentration fein reguliert wird. Daher kann die TGFβ-Konzentration in plättchenbasierten Augentropfen nicht nur die Wirksamkeit beeinflussen, sondern auch potenziell schädliche Wirkungen hervorrufen39; Daher sollte es sorgfältig untersucht werden, bevor die richtige Verdünnung definiert wird. Nichtsdestotrotz basierte die gewählte Verdünnung - 0,3 x 109 PLTs/ml - auf dem Gehalt an GFs in Tränen21,25. Zhang et al. verglichen zuvor serumbasierte Augentropfen, sowohl autolog als auch allogen, und plättchenbasierte Lysate hinsichtlich ihres Gehalts an GFs und ihrer Fähigkeit, die Regeneration von Hornhautzellen in vitro zu fördern30. Die Studie zeigte, dass diese Produkte vergleichbare Eigenschaften aufweisen, wobei PRP-L eine höhere EGF-Konzentration, aber ein niedrigeres Fibronektin aufweist. In ihrem Protokoll wurde der Gefrier-/Auftauvorgang zweimal wiederholt, die Zentrifuge bei 3500 x g für 30 min durchgeführt und das Thrombozytenlysat bei −80 °C30 gelagert.
Einfrieren und Auftauen ist in der Tat ein kritischer Schritt; Die meisten Protokolle (einschließlich diesem) wurden mit −80 °C Gefrieren und 37 °C Auftauen entwickelt, aber das Einfrieren wurde auch bei −24 °C, −196 °C und −150 °C berichtet 22,33 Sogar die Anzahl der durchgeführten Gefrier-/Tauzyklen ist variabel und reicht von 1 bis 522,33. Eine begrenzte Anzahl von Studien berichtete auch über eine Ultraschallbehandlung oder Lösungsmittel-/Reinigungsmittelbehandlung, um Thrombozytenlysate22,33 zu erhalten. Andere methodische Variablen, die zuvor bei der Herstellung von PRP-L berichtet wurden, betreffen den Zentrifugationsschritt - zwischen 300 x g und 10000 x g von 2 min bis 60 min - und die Langzeitlagerung, die in den meisten Fällen bei −80 °C liegt, obwohl ähnliche Produkte auch direkt bei −20 °C gelagert wurden22. Insbesondere die Lagerbedingungen sollten sorgfältig überwacht werden, da sie die Verfügbarkeit und Aktivität der in Lysaten enthaltenen GF beeinträchtigen können. In diesem sehr heterogenen Kontext sollten dringend Qualitätskontrollen und klinische Studien unter Berücksichtigung der Freisetzung biogener Faktoren und der Unterschiede in der therapeutischen Wirkung evaluiert werden.
Schließlich zeigen wir hier, wie diese Methode signifikant mit einem positiven Ergebnis aus einer aggregierten Analyse von Patienten mit trockenem Auge bewertet wurde, die PRP-L für 6 Monate erhielten (OSDI-Fragebogen3). Obwohl vielversprechend, reicht OSDI allein nicht aus, um die Wirksamkeit von PRP-L bei der Behandlung von DED und anderen Augenoberflächenerkrankungen zu bestimmen, und klinische Studien zur Verwendung von allogenem PRP-L sind gerechtfertigt. Darüber hinaus sollten mögliche Unterschiede in der Produktzusammensetzung aufgrund alternativer methodischer Schritte (z.B. Einfrieren und Auftauen, Zentrifugieren, Lagern) verglichen werden, um das methodische Vorgehen zu optimieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hohe Heterogenität der Blutquellen und -protokolle immer noch die endgültige Translation von blutbasierten Produkten in die klinische Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen behindert. Obwohl PRP-L ein neues Produkt mit einigen vorteilhaften Eigenschaften ist, sind weitere Studien erforderlich, um seine Verwendung zu validieren und gemeinsame Leitlinien zu entwickeln. Das Teilen und Detaillieren des Vorbereitungsprotokolls kann die Benutzerfreundlichkeit erweitern und die kritischen Schritte beleuchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken der "Casa del Dono di Reggio Emilia" für die Bereitstellung von Thrombozytenkonzentraten aus Spendern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
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