Summary
혈소판 용해물은 안구 표면 질환 치료를위한 새로운 도구를 나타냅니다. 여기에서는 혈소판 공여자로부터 수집 한 혈소판 용해물의 준비, 분배, 저장 및 특성화 방법을 제안합니다.
Abstract
다양한 안구 표면 질환은 혈액 유래 점안액으로 치료됩니다. 그들의 사용은 눈 표면 재생을 촉진하는 대사 산물 및 성장 인자 함량 때문에 임상 실습에 도입되었습니다. 혈액 기반 점안액은 다양한 출처(예: 전혈 또는 혈소판 성분채혈 기증)와 다양한 프로토콜(예: 다양한 희석 및 동결/해동 주기)로 준비할 수 있습니다. 이러한 가변성은 임상 프로토콜의 표준화를 방해하고 결과적으로 임상 효능의 평가를 방해합니다. 방법론적 절차를 자세히 설명하고 공유하면 공통 지침을 정의하는 데 기여할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 동종 제제는 더 높은 효능 표준을 보장하기 때문에자가 치료의 대안으로 확산되었습니다. 그 중 혈소판이 풍부한 혈장 용해물 (PRP-L) 점안액은 간단한 제조 절차로 준비됩니다. 이탈리아 AUSL-IRCCS di Reggio Emilia의 수혈 의학 부서에서 PRP-L은 혈소판 성분채집 기증으로 얻습니다. 이 제품은 처음에 0.9 % NaCl에서 0.3 x 10 9 혈소판 / mL (1 x 109 혈소판 / mL의 평균 농도에서 시작)로 희석됩니다. 희석 된 혈소판은 냉동 / 해동 된 후 원심 분리되어 파편을 제거합니다. 최종 부피는 1.45mL 분취량으로 분할되고 -80°C에서 저장됩니다. 환자에게 분배되기 전에 안약을 불임 상태로 테스트합니다. 환자는 혈소판 용해물을 -15 ° C에서 최대 1 개월 동안 저장할 수 있습니다. 성장 인자 조성은 또한 무작위로 선택된 부분 표본으로부터 평가되며, 평균값은 여기에보고된다.
Introduction
혈액 유래 제품은 상처 치료1, 악안면 및 정형외과 수술, 안구건조증(DED)3과 같은 다양한 안구 표면 질환2의 치료에 널리 사용됩니다. DED에서 눈물 막 항상성은 눈물 생성 및 안구 표면 무결성 4,5와 관련된 여러 요인의 비정상적인 기능의 결과로 손상됩니다.
DED는 원인과 중증도6,7,8의 이질성을 특징으로 하며 노화, 성관계9, 콘택트렌즈, 국소 또는 전신 약물10 또는 쇼그렌 증후군10과 같은 기존 상태와 같은 다양한 요인의 결과일 수 있습니다. 경미한 증상에도 불구하고 DED는 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치며 삶의 질과 의료 시스템에도 영향을 미칩니다6.
이 병리에 대한 많은 치료법이보고되었지만 가장 효과적인 해결책12에 대한 합의는 아직 없습니다. 현재까지 인공 눈물은 눈물 막의 수성 조성물을 복원하기위한 치료의 첫 번째 라인이지만, 이들 대체물은 자연 눈물의 주요 생물학적 활성 용질을 포함하지 않습니다 6,11. 혈소판 기반 제품은 인공 눈물에 대한 유효한 대안12,13으로 간주되지만 임상 효능, 사용 권장 사항 및 준비 방법은 여전히 논쟁의 여지가 있습니다3.
혈액 기반 제품은 대사 산물14, 단백질, 지질, 비타민, 이온, 성장 인자 (GF), 항산화 화합물11 및 삼투압 (300 mOsm / L) 11 측면에서 유사한 구성을 눈물과 공유합니다. 성분의 시너지 활성을 통해 각막 상피의 재생을 촉진하고 염증성 사이토 카인의 방출을 억제하며 결막 2,3에서 잔 세포의 수와 뮤신의 발현을 증가시킵니다.
지금까지 안과 용 혈액 기반 제품의 이질성은 문헌에 문서화되었습니다. 이러한 제품은 헌혈자의 기원, 즉자가 또는 동종 혈액뿐만 아니라 혈액 공급원, 즉 말초 혈액, 제대혈, 혈청 또는 혈소판에 따라 분류 할 수 있습니다.
자가 제품이 가장 널리 보급되었지만3, 동종 제품은 더 높은 효능 및 안전성 표준15을 보장하고 비용16,17을 크게 절감하기 때문에 이제 선호되는 선택이 되고 있습니다. 실제로 이전 연구에서는 자가면역 및/또는 전신 질환 환자로부터 얻은 혈액 기반 제품이품질과 기능이 변경될 수 있음을 입증했습니다6,16,17. 혈청 기반 점안액이 가장 널리 퍼져 있음에도 불구하고 혈소판 기반 제품은 상당한 수준의 효능을 유지하면서 쉽게 준비 할 수 있기 때문에 최근 유효한 대안으로 확인되고 있습니다 3,11. 현재 사용 가능한 혈소판 기반 제품은 혈소판 풍부 혈장 (PRP), 혈소판 풍부 혈장 용해물 (PRP-L) 및 성장 인자 풍부 혈장 (PRGF)으로 나눌 수 있습니다 3.
그 중 PRP-L은 수명이 긴 냉동 제품이라는 장점이 있습니다. PRP-L은 성분채집, 버피 코트 또는 만료되는 혈소판(PLT)18,19에서 제조할 수 있어 낭비를 소중하게 줄일 수 있습니다. 분취량은 -80 ° C의 수혈 센터에서 수개월 동안 또는 -15 ° C의 환자 집에서도 더 짧은 기간 동안 보관할 수 있습니다.
PRP-L은 눈 표면 재생을 자극하는 것으로 입증 된 GF가 매우 풍부합니다 12,20,21. 그럼에도 불구하고이 분야에 대해보고 된 임상 연구는 거의 없으며 모두자가 출처 3,22를 사용했습니다. PRP-L은 준비, 분배및 보관에 대한 표준화된 지침이 없기 때문에 눈 표면 질환 치료에 일상적으로 사용하기 전에 추가 검증 및 특성 분석이 여전히 필요합니다3.
여기에서는 이탈리아 AUSL-IRCCS 디 레지오 에밀리아의 수혈 의학 부서에서 사용되는 PRP-L의 생산 및 DED 환자에 대한 분배에 대한 자세한 프로토콜이 공유됩니다. 우리는 과학계가 전 세계 연구 및 임상 접근법에서 동질성과 일관성을 높일 수있는 표준 준비 방법을 개발하도록 돕는 것을 목표로합니다.
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Protocol
성장 인자의 정량적 평가에 사용되는 PRP-L은 AUSL-IRCCS di Reggio Emilia에서 수행되고 2019 년 1 월 10 일 Area Vasta Emilia Nord 윤리위원회의 승인 (프로토콜 번호 2019/0003319)에서 승인 된 재생 목적을위한 PRP 제품의 특성화에 대한 광범위한 연구에서 수집되었습니다. 기부자들은 헬싱키 선언에 따라 정보에 입각한 동의를 했습니다. 임상의가 안구 건조증 증상을 모니터링하기 위해 일상적으로 사용하는 안구 표면 질환 지수(OSDI) 설문지의 집계된 익명 데이터를 수집하는 데 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 그림 1A 는 따르는 프로토콜의 개요를 보여 주며 그림 1B 의 그림은 절차의 주요 단계를 보여줍니다.
1. 혈소판 풍부 혈장(PRP) 수집
- PRP 성분채집
- 이 프로토콜의 경우 이탈리아 법률에 따라 혈소판 기증자를 선택하십시오 : 혈소판 기증자는 18-65 세이어야하며 정상 압력 및 혈구 수 매개 변수와 혈소판 수가 180 x 109 혈소판 / L23 이상이어야합니다. 적격 기증자는 기증 전 1주일 이내에 항혈소판제 또는 항응고제를 복용할 수 없습니다.
- 제조업체의 지침 및 국내법23에 따라 자동 혈액 수집 시스템을 사용하여 혈장-혈소판-성분채집을 수행하여 단일 기증자 혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 1단위를 얻습니다. 아데닌 구연산염 덱 스트로스 용액 A (ACD-A) 항응고제 용액에서 PRP를 수집하십시오.
알림: 혈소판 성분채집은 지속적인 절차로 수행됩니다. 수집 시간은 40 분에서 90 분 사이입니다. 기증자에게 전달되는 ACD의 양과 시술 시간은 기증자의 특성(예: 헤마토크릿 및 바늘 게이지)에 따라 다릅니다.
- PRP 단위의 특성
알림: 다음 단계는 일반적으로 혈장-혈소판-성분채집 절차 중에 자동 혈액 수집 시스템에 의해 자동으로 수행됩니다. 제조업체의 사용 설명서를 확인하십시오.- 성분채집을 통해 수집한 PRP 단위를 전체 보관 시간 동안 pH를 6.4> 유지하는 데 필요한 최소량의 잔류 혈장이 포함된 적절한 양의 방부제 용액에 재현탁하여 항응고제 용액의 평균 최종 부피 180mL(약 40mL)가 되도록 재현탁합니다.
참고: 이탈리아 법에 따라 품질 관리는 혈소판(PLT) 수가 최소 2.0 x 10 11 PLT/단위인 반면 잔류 백혈구는 1 x10 6 세포/단위 미만이어야 함을 평가해야 합니다. - 류코코딩되고 조사된 PRP를 추가 조작 전에 22°C ± 2°C에서 최대 5일 동안 혈소판 쉐이커에 보관한다23.
- 성분채집을 통해 수집한 PRP 단위를 전체 보관 시간 동안 pH를 6.4> 유지하는 데 필요한 최소량의 잔류 혈장이 포함된 적절한 양의 방부제 용액에 재현탁하여 항응고제 용액의 평균 최종 부피 180mL(약 40mL)가 되도록 재현탁합니다.
- PRP 희석
- PRP 희석을 시작하기 직전에 피어싱 스파이크를 통해 메인 백에서 수집 한 샘플을 사용하여 혈구계로 PLT 계수를 수행하십시오.
알림: 클래스 II 생물학적 위험 후드 아래에서 멸균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 절차 중에 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 고글)를 착용하십시오. - 적절한 양의 멸균 0.9% NaCl로 PRP를 0.32 x 10 9 ± 0.03 x 109 PLT/mL의 최종 농도로 희석하여 말초 혈액의 평균 PLT 농도를 시뮬레이션합니다.
- 혈액 백의 피어싱 스파이크를 활용하여 희석된 PRP를 300mL의 빈 수집 백으로 분할하여 190mL/백의 순 부피에 도달합니다.
- 잔류 희석 PRP(일반적으로 1mL)의 분취량을 사용하여 가능한 미생물 오염을 평가하는 품질 관리를 수행합니다. 미생물학 실험실에서 제조업체의 지침에 따라 멸균 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
참고: 소량의 혈액 검체에서 호기성 미생물(주로 박테리아 및 효모)의 정성적 배양 및 회수를 수행할 수 있는 호기성 혈액 배양 전용 배양 바이알을 사용하십시오. - 희석된 PRP 백은 해동하기 전에 최대 80개월 동안 -2°C에서 보관하십시오.
- PRP 희석을 시작하기 직전에 피어싱 스파이크를 통해 메인 백에서 수집 한 샘플을 사용하여 혈구계로 PLT 계수를 수행하십시오.
2. 혈소판이 풍부한 혈장 용해물(PRP-L) 제제
- 녹고
- 해동 절차를 시작하기 전에 따뜻한 수조가 37 ° C로 설정되어 있는지 확인하십시오. PRP 백을 따뜻한 욕조에 넣고 완전히 해동 될 때까지 기다리십시오.
- PRP-L 컬렉션
- PRP 백을 3000 x g 에서 실온에서 30분 동안 원심분리합니다.
알림: 다음 단계는 클래스 II 생물학적 위험 후드 아래에서 무균 상태로 수행해야 합니다. - 이송 백의 피어싱 스파이크를 이용하여 원심분리된 백을 빈 멸균 300mL 이송 백과 연결합니다. 조심스럽게 PRP-L 상청액을 파편을 피하면서 새 백으로 옮깁니다. 가능하면 백 프레스를 사용하십시오.
- PRP-L 장치의 연결 튜브를 백 실러로 밀봉합니다.
- PRP 백을 3000 x g 에서 실온에서 30분 동안 원심분리합니다.
- PRP-L 부분 견적
알림: 190mL PRP가 포함된 시작 장치(1.3.3단계 참조)는 두 개의 점안액 키트를 채우기에 충분합니다(혈액 성분에서 점안액을 적용하고 보존하는 데 사용되는 특정 의료 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). 점안액 키트는 전체 스트링 바이알이 사전 연결된 주사기 위에 있고 스톱콕의 중앙 화살표가 항균 필터를 제외하도록 왼쪽을 가리키도록 클래스 II 후드 아래에서 열어야 합니다.- 멸균 주사기로 30-60mL의 PRP-L을 수집하고 주사기를 충전 라인의 루어/잠금 연결부에 연결합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 스톱 콕을 반 바퀴 돌려 PRP-L 함유 주사기와 사전 연결된 주사기 사이의 선을 엽니 다. 사전 연결된 주사기에 PRP-L을 채 웁니다.
- PRP-L 주사기를 분리하고 루어/잠금 연결부의 튜브 캡을 닫은 다음 스톱콕을 원래 위치로 돌립니다. 점안액 키트 주사기를 사용하여 바이알에 PRP-L을 채웁니다.
- 2.3.1.-2.3.3단계의 절차를 반복합니다. 모든 애플리케이터 바이알이 채워질 때까지. 각 애플리케이터가 제대로 채워졌는지 확인한 다음 백 실러로 개별적으로 밀봉하십시오.
- 새 점안액 키트로 절차를 반복하십시오.
- 잔류 희석 PRP-L의 작은 부분 표본을 사용하여 가능한 미생물 오염을 평가하십시오 (1.3.4 단계 참조).
알림: 액체가 실수로 끈 끝에 있는 항균 필터에 도달하면 흡입 주사기가 저항에 반대하여 충전을 방해할 수 있습니다. 충전 주기를 계속하려면 끈 끝에 있는 항균 소수성 필터에서 약 5/6 분취량 동안 끈의 끝 부분을 올립니다. 이 위치에서 이미 공기가 채워진 새 멸균 주사기 (30mL 용량)를 사용하십시오. 항균 필터의 암 루어/잠금 장치를 연결하고 주사기의 플런저를 세게 반복적으로 눌러 혈액 성분의 모든 잔류물을 제거하고 항균 필터의 멤브레인에 액체가 없도록 합니다. 주사기를 제거하고 나머지 바이알을 채 웁니다.
- PRP-L 스토리지
- 각 애플리케이터에 라벨을 붙이고 비닐 봉지에 넣으십시오. 비닐 봉지에도 라벨을 붙이고 기증자의 혈액형을 강조하십시오.
- 이탈리아 법률23 및 지침 24 에 따라 환자 배정 전 최대24개월 동안 -80°C에서 보관하십시오.
3. PRP-L 분배
- 바람직하게는 PRP-L 혈액형을 일치시켜 환자 할당을 수행한다. 쿨 박스를 사용하여 PRP-L 어플리케이터 바이알을 전달하고 각 애플리케이터 바이알에 약 45방울에 해당하는 1.45mL의 PRP-L이 들어 있는지 확인합니다. 환자에게 애플리케이터 바이알을 -15 ° C에서 최대 1 개월 동안 환자의 집에 보관할 수 있음을 지시하십시오.
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Representative Results
혈청 유래 점안액 (눈 표면 질환 치료에 가장 자주 사용되는 혈액 기반 제품)의 사용에 대한 근거는 순환 혈소판에서 거의 완전히 파생 된 GF의 함량에 있습니다. PRP는 말초 혈청에 비해 0.15 x 10 9-0.45 x 109 PLT / mL 범위의 훨씬 더 많은 수의 혈소판 (결과적으로 혈소판 유래 GF)을 포함합니다. 이탈리아 법률에 따르면 PRP 단위의 혈소판 수는 0.9 x 10 9-1 x 109 PLT / mL 이상이어야합니다. 따라서 혈청 점안액의 효능을 모사하는 제품을 얻으려면 용해물 준비 전에 PRP를 생리적 혈소판 함량으로 희석해야합니다.
그럼에도 불구하고 조직 복구는 주로 혈소판 유래 GF에 의해 구동되기 때문에 PLT 카운트만으로는 눈 표면 질환의 효과적인 치료에 오해의 소지가 있습니다. 혈액 유래 점안액으로 가장 일반적으로 치료되는 안과 질환인 DED에서는 눈물막 생성과 항상성이 손상됩니다. 따라서 DED 치료를위한 혈소판 기반 제품은 눈물의 생리 학적 함량을 모방해야합니다.
눈 표면 질환을 치료하기에 가장 적합한 PRP-L을 확인하기 위해, 단계 1.3.2에 기술하였다. 본 프로토콜의 PLT 함량 (0.7 x 10 9 / mL 및 0.3 x 109 / mL 사이)과 눈 조직 복구12,20,21에 관여하는 것으로 알려진 일부 대표적인 GF에 따라 다양한 PRP 희석을 예비 평가했습니다.
혈소판 수는 혈구계로 수행하고, GF는 다중 단백질 정량화 분석을 통해 평가하였다. 분석은 제조자의 지시에 따라 앞서 도25 와 같이 수행하였다. 이 원고에 표시된 GF는 반정량 단백질 어레이를 사용하여 PRP 용해물에 대해 수행된 36개의 GF 및 GFR의 예비 스크리닝 후 정량화를 위해 선택되었습니다. 루미넥스 정량화는 36개의 스크리닝된 GF 중 3개에 대해 수행되었습니다: EGF 및 PDGF(당사의 PRP 용해물에서 가장 풍부한 것으로 판명됨) 및 TGFβ-1,2,3 이소폼(이 함량은 눈 표면 처리에 중요합니다21). EGF 및 PDGF 함량은 PRP-L22의 효능에 영향을 미칠 수 있으므로 측정되었으며, TGFβ 이소형은 면역 신호 전달21에서 공지된 역할에 대해 선택되었습니다.
단백질 어레이는 상이한 PRP26의 특성화에 대한 또 다른 시험관내 연구의 일부이기 때문에, 이들 데이터는 이 원고에 제시되지 않는다.
이전에 0.9% NaCl에서 0.7 x 10 9-0.3 x 109 PLT/mL 사이에 희석된 두 개의 다른 공여자(D1 및 D2)의 PRP 용해물에서 EGF, PDGF 및 TGFβ를 정량적으로 평가했습니다. 그림 2는 0.3 x 109 PLT / mL 희석 결과를 보여 주며, 이는 눈물 조성과 가장 유사한 것으로 나타났습니다.
0.3 x 109 PLTs/mL 희석액은 눈물 조성에 대한 문헌 데이터를 기반으로 선택되었습니다. EGF 값은 평균 인열 값에 비해 상당히 낮지 만 여전히 정규성27의 범위에있는 것으로 나타났습니다. PDGF조차도 고려 된 두 기증자 사이에서 매우 가변적 임에도 불구하고 항상 정상 눈물20에서 발견되는 농도와 비슷했습니다. 마지막으로, TGFβ-1은 눈물21과 유사하게 PRP-L에서 가장 풍부한 이소 형인 것으로 밝혀졌다.
성분채집 PRP-L을 준비하기에 가장 적합한 PLT 희석액이 확인되자 수혈 의학 부서는 2015년에 눈 표면 장애의 영향을 받는 환자에게 이러한 제품을 배포하기 시작했습니다. 안과 의사는 DED 증상을 모니터링하기 위해 정기적으로 OSDI 설문지를 수집했습니다. OSDI 검사는 안구 자극에 대한 인식 및 시력과 관련된 기능에 미치는 영향과 같은 삶의 질 측정을 평가합니다. 1995 년 Allergan Inc.의 결과 연구 그룹에 의해 작성되었으며 현재 DED를 모니터링하기위한 유효한 도구로 받아 들여지는 설문지는 환자에게 제출되고 이전에 설명 된대로 분석됩니다28,29.
여기에서는 2020 년 1 월과 2021 년 1 월 사이에 치료받은 DED 환자의 OSDI 검사 집계 결과를 보여줍니다 (n = 27). PRP-L로 6개월 동안 치료한 후 OSDI 점수는 56± 21에서 45± 21로 감소하여 환자의 삶의 질이 향상되었음을 나타냅니다(그림 3).
이러한 데이터가 여전히 심각한 범위에 있고 효능의 임상 결과와 관련이 없음에도 불구하고 DED 환자는 PRP-L을 안구 불편을 개선하는 유용한 제품으로 간주한다고 제안합니다. 이 측면은 안구 표면 질환 치료에 대한 효능을 평가하기위한 전향 적 임상 시험에서 추가로 조사되어야한다.
표 1에서, 본 생산 방법과 점안액30 및 다른 목적(22)을 위한 동종 PRP-L을 제조하는 다른 방법의 비교를 보고한다. 우리가 아는 한, Zhang의30 프로토콜과 현재 프로토콜은 눈 표면에 PRP-L을 생성하는 유일한 공개 방법입니다. 둘 다에서 PRP-L은 성분채집으로부터 얻어진다; PRP-L 생산을 개선하기 위해 주로 동결 및 해동 주기 및 원심분리 단계의 수와 관련된 두 프로토콜 간의 차이점을 비교해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법론적 차이는 다른 조직22에서 시험된 PRP-L의 재생 능력에 해로운 것으로 입증되지 않았다.
그림 1: PRP-L 준비를 위한 프로토콜의 주요 단계. (A) PRP 수집에서 PRP-L 준비 및 분배에 이르기까지 프로토콜의 계획. (B) 의정서의 주요 단계에 대한 대표 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PRP-L의 0.3 x 109/mL 희석에 대한 혈소판 유래 성장 인자의 루미넥스 정량화. (A) 표피 성장 인자 (EGF); (b) 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); (c) 형질전환 성장 인자-베타 이소형 1 (TGFβ1); (d) 형질전환 성장 인자-베타 이소형 2 (TGFβ2); (e) 형질전환 성장 인자-베타 이소형 3 (TGFβ3). 값은 pg/mL, 평균 ± 세 개의 독립적인 측정의 표준 편차로 표시됩니다. D1 및 D2는 2개의 상이한 혈소판 공여체이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 2020년 1월부터 2021년 1월까지 AUSL-IRCCS 디 레지오 에밀리아의 안과 병동에서 PRP-L로 치료받은 DED 환자의 OSDI 점수 집계 . N = 27 명의 환자. OSDI 점수 집계 결과는 평균 ± 표준 오차로 표시되며, p-값은 데이터 분석 소프트웨어를 사용한 쌍 t-검정으로 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이 문서 | 눈용 PRP-L(체외 연구)29 | 기타 목적을위한 PRP-L21 | |
| 근원 | PLTs 성분채집 | PLTs 성분채집 | 성분채집과 전혈 |
| 동결 및 해동 주기 | 1 (-80 °C에서) | 2 (-80 °C에서) | 1-3 (-20 °C 및 -80 °C에서) |
| 보관 온도 | -80 °C에서 | -80 °C에서 | -20 °C 및 -80 °C에서 |
| 보관 전 원심분리 속도 | 3000 x g/30분 | 3500 x g/30분 | 400-3000 x g / 6 분 -30 분 |
| 보관 전 여과 | 아니요 | 예 | 아니요/예 |
표 1 : 채집에 의해 수집 된 혈소판 기반 제품으로부터 동종 PRP-L을 준비하기위한 프로토콜의 비교.
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Discussion
최근 몇 년 동안 안구 표면 병리에 대한 혈소판 기반 제품의 임상 적 사용이 증가했지만 과학적 견고성이 부족하여 확산이 방해 받고 있습니다. 이것은 주로 기증자 출처 및 준비 프로토콜의 광범위한 이질성으로 인해 발생하며, 이는 종종 완전히 공개되지 않았거나 분배 목적에 맞게 특별히 설계되지 않았습니다. 특히, 성분채집에 의해 수집된 혈소판 기반 제품에 대한 정보는 여전히 부족합니다. 따라서, 본 연구의 목적은 DED 치료를 위해 성분채집에 의해 얻어진 혈소판이 풍부한 혈장 용해물(PRP-L)의 단계별 처리를 기술하는 것이었다.
PRP-L은 다른 혈액 기반 제품(22)보다 더 많은 GF를 함유하기 때문에 점안액 생산을 위한 최적의 공급원이며, 혈청 또는 PRP와 비교할 때 그의 생산 또는 저장은 저렴하고 간단하다. PRP-L을 얻기 위해 혈소판은 용해 (일반적으로 하나 이상의 동결 및 해동주기를 통해)를 거쳐 내용물을 방출합니다. 이 과정은 조직 재생을 자극하는 활성 분자가 풍부한 용액을 보장합니다22, 26. 점점 더 많은 질병이 PRP-L 22로 치료되었지만 혈소판 수집 및 PRP-L 생산 3,22의 표준화 기준이 낮기 때문에 안과에서의 사용에 대한 적응증은 여전히 약합니다.
동종 혈소판 기반 제품은 기증자 특성과 준비 방법 모두에서 자가 혈소판보다 표준화 가능하기 때문에 선호되어야 합니다. 환자의 건강 상태는 제품(6,16,17)의 품질에 영향을 미칠 수 있는 반면, 수혈 서비스가 직접 이용가능하지 않을 때 전혈로부터 자가 혈소판을 수집하는 사내 키트는 수혈 의학(31)에서 요구되는 표준 품질을 충족하지 못한다.
우리가 아는 한,안과에서 동종 PRP-L의 사용을 특징으로하는 임상 연구는 없지만3, 자가 PRP-L 점안액3에 대한보고는 거의 없으며 눈 표면 질환 환자를 치료하기 위해 제대혈에서 얻은 동종 PRP-L을 사용한 연구는 1 건에 불과합니다32. 동종 PRP-L은 임상 지침24에 나열되어 있고 그 사용법은 3,30으로 제안되었지만 다른 치료법 및 다른 혈액 기반 제품(예: 혈청)에 비해 효능에 대한 증거가 여전히 부족합니다. 여기에서 제시된 프로토콜은 과학계가 일반적인 생산 방법을 개발하고 방법 론적 차이를 밝히는 것을 목표로합니다.
여기에서는 성분채집에 의해 수집된 동종 PRP로부터 시작하는 PRP-L 생산에 대해 설명했습니다. 혈소판 용해물을 얻기 위한 혈소판계 동종 생성물은 또한 버피코트(BC)로부터 수집될 수 있으며, 두 공급원 모두 동일하게 보고되었다(31). BC는 공동 기증자 (보통 4 명 또는 5 명)로부터 얻어 지므로 개인 간 차이를 최소화합니다. 반대로, 풀링은 감염원 또는 프리온을 전염시키거나 동종 반응을 자극할 위험을 증가시킵니다31,33. 성분채집은 복잡하고 침습적인 절차이며, 소수의 기증자만이 이를 받을 자격이 있거나 준수합니다34. 그럼에도 불구하고, 성분채집에 의해 수득된 혈소판계 생성물은 다른 잔류 순환 혈액 세포로부터 자유롭고, 더 많은 양의 PLTs(35)를 함유한다. 이러한 이유로 현재 연구는이 두 가지 다른 출처의 PRP-L을 비교하기위한 임상 연구 개발에 중점을두고 있습니다.
이 프로토콜에서, 성분채집에 의해 수집된 PRP 단위에서 PLT의 시작 농도는 평균 1 x 109/mL였으며, 이는 다른 혈소판 기반 생성물에 대해 보고된 농도와 일치한다22. 이 방법에서 PLT는 나중에 0.9% NaCl 용액으로 0.3 x 109/mL로 희석됩니다. 다른 프로토콜은 희석을 위한 혈장의 사용을 보고한다(22).
안과에서 PRP-L의 사용을보고 한 연구는 거의 없습니다. 이러한 경우, 자가 점안액을 0.5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38 범위의 PLT 농도로 제조하였다. 앞서 논의한 바와 같이, 표준화 마커는 바람직하며 적절한 희석을 결정하는 데에도 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 여기에서는 PRP-L에서 일부 중추적 GF의 농도를보고합니다. EGF 및 PDGF 함량은 PRP-L22의 효능에 영향을 미치는 반면, TGFβ 이소 폼은 면역 신호 전달21,39 조절에 관여하며 그 농도는 미세하게 조절됩니다. 따라서 혈소판 기반 점안액의 TGFβ 농도는 효능에 영향을 미칠뿐만 아니라 잠재적 인 해로운 영향을 유발할 수 있습니다39; 따라서 적절한 희석을 정의하기 전에 신중하게 조사해야합니다. 그럼에도 불구하고, 선택된 희석액 (0.3 x 109 PLTs / mL)은 눈물21,25의 GF 함량을 기준으로했다. Zhang et al.은 이전에 자가 및 동종 및 혈소판 기반 점안액의 GF 함량과 시험관 내30에서 각막 세포의 재생을 촉진하는 능력에 대해 혈청 기반 점안액을 비교했습니다. 이 연구는 PRP-L이 EGF 농도는 높지만 피브로넥틴은 더 낮은 PRP-L과 함께 이러한 제품이 어떻게 유사한 기능을 가지고 있는지 보여주었습니다. 그들의 프로토콜에서, 동결 / 해동 과정을 두 번 반복하고, 원심 분리기를 3500 x g에서 30 분 동안 수행하고, 혈소판 용해물을 -80 ° C에서30 저장했다.
냉동 및 해동은 실제로 중요한 단계입니다. 대부분의 프로토콜 (이 프로토콜 포함)은 -80 ° C 동결 및 37 ° C 해동으로 개발되었지만 동결은 -24 ° C, -196 ° C 및 -150 ° C에서도보고되었습니다 22,33 수행 된 동결 / 해동 사이클의 횟수조차도 1에서 5까지 가변적입니다22,33. 제한된 수의 연구에서도 혈소판 용해물22,33을 얻기 위해 초음파 처리 또는 용매/세제 처리를 보고했습니다. PRP-L의 제조에서 이전에 보고된 다른 방법론적 변수는 원심분리 단계(300 x g 및 10000 x g 사이, 2분 내지 60분)와 대부분의 경우 -80°C에 있는 장기 보관에 관한 것이지만, 유사한 생성물도 -20°C에서 직접 저장되었다22. 특히 저장 조건은 용해물에 포함된 GF의 가용성과 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 이러한 매우 이질적인 맥락에서, 생체 인자의 방출과 치료 효과의 차이를 고려한 품질 관리 및 임상 연구가 시급히 평가되어야한다.
마지막으로, 여기에서는 6 개월 동안 PRP-L을받은 안구 건조증 환자의 집계 분석 (OSDI 설문지3)에서이 방법이 어떻게 유의미하게 평가되었는지 보여줍니다. 유망하지만 OSDI만으로는 DED 및 기타 안구 표면 질환 치료에서 PRP-L의 효능을 결정하기에 충분하지 않으며 동종 PRP-L 사용에 대한 임상 연구가 필요합니다. 또한, 대안적인 방법론적 단계(즉, 동결 및 해동, 원심분리, 보관)로 인해 발생할 수 있는 제품 조성 차이를 방법론적 절차를 최적화하기 위해 비교해야 한다.
결론적으로, 혈액 공급원과 프로토콜의 높은 이질성은 여전히 혈액 기반 제품을 안구 표면 질환의 임상 치료에 대한 최종 번역을 방해합니다. PRP-L은 몇 가지 유리한 기능을 가진 신흥 제품이지만 사용을 검증하고 공통 지침을 개발하려면 추가 연구가 필요합니다. 준비 프로토콜을 공유하고 자세히 설명하면 유용성이 확장되고 중요한 단계를 밝힐 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 기증자 유래 혈소판 농축액을 제공 한 "Casa del Dono di Reggio Emilia"에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
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