Summary
Blodplatelysater representerer et fremvoksende verktøy for behandling av okulære overflatesykdommer. Her foreslår vi en metode for fremstilling, dispensasjon, lagring og karakterisering av blodplatelysat samlet fra blodplatedonorer.
Abstract
Ulike okulære overflatesykdommer behandles med blodavledede øyedråper. Deres bruk har blitt introdusert i klinisk praksis på grunn av deres metabolitt og vekstfaktorinnhold, noe som fremmer øyeoverflateregenerering. Blodbaserte øyedråper kan fremstilles fra forskjellige kilder (dvs. donasjon av fullblod eller blodplateaferese), samt med forskjellige protokoller (f.eks. forskjellige fortynninger og fryse / tine sykluser). Denne variasjonen hemmer standardiseringen av kliniske protokoller og dermed evalueringen av deres kliniske effekt. Utdyping og deling av de metodiske prosedyrene kan bidra til å definere felles retningslinjer. I løpet av de siste årene har allogene produkter spredt seg som et alternativ til de autologe behandlingene siden de garanterer høyere effektstandarder; blant dem fremstilles de blodplaterike plasmalysatene (PRP-L) med enkle produksjonsprosedyrer. I transfusjonsmedisinsk enhet ved AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, oppnås PRP-L ved blodplate-aferesedonasjon. Dette produktet fortynnes initialt til 0,3 x 10 9 blodplater/ml (med utgangspunkt i en gjennomsnittlig konsentrasjon på 1 x 10 9 blodplater/ml) i0,9 % NaCl. Fortynnede blodplater fryses/tines og deretter sentrifugeres for å eliminere rusk. Det endelige volumet deles i 1,45 ml aliquots og lagres ved -80 °C. Før de blir dispensert til pasienter, testes øyedråper for sterilitet. Pasienter kan oppbevare blodplatelysater ved −15 °C i opptil 1 måned. Sammensetningen av vekstfaktoren vurderes også ut fra tilfeldig utvalgte aliquoter, og gjennomsnittsverdiene rapporteres her.
Introduction
Blodavledede produkter er mye brukt i sårpleie1, maxillofacial og ortopedisk kirurgi, og for behandling av forskjellige okulære overflatesykdommer2 som tørr øyesykdom (DED)3. I DED svekkes tårfilmhomeostase som følge av unormal funksjon av ulike faktorer involvert i tåreproduksjon og okulær overflateintegritet 4,5.
DED er preget av heterogenitet i årsaker og alvorlighetsgrad 6,7,8 og kan være en konsekvens av ulike faktorer som aldring, kjønn9, kontaktlinser, aktuelle eller systemiske medisiner 10, eller eksisterende forhold som Sjøgrens syndrom 10. Til tross for å ha milde symptomer, påvirker DED millioner av mennesker over hele verden, noe som påvirker livskvaliteten og helsesystemet også6.
Mange behandlinger er rapportert for denne patologien, men det er fortsatt ingen konsensus om den mest effektive løsningen12. Til dags dato er kunstige tårer den første behandlingslinjen som tar sikte på å gjenopprette den vandige sammensetningen av tårfilmen, selv om disse erstatningene ikke inneholder de viktigste biologisk aktive oppløsningene av naturlige tårer 6,11. Blodplatebaserte produkter anses som et gyldig alternativ12,13 til kunstige tårer, selv om deres kliniske effekt, anbefalinger for bruk og preparatmetoder fortsatt er gjenstand for debatt3.
Blodbaserte produkter deler med tårer en lignende sammensetning når det gjelder metabolitter14, proteiner, lipider, vitaminer, ioner, vekstfaktorer (GF), antioksidantforbindelser 11 og osmolaritet (300 mOsm / L)11. Gjennom den synergistiske aktiviteten til komponentene fremmer de regenerering av hornhinneepitelet, hemmer frigivelsen av inflammatoriske cytokiner og øker antall begerceller og uttrykket av muciner i bindehinden 2,3.
Så langt har heterogenitet i oftalmiske blodbaserte produkter blitt dokumentert i litteraturen; Disse produktene kan klassifiseres i henhold til blodgivernes opprinnelse, dvs. autolog eller allogen, samt blodkilden, dvs. perifert blod, ledningsblod, serum eller blodplater.
Selv om autologe produkter var de mest utbredte3, blir allogene nå det foretrukne valget, siden de sikrer høyere effekt- og sikkerhetsstandarder 15, sammen med en betydelig reduksjon i kostnadene16,17. Tidligere studier viste faktisk at blodbaserte produkter hentet fra pasienter med autoimmune og / eller systemiske sykdommer kan vise endret kvalitet og funksjonalitet 6,16,17. Til tross for at serumbaserte øyedråper er de mest utbredte, er blodplatebaserte produkter nylig blitt bekreftet som et gyldig alternativ, da de lett kan tilberedes samtidig som de opprettholder betydelige nivåer av effekt 3,11. Dagens tilgjengelige blodplatebaserte produkter kan deles inn i blodplaterikt plasma (PRP), blodplaterikt plasmalysat (PRP-L) og plasma rikt på vekstfaktorer (PRGF)3.
Blant dem har PRP-L fordelen av å være et frosset produkt med lang levetid. PRP-L kan fremstilles fra aferese, buffy-strøk, eller til og med fra utløpende blodplater (PLT)18,19, noe som reduserer svinnet verdifullt. Aliquotene kan lagres i flere måneder i blodtransfusjonssentrene ved -80 ° C eller til og med hjemme hos pasienter ved -15 ° C i kortere perioder.
PRP-L er svært beriket i GFs, som har vist seg å stimulere øyeoverflateregenerering 12,20,21. Likevel er det bare få rapporterte kliniske studier på dette området, og alle brukte autologe kilder 3,22. PRP-L trenger fortsatt ytterligere validering og karakterisering før den rutinemessig kan brukes til behandling av øyeoverflatesykdommer, siden det ikke finnes standardiserte retningslinjer for forberedelse, dispensasjon og lagring3.
Her deles en detaljert protokoll for produksjon av PRP-L som brukes ved Transfusjonsmedisinsk enhet i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, og dispensasjon til pasienter med DED. Vi tar sikte på å hjelpe det vitenskapelige samfunn til å utvikle standardmetoder for fremstilling, noe som kan øke homogenitet og konsistens i verdensomspennende studier og kliniske tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRP-L brukt til kvantitativ vurdering av vekstfaktorer ble samlet inn i en bredere studie om karakterisering av PRP-produkter for regenerative formål, utført ved AUSL-IRCCS di Reggio Emilia og godkjent av Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee 10. januar 2019 (protokollnummer 2019/0003319). Giverne ga sitt informerte samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen. Ingen etisk godkjenning var nødvendig for å samle inn aggregerte, anonyme data fra OSDI-spørreskjemaet (Ocular Surface Disease Index), som rutinemessig brukes av klinikere til å overvåke symptomer på tørrøysyndrom. Figur 1A viser en oversikt over protokollen som følges, mens bildene i figur 1B viser hovedtrinnene i prosedyren.
1. Blodplaterikt plasma (PRP) samling
- PRP aferese
- For denne protokollen, velg blodplatedonorer i henhold til italienske lover: blodplatedonorer må være 18-65 år gamle, med normale trykk- og blodtellingsparametere og et blodplatetall ikke mindre enn 180 x 109 blodplater / L23. Kvalifiserte donorer kan ikke ta platehemmende eller antikoagulerende legemidler innen 1 uke før donasjon.
- Utfør plasma-blodplate-aferese ved hjelp av et automatisert blodinnsamlingssystem, i henhold til produsentens instruksjoner og nasjonale lover23, for å oppnå 1 enhet enkeltdonor blodplaterikt plasma (PRP). Samle PRP i Adenin Citrate Dextrose Solution A (ACD-A) antikoagulant løsning.
MERK: Blodplate-aferese utføres med en kontinuerlig prosedyre; Hentetidspunktet ligger i et område mellom 40 min og 90 min. Mengden ACD levert til giverne og tidspunktet for prosedyrene avhenger av donorens egenskaper, for eksempel hematokrit og nålmåler.
- PRP-enhetenes egenskaper
MERK: Følgende trinn utføres vanligvis automatisk av det automatiserte blodinnsamlingssystemet under plasma-blodplate-afereseprosedyren. Vennligst sjekk produsentens instruksjonshåndbok.- Resuspendere PRP-enhetene oppsamlet ved aferese i en tilstrekkelig mengde konserveringsmiddeloppløsning med den minste mengden restplasma, som er nødvendig for å opprettholde pH > 6,4 i løpet av hele lagringstiden, til et gjennomsnittlig sluttvolum på 180 ml netto av antikoagulantoppløsningen (ca. 40 ml).
MERK: I henhold til italiensk lov må kvalitetskontroller vurdere at blodplatetallet (PLT) er minst 2,0 x 10 11 PLT / enhet, mens resterende leukocytter må være mindre enn 1 x10 6 celler / enhet. - Oppbevar leukodetert og bestrålt PRP i maksimalt 5 dager ved 22 °C ± 2 °C på en trombocyttskaker før ytterligere manipulering23.
- Resuspendere PRP-enhetene oppsamlet ved aferese i en tilstrekkelig mengde konserveringsmiddeloppløsning med den minste mengden restplasma, som er nødvendig for å opprettholde pH > 6,4 i løpet av hele lagringstiden, til et gjennomsnittlig sluttvolum på 180 ml netto av antikoagulantoppløsningen (ca. 40 ml).
- PRP fortynning
- Umiddelbart før du starter PRP-fortynning, utfør en PLT-telling med et hemocytometer ved hjelp av prøven samlet fra hovedposen gjennom en piercingpike.
MERK: Utfør de neste trinnene i sterilitet under en klasse II biohazard hette. Bruk personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller) under prosedyren. - Fortynn PRP med en tilstrekkelig mengde steril 0,9 % NaCl til en endelig konsentrasjon på 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 109 PLT/ml, som simulerer gjennomsnittlig PLT-konsentrasjon i perifert blod.
- Ved å dra nytte av en gjennomborende pigg for blodposer, del den fortynnede PRP-en i 300 ml tomme oppsamlingsposer for å nå et nettovolum på 190 ml / pose.
- Bruk en aliquot av gjenværende fortynnet PRP (vanligvis 1 ml) for å utføre kvalitetskontroller som vurderer mulige mikrobielle forurensninger. Utfør en sterilitetsanalyse etter produsentens instruksjoner i et mikrobiologisk laboratorium (se Materialfortegnelse).
MERK: Bruk kulturflasker som er spesifikke for aerobe blodkulturer, som er i stand til å utføre kvalitativ kultur og utvinning av aerobe mikroorganismer (hovedsakelig bakterier og gjær) fra små volumblodprøver. - Oppbevar fortynnede PRP-poser ved -80 °C i maksimalt 2 måneder før opptining.
- Umiddelbart før du starter PRP-fortynning, utfør en PLT-telling med et hemocytometer ved hjelp av prøven samlet fra hovedposen gjennom en piercingpike.
2. Blodplaterikt plasmalysat (PRP-L) preparat
- Tining
- Før du starter tiningsprosedyren, må du sørge for at et varmt bad er satt til 37 °C. Sett PRP-posene i det varme badet og vent til de er helt tint.
- PRP-L-kolleksjon
- Sentrifuge PRP-posene ved 3000 x g i 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: De neste trinnene skal utføres i sterilitet under en klasse II biohazard hette. - Ved å utnytte overføringsposens gjennomtrengende pigg, kobler du den sentrifugede posen med en tom steril 300 ml overføringspose. Overfør forsiktig PRP-L-supernatanten, samtidig som du unngår rusk, til den nye posen. Når det er mulig, bruk en posepresse.
- Forsegl tilkoblingsrøret til PRP-L-enheten med en poseforsegler.
- Sentrifuge PRP-posene ved 3000 x g i 30 minutter ved romtemperatur.
- PRP-L aliquotation
MERK: En startenhet som inneholder 190 ml PRP (se trinn 1.3.3.) er tilstrekkelig til å fylle to øyedråpesett (for detaljer om det spesifikke medisinske utstyret som brukes til påføring og bevaring av øyedråper fra blodkomponenter, se materialtabellen). Øyedråpesett skal åpnes under en hette i klasse II med hele strenghetteglassene plassert over den forhåndstilkoblede sprøyten og den sentrale pilen på stoppekranen som peker mot venstre for å utelukke det antibakterielle filteret.- Samle 30-60 ml PRP-L med en steril sprøyte og koble sprøyten til Luer/Lock-tilkoblingen på samlebåndet.
- I henhold til produsentens instruksjoner, vri stoppekranen med en halv omdreining for å åpne linjen mellom den PRP-L-holdige sprøyten og den forhåndstilkoblede sprøyten. Fyll den forhåndstilkoblede sprøyten med PRP-L.
- Koble fra PRP-L-sprøyten, lukk rørhetten på luer/lås-tilkoblingen og roter stoppekranen til opprinnelig posisjon. Bruk øyedråpesettsprøyten til å fylle hetteglassene med PRP-L.
- Gjenta prosedyren fra trinn 2.3.1.-2.3.3. til alle applikatorhetteglassene er fylt. Forsikre deg om at hver applikator er riktig fylt, og forsegl dem deretter individuelt med en poseforsegler.
- Gjenta prosedyren med et nytt øyedråpesett.
- Bruk en liten aliquot av gjenværende fortynnet PRP-L for å vurdere mulig mikrobiell kontaminering (se trinn 1.3.4.).
MERK: Hvis væsken ved et uhell når det antibakterielle filteret på enden av strengen, kan sugesprøyten motsette seg motstand og hindre fyllingen. For å fortsette fyllingssyklusen, løft endeseksjonen av strengen for ca. 5/6 aliquots fra det antibakterielle hydrofobe filteret på enden av strengen. I denne stillingen bruker du en ny steril sprøyte (med 30 ml volum) som allerede er fylt med luft. Koble den kvinnelige lueren/låsen til det antibakterielle filteret og trykk hardt og gjentatte ganger på sprøytens stempel for å fjerne alle rester av blodkomponenter og gjøre membranen til det antibakterielle filteret fri for væsken. Fjern sprøyten og fyll de resterende hetteglassene.
- PRP-L-lagring
- Merk hver applikator riktig og legg dem i en plastpose. Merk plastposen også, pass på å markere giverens blodgruppe.
- Oppbevares ved −80 °C i maksimalt 24 måneder før pasienttildeling, i henhold til italiensk lov23 og retningslinjer24.
3. PRP-L dispensasjon
- Utfør pasientoppdrag fortrinnsvis ved å matche PRP-L-blodgruppen. Lever hetteglass med PRP-L-applikator ved hjelp av en kjøleboks, og sørg for at hvert applikatorhetteglass inneholder 1,45 ml PRP-L, noe som tilsvarer omtrent 45 dråper. Instruer pasienten om at applikatorhetteglass kan oppbevares hjemme hos pasientene i opptil 1 måned ved -15 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begrunnelsen for bruk av serumavledede øyedråper (som er det blodbaserte produktet som oftest brukes til behandling av øyeoverflatesykdommer) ligger i innholdet av GFs, som er nesten helt avledet fra sirkulerende blodplater. PRP inneholder et signifikant høyere antall blodplater (og følgelig blodplatederiverte GFs) sammenlignet med perifert blodserum, som varierer mellom 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs / ml. I henhold til italienske lover skal blodplatetallet i PRP-enheter være minst 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT / ml. Derfor, for å oppnå et produkt som simulerer effekten av serum øyedråper, bør PRP fortynnes til det fysiologiske blodplateinnholdet før lysatpreparat.
Likevel, siden vevsreparasjon hovedsakelig drives av blodplateavledede GFer, kan PLT-tellingen alene være misvisende for en effektiv behandling av øyeoverflatesykdommer. I DED, som er øyesykdommen som oftest behandles med blodavledede øyedråper, er tårefilmproduksjon og homeostase svekket. Blodplatebaserte produkter for behandling av DED bør derfor også etterligne det fysiologiske innholdet i tårer.
Å identifisere den mest egnede PRP-L for behandling av øyeoverflatesykdommer, beskrevet i trinn 1.3.2. av denne protokollen vurderte vi foreløpig forskjellige PRP-fortynninger, i henhold til deres PLT-innhold (mellom 0,7 x 10 9 / ml og 0,3 x 109 / ml), og noen representative GFs fra de som er kjent for å være involvert i øyevevsreparasjon12,20,21.
Blodplatetelling ble utført med hemocytometer, mens GFs ble vurdert ved hjelp av multipleksproteinkvantifiseringsanalyse. Analysen ble utført som tidligere beskrevet25 i henhold til produsentens instruksjoner. GFs vist i dette manuskriptet ble valgt for kvantifisering etter en foreløpig screening av 36 GFs og GFRs utført på PRP lysat med en semi-kvantitativ protein array. Luminex-kvantifisering ble utført på 3 av de 36 screenede GF-ene: EGF og PDGF (som viste seg å være de mest tallrike i våre PRP-lysater) og TGFβ-1,2,3 isoformer (hvor innholdet er viktig for øyeoverflatebehandlingen21). EGF- og PDGF-innhold ble målt da de kan påvirke effekten av PRP-L22, mens TGFβ-isoformer ble valgt for sin kjente rolle i immunsignaleringsregualtion21.
Siden proteinmatriser er en del av en annen in vitro-studie om karakterisering av forskjellig PRP26, er disse dataene ikke presentert i dette manuskriptet.
Vi vurderte kvantitativt EGF, PDGF og TGFβ i PRP-lysater fra to forskjellige donorer (D1 og D2), tidligere fortynnet mellom 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLT / ml i0,9% NaCl. Figur 2 viser resultatene av fortynningen på 0,3 x 109 PLT/ml, som viste seg å ligne mest på tåresammensetningen.
Fortynningen på 0,3 x 109 PLT/ml ble valgt basert på litteraturdata om tåresammensetning. EGF-verdiene ble funnet å være ganske lave sammenlignet med gjennomsnittlig riveverdi, men fortsatt i området normalitet27. Selv PDGF, til tross for at det var svært variabelt mellom de to donorene som ble vurdert, var alltid sammenlignbart med konsentrasjonen som ble funnet i normale tårer20. Endelig ble TGFβ-1 funnet å være den mest omfattende isoformen i PRP-L, lik tårer21.
Når den mest egnede PLT-fortynningen for å forberede aferese PRP-L var identifisert, begynte Transfusjonsmedisinenheten å distribuere disse produktene til pasienter som ble rammet av øyeoverflateforstyrrelser i 2015. Oftalmologene samlet rutinemessig OSDI-spørreskjemaene for å overvåke DED-symptomer; OSDI-testen vurderer livskvalitetsmål, for eksempel oppfatningen av okulær irritasjon og hvordan den påvirker funksjonen knyttet til syn. Spørreskjemaet, opprettet av Outcomes Research Group ved Allergan Inc. i 1995 og nå akseptert som et gyldig instrument for å overvåke DED, sendes til pasienter og analyseres som tidligere beskrevet28,29.
Her viser vi de samlede resultatene av OSDI-tester av DED-pasienter behandlet mellom januar 2020 og januar 2021 (n = 27). Etter en 6 måneders behandling med PRP-L gikk OSDI-skårene ned fra 56 ± 21 til 45 ± 21, noe som indikerer en forbedring i pasientenes livskvalitet (figur 3).
Til tross for at disse dataene fortsatt er i det alvorlige området og ikke er relatert til kliniske utfall av effekt, foreslår de at DED-pasienter anser PRP-L som et nyttig produkt som forbedrer okulært ubehag; Dette aspektet bør undersøkes nærmere i prospektive kliniske studier med sikte på å vurdere effekten ved behandling av okulære overflatesykdommer.
I tabell 1 rapporterer vi en sammenligning av dagens produksjonsmetode med en annen metode for fremstilling av allogen PRP-L for øyedråper30 og til andre formål22. Så vidt vi vet, er Zhangs30-protokoll og den nåværende protokollen de eneste publiserte metodene for å produsere PRP-L for øyeoverflaten. I begge er PRP-L hentet fra aferese; forskjeller mellom de to protokollene, hovedsakelig knyttet til antall fryse- og tinesykluser og sentrifugeringstrinn, bør sammenlignes for å forbedre PRP-L-produksjonen. Likevel har disse metodologiske forskjellene ikke vist seg å være skadelige for den regenerative kapasiteten til PRP-L testet på andre vev22.
Figur 1: Hovedtrinnene i protokollen for utarbeidelse av PRP-L. (A) Ordningen med protokollen, fra PRP-innsamling til PRP-L-forberedelse og dispensasjon. (B) Representative bilder av hovedtrinnene i protokollene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Luminex-kvantifisering av blodplateavledede vekstfaktorer for 0,3 x 109/ml fortynning av PRP-L. (A) Epidermal vekstfaktor (EGF); (B) blodplateavledet vekstfaktor (PDGF); (C) transformerende vekstfaktor-beta isoform 1 (TGFβ1); (D) transformere vekstfaktor-beta isoform 2 (TGFβ2); (E) transformerende vekstfaktor-beta isoform 3 (TGFβ3). Verdier uttrykkes som pg/ml, gjennomsnittlig ± standardavvik av tre uavhengige målinger. D1 og D2 er to forskjellige blodplatedonorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Samlet OSDI-score for DED-pasienter behandlet med PRP-L mellom januar 2020 og januar 2021 ved oftalmologisk enhet ved AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 pasienter. OSDI score aggregerte resultater er representert som gjennomsnittlig ± standardfeil, p-verdi ble beregnet med en sammenkoblet t-test med dataanalyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Denne artikkelen | PRP-L for øyet (in vitro studie)29 | PRP-L til andre formål21 | |
| Kilde | PLTs aferese | PLTs aferese | Aferese og fullblod |
| Fryse- og tinesykluser | 1 (ved -80 °C) | 2 (ved -80 °C) | 1-3 (ved -20 °C og -80 °C) |
| Lagringstemperatur | ved -80 °C | ved -80 °C | ved -20 °C og -80 °C |
| Sentrifugeringshastighet før lagring | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtrering før lagring | Nei | Ja | Nei/Ja |
Tabell 1: Sammenligning av protokoller for fremstilling av allogen PRP-L fra blodplatebaserte produkter samlet ved aferese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år har den kliniske bruken av blodplatebaserte produkter for okulære overflatepatologier økt, men deres diffusjon hindres av mangel på vitenskapelig robusthet. Dette skyldes hovedsakelig bred heterogenitet i donorkilder og forberedelsesprotokoller, som ofte ikke er fullstendig avslørt eller ikke spesielt designet for det formål de er dispensert for. Spesielt mangler fortsatt informasjon om blodplatebaserte produkter samlet inn ved aferese. Målet med dette arbeidet var derfor å beskrive den trinnvise behandlingen av blodplaterike plasmalysater (PRP-L) oppnådd ved aferese for behandling av DED.
PRP-L er en optimal kilde for produksjon av øyedråper siden den inneholder flere GF enn de andre blodbaserte produktene22, og sammenlignet med serum eller PRP er produksjonen eller lagringen billig og enkel. For å oppnå PRP-L blir blodplater utsatt for lysis (vanligvis gjennom en eller flere fryse- og tinesykluser) for å frigjøre innholdet. Denne prosessen garanterer en løsning beriket i aktive molekyler som stimulerer vevregenerering22,26. Et økende antall sykdommer er behandlet med PRP-L 22, men indikasjonen for bruk i oftalmologi er fortsatt svak på grunn av de lave standardiseringskriteriene i blodplatesamling og PRP-L-produksjon 3,22.
Allogene blodplatebaserte produkter bør foretrekkes siden de er mer standardiserbare enn autologe, både når det gjelder donoregenskaper og fremstillingsmetode. Pasientens helsetilstand kan påvirke kvaliteten på produktet 6,16,17, mens de interne settene for å samle autologe blodplater fra fullblod når transfusjonstjenester ikke er direkte tilgjengelige, ikke oppfyller standardkvaliteten som kreves i transfusjonsmedisin31.
Så vidt vi vet, er det ingen kliniske studier som karakteriserer bruken av allogen PRP-L i oftalmologi 3, mens det er få rapporter om autolog PRP-L øyedråper3 og bare en studie med allogen PRP-L oppnådd fra ledningsblod for å behandle pasienter med øyeoverflatesykdommer32. Selv om allogen PRP-L er oppført i de kliniske retningslinjene24 og bruken er foreslått 3,30, er det fortsatt mangel på bevis på effekten sammenlignet med andre behandlinger og andre blodbaserte produkter (f.eks. Serum). Her har protokollen som presenteres som mål å hjelpe det vitenskapelige samfunn til å utvikle felles produksjonsmetoder og å belyse metodologiske forskjeller.
Her beskrev vi PRP-L-produksjon med utgangspunkt i allogen PRP samlet inn ved aferese. Blodplatebaserte allogene produkter for å oppnå blodplatelysater kan også samles fra buffy-coats (BCs), og begge kildene er like rapportert31. BCs er oppnådd fra samlede givere (vanligvis fire eller fem), og minimerer dermed de interindividuelle forskjellene. Omvendt øker pooling risikoen for overføring av smittestoffer eller prioner eller stimulering av allogen respons31,33. Aferese er en kompleks og invasiv prosedyre, og bare et mindretall av givere er kvalifisert for eller i samsvar med det34. Likevel er blodplatebaserte produkter fremstilt ved aferese fri for andre gjenværende sirkulerende blodceller og inneholder en høyere mengde PLT35. Av disse grunner er det nåværende arbeidet fokusert på å utvikle kliniske studier for å sammenligne PRP-L fra disse to forskjellige kildene.
I denne protokollen var startkonsentrasjonen av PLT i PRP-enheter samlet inn ved aferese i gjennomsnitt 1 x 109/ml, noe som er i samsvar med de rapporterte konsentrasjonene for andre blodplatebaserte produkter22. I denne metoden fortynnes PLT etterpå med 0,9% NaCl-oppløsning til 0,3 x 109 / ml. Andre protokoller rapporterer bruk av plasma for fortynning22.
Få studier har rapportert bruk av PRP-L i oftalmologi; i disse tilfellene ble autologe øyedråper fremstilt i konsentrasjoner av PLT fra 0,5 x 10 9/ml-1 x 109/ml36,37,38. Som diskutert tidligere, er standardiseringsmarkører ønskelige og vil også bidra til å bestemme riktig fortynning. Her rapporterer vi for eksempel konsentrasjonen av noen sentrale GFer i PRP-L. EGF- og PDGF-innhold påvirker effekten av PRP-L22, mens TGFβ-isoformer er involvert i regulering av immunsignalering21,39, og konsentrasjonen er finregulert. Derfor kan TGFβ-konsentrasjon i blodplatebaserte øyedråper ikke bare påvirke effekten, men også fremkalle potensielle skadelige effekter39; Dermed bør det undersøkes nøye før du definerer riktig fortynning. Ikke desto mindre var den valgte fortynningen - 0,3 x 109 PLT / ml - basert på GFs innhold i tårer21,25. Zhang og medarbeidere sammenlignet tidligere serumbaserte øyedråper, både autologe og allogene, og blodplatebaserte lysater for innholdet i GFs og for deres evne til å fremme regenerering av hornhinneceller in vitro30. Studien viste hvordan disse produktene har sammenlignbare egenskaper, med PRP-L som har høyere EGF-konsentrasjon, men lavere fibronektin. I protokollen ble fryse-/tineprosessen gjentatt to ganger, sentrifugen utført ved 3500 x g i 30 minutter, og blodplatelysatet lagret ved -80 °C30.
Frysing og tining er faktisk et kritisk skritt; de fleste protokollene (inkludert denne) ble utviklet med −80 °C frysing og 37 °C tining, men frysing er også rapportert ved −24 °C, −196 °C og −150 °C 22,33 Selv antall utførte fryse-/tinesykluser er variable, fra 1 til 522,33. Et begrenset antall studier rapporterte også sonikering eller løsningsmiddel / vaskemiddelbehandling for å oppnå blodplatelysater 22,33. Andre metodologiske variabler som tidligere er rapportert ved fremstilling av PRP-L, gjelder sentrifugeringstrinnet - mellom 300 x g og 10000 x g, fra 2 minutter til 60 minutter - og langtidslagringen, som i de fleste tilfeller er ved -80 ° C, selv om lignende produkter også har blitt lagret direkte ved -20 ° C22. Spesielt lagringsforhold bør overvåkes nøye, da de kan påvirke tilgjengeligheten og aktiviteten til GF-er som finnes i lysater. I denne svært heterogene sammenhengen bør kvalitetskontroller og kliniske studier som tar hensyn til frigivelse av biogene faktorer og forskjellene i terapeutisk effekt, evalueres raskt.
Til slutt, her viser vi hvordan denne metoden har blitt signifikant evaluert med et positivt resultat fra en samlet analyse av pasienter med tørr øyesykdom som fikk PRP-L i 6 måneder (OSDI-spørreskjema3). Selv om det er lovende, er OSDI alene ikke tilstrekkelig til å bestemme effekten av PRP-L ved behandling av DED og andre okulære overflatesykdommer, og kliniske studier på bruk av allogen PRP-L er berettiget. Videre bør mulige produktsammensetningsforskjeller på grunn av alternative metodologiske trinn (dvs. fryse og tine, sentrifugering, lagring) sammenlignes for å optimalisere metodologisk prosedyre.
Avslutningsvis hindrer den høye heterogeniteten av blodkilder og protokoller fortsatt den endelige oversettelsen av blodbaserte produkter til klinisk behandling av okulære overflatesykdommer. Selv om PRP-L er et fremvoksende produkt med noen fordelaktige egenskaper, er det nødvendig med ytterligere studier for å validere bruken og utvikle felles retningslinjer. Deling og detaljering av protokollen for forberedelse kan utvide brukervennligheten og kaste lys over de kritiske trinnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke "Casa del Dono di Reggio Emilia" for å gi donor-avledede blodplatekonsentrater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
