Summary
Trombocytlysater representerar ett framväxande verktyg för behandling av okulära ytsjukdomar. Här föreslår vi en metod för beredning, dispensering, lagring och karakterisering av trombocytlysat som samlats in från blodplättsdonatorer.
Abstract
Olika okulära ytsjukdomar behandlas med blod-härledda ögondroppar. Deras användning har introducerats i klinisk praxis på grund av deras metabolit- och tillväxtfaktorinnehåll, vilket främjar regenerering av ögonytan. Blodbaserade ögondroppar kan framställas från olika källor (dvs. helblods- eller trombocytaferesdonation), liksom med olika protokoll (t.ex. olika utspädningar och frys-/upptiningscykler). Denna variabilitet hindrar standardiseringen av kliniska protokoll och följaktligen utvärderingen av deras kliniska effekt. Detaljerade och delade metodförfaranden kan bidra till att fastställa gemensamma riktlinjer. Under de senaste åren har allogena produkter spridit sig som ett alternativ till de autologa behandlingarna eftersom de garanterar högre effektstandarder; bland dem framställs de blodplättrika plasmalysatet (PRP-L) ögondropparna med enkla tillverkningsförfaranden. Vid enheten för transfusionsmedicin vid AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, erhålls PRP-L från blodplätt-aferesdonation. Denna produkt späds initialt till 0,3 x 10 9 blodplättar/ml (med en genomsnittlig koncentration på 1 x 10 9 blodplättar/ml) i0,9 % NaCl. Utspädda blodplättar fryses/tinas och centrifugeras därefter för att eliminera skräp. Den slutliga volymen delas upp i alikvoter på 1,45 ml och lagras vid −80 °C. Innan de dispenseras till patienter testas ögondroppar för sterilitet. Patienter kan lagra trombocytlysater vid −15 °C i upp till 1 månad. Tillväxtfaktorsammansättningen bedöms också utifrån slumpmässigt utvalda alikvoter, och medelvärdena rapporteras här.
Introduction
Blodderivat används ofta i sårvård1, maxillofacial och ortopedisk kirurgi och för behandling av olika okulära ytsjukdomar2 såsom torra ögonsjukdomar (DED)3. Vid DED försämras tårfilmens homeostas som en följd av onormal funktion hos olika faktorer som är involverade i tårproduktion och okulär ytintegritet 4,5.
DED kännetecknas av heterogenitet i orsaker och svårighetsgrad 6,7,8 och kan vara en följd av olika faktorer som åldrande, kön9, kontaktlinser, aktuella eller systemiska läkemedel 10 eller redan existerande tillstånd som Sjögrens syndrom 10. Trots att de har milda symtom påverkar DED miljontals människor över hela världen, vilket påverkar deras livskvalitet och hälso- och sjukvårdssystemet också6.
Många behandlingar har rapporterats för denna patologi, men det finns fortfarande ingen överenskommelse om den mest effektiva lösningen12. Hittills är konstgjorda tårar den första behandlingslinjen som syftar till att återställa tårfilmens vattenhaltiga sammansättning, om än dessa substitut inte innehåller de viktigaste biologiskt aktiva lösta ämnena av naturliga tårar 6,11. Trombocytbaserade produkter anses vara ett giltigt alternativ12,13 till konstgjorda tårar, även om deras kliniska effekt, rekommendationer för användning och beredningsmetoder fortfarande är föremål för debatt3.
Blodbaserade produkter delar med tårar en liknande sammansättning när det gäller metaboliter14, proteiner, lipider, vitaminer, joner, tillväxtfaktorer (GF), antioxidantföreningar 11 och osmolaritet (300 mOsm / L)11. Genom den synergistiska aktiviteten hos deras komponenter främjar de regenerering av hornhinneepitelet, hämmar frisättningen av inflammatoriska cytokiner och ökar antalet bägareceller och uttrycket av muciner i konjunktiva 2,3.
Hittills har heterogenitet i oftalmiska blodbaserade produkter dokumenterats i litteraturen; Dessa produkter kan klassificeras enligt blodgivarnas ursprung, dvs. autologa eller allogena, liksom blodkällan, dvs. perifert blod, navelsträngsblod, serum eller blodplättar.
Även om autologa produkter var de mest utbredda3, blir allogena produkter nu det föredragna valet, eftersom de säkerställer högre effektivitets- och säkerhetsstandarder 15, tillsammans med en betydande minskning av kostnaderna16,17. Tidigare studier visade faktiskt att blodbaserade produkter som erhållits från patienter med autoimmuna och/eller systemiska sjukdomar kan uppvisa förändrad kvalitet och funktionalitet 6,16,17. Trots det faktum att serumbaserade ögondroppar är de mest utbredda, blir trombocytbaserade produkter nyligen bekräftade som ett giltigt alternativ, eftersom de lätt kan förberedas samtidigt som de bibehåller signifikanta effektnivåer 3,11. För närvarande tillgängliga trombocytbaserade produkter kan delas in i trombocytrik plasma (PRP), trombocytrikt plasmalysat (PRP-L) och plasmarikt på tillväxtfaktorer (PRGF)3.
Bland dem har PRP-L fördelen att vara en fryst produkt med lång livslängd. PRP-L kan framställas av aferes, buffy-coats eller till och med från utgående blodplättar (PLTs)18,19, vilket på ett värdefullt sätt minskar deras slöseri. Alikvoterna kan lagras i månader i blodtransfusionscentra vid −80 °C eller till och med hemma hos patienter vid −15 °C under kortare perioder.
PRP-L är mycket berikade i GFs, som har visat sig stimulera ögonytans regenerering 12,20,21. Ändå finns det bara ett fåtal rapporterade kliniska studier på detta område, och alla använde autologa källor 3,22. PRP-L behöver fortfarande ytterligare validering och karakterisering innan den rutinmässigt kan användas för behandling av ögonytesjukdomar, eftersom det inte finns några standardiserade riktlinjer för dess beredning, dispensering och lagring3.
Häri delas ett detaljerat protokoll för produktion av PRP-L som används vid transfusionsmedicinenheten i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, och dispensering till patienter med DED. Vi strävar efter att hjälpa det vetenskapliga samfundet att utveckla standardmetoder för beredning, vilket kan öka homogeniteten och konsistensen i världsomspännande studier och kliniska tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PRP-L som används för kvantitativ bedömning av tillväxtfaktorer samlades in i en bredare studie om karakterisering av PRP-produkter för regenerativa ändamål, utförd vid AUSL-IRCCS di Reggio Emilia och godkänd av Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee den 10 januari 2019 (protokollnummer 2019/0003319). Givarna gav sitt informerade samtycke enligt Helsingforsdeklarationen. Inget etiskt godkännande var nödvändigt för att samla in aggregerade, anonyma data från frågeformuläret Ocular Surface Disease Index (OSDI), som rutinmässigt används av kliniker för att övervaka symtom på torra ögonsyndrom. Figur 1A visar en översikt över det protokoll som följts, medan bilderna i figur 1B visar de viktigaste stegen i proceduren.
1. Insamling av trombocytrik plasma (PRP)
- Prp-aferes
- För detta protokoll, välj trombocytgivare enligt italiensk lag: trombocytgivare måste vara 18-65 år, med normala tryck- och blodtalsparametrar och ett trombocytantal som inte är mindre än 180 x 109 blodplättar / L23. Kvalificerade givare kan inte ta trombocythämmande eller antikoagulantia läkemedel inom 1 vecka före donation.
- Utför plasma-trombocyt-aferes med hjälp av ett automatiserat blodinsamlingssystem, enligt tillverkarens anvisningar och nationell lagstiftning23, för att erhålla 1 enhet trombocytrik plasma med en givare (PRP). Samla PRP i Adenincitratdextroslösning A (ACD-A) antikoagulerande lösning.
OBS: Trombocyt-aferes utförs med en kontinuerlig procedur; Insamlingstiden ligger i intervallet mellan 40 min och 90 min. Mängden ACD som levereras till givarna och tiden för procedurerna beror på givarens egenskaper, t.ex. hematokrit och nålmätare.
- Egenskaper hos grundförutsättningarna
OBS: Följande steg utförs vanligtvis automatiskt av det automatiska bloduppsamlingssystemet under plasma-trombocyt-aferesproceduren. Kontrollera tillverkarens instruktionsmanual.- Återsuspendera de PRP-enheter som samlats in genom aferes i en tillräcklig mängd konserveringslösning med den minsta mängd kvarvarande plasma som krävs för att bibehålla pH-värdet > 6,4 under hela lagringstiden, till en genomsnittlig slutlig volym på 180 ml netto av den antikoagulerande lösningen (cirka 40 ml).
OBS: Enligt italiensk lag måste kvalitetskontrollerna bedöma att antalet blodplättar (PLT) är minst 2,0 x 10 11 PLT/enhet, medan kvarvarande leukocyter måste vara mindre än 1 x10 6 celler/enhet. - Förvara leucodepleted och bestrålad PRP i högst 5 dagar vid 22 °C ± 2 °C på en trombocytskakare innan ytterligare manipulation23.
- Återsuspendera de PRP-enheter som samlats in genom aferes i en tillräcklig mängd konserveringslösning med den minsta mängd kvarvarande plasma som krävs för att bibehålla pH-värdet > 6,4 under hela lagringstiden, till en genomsnittlig slutlig volym på 180 ml netto av den antikoagulerande lösningen (cirka 40 ml).
- PRP-utspädning
- Omedelbart innan PRP-utspädning påbörjas, utför ett PLT-antal med en hemocytometer med hjälp av provet som samlats in från huvudpåsen genom en piercingspik.
OBS: Utför nästa steg i sterilitet under en biohazard-huv av klass II. Använd personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon) under proceduren. - Späd PRP med en tillräcklig mängd steril 0,9 % NaCl till en slutlig koncentration på 0,32 x 10 9± 0,03 x 109 PLT/ml, vilket simulerar den genomsnittliga PLT-koncentrationen i perifert blod.
- Dra nytta av en piercingspik för blodpåsar, dela den utspädda PRP i 300 ml tomma uppsamlingspåsar för att nå en nettovolym på 190 ml / påse.
- Använd en alikvot av kvarvarande utspädd grundförutsättning (vanligtvis 1 ml) för att utföra kvalitetskontroller för att bedöma möjliga mikrobiella kontamineringar. Utför en sterilitetsanalys enligt tillverkarens instruktioner i ett mikrobiologiskt laboratorium (se materialförteckning).
OBS: Använd odlingsflaskor som är specifika för aeroba blodkulturer, som kan utföra kvalitativ kultur och återhämtning av aeroba mikroorganismer (främst bakterier och jäst) från blodprover med liten volym. - Förvara utspädda PRP-påsar vid −80 °C i högst 2 månader före upptining.
- Omedelbart innan PRP-utspädning påbörjas, utför ett PLT-antal med en hemocytometer med hjälp av provet som samlats in från huvudpåsen genom en piercingspik.
2. Beredning av trombocytrikt plasmalysat (PRP-L)
- Upptining
- Innan du påbörjar upptiningsproceduren, se till att ett varmt bad är inställt på 37 °C. Lägg PRP-påsarna i det varma badet och vänta tills det är helt tinat.
- PRP-L-insamling
- Centrifugera PRP-påsarna vid 3000 x g i 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Nästa steg bör utföras i sterilitet under en biohazard-huv av klass II. - Utnyttja överföringspåsens piercingspik, anslut den centrifugerade påsen med en tom steril 300 ml överföringspåse. Överför försiktigt PRP-L-supernatanten, samtidigt som du undviker skräp, i den nya påsen. Använd om möjligt en påspress.
- Försegla anslutningsröret på PRP-L-enheten med en påsförseglare.
- Centrifugera PRP-påsarna vid 3000 x g i 30 minuter vid rumstemperatur.
- PRP-L aliquotation
OBS: En startenhet som innehåller 190 ml grundförutsättning (se steg 1.3.3.) är tillräcklig för att fylla två ögondroppar (för mer information om de specifika medicintekniska produkter som används för applicering och konservering av ögondroppar från blodkomponenter, se materialförteckningen). Kit med ögondroppar ska öppnas under en klass II-huva med hela strängflaskorna placerade ovanför den förkopplade sprutan och stoppkranens mittpil pekande åt vänster för att utesluta det antibakteriella filtret.- Samla upp 30-60 ml PRP-L med en steril spruta och koppla sprutan till Luer/låsanslutningen på påfyllningsledningen.
- Enligt tillverkarens instruktioner, vrid stoppkranen med hälften av ett varv för att öppna linjen mellan den PRP-L-innehållande sprutan och den föranslutna sprutan. Fyll den föranslutna sprutan med PRP-L.
- Koppla bort PRP-L-sprutan, stäng rörlocket på luer/låsanslutningen och vrid stoppkranen till originalläge. Använd sprutan med ögondroppar för att fylla injektionsflaskorna med PRP-L.
- Upprepa proceduren från steg 2.3.1.-2.3.3. tills alla applikatorflaskor är fyllda. Se till att varje applikator är ordentligt fylld och försegla dem sedan individuellt med en påsförseglare.
- Upprepa proceduren med ett nytt ögondroppar kit.
- Använd en liten alikvot av kvarvarande utspädd grundförutsättning för avgasrening för att bedöma eventuell mikrobiell kontaminering (se steg 1.3.4).
OBS: Om vätskan av misstag når det antibakteriella filtret i slutet av strängen kan sugsprutan motsätta sig motstånd och hindra fyllningen. För att fortsätta påfyllningscykeln, höj strängens änddel för cirka 5/6 alikvoter från det antibakteriella hydrofoba filtret i slutet av strängen. Använd i detta läge en ny steril spruta (med en volym på 30 ml) som redan har fyllts med luft. Anslut det antibakteriella filtrets honsmörja/lås och tryck hårt och upprepade gånger på sprutans kolv för att avlägsna alla rester av blodkomponenten och göra membranet i det antibakteriella filtret fritt från vätskan. Ta bort sprutan och fyll i de återstående injektionsflaskorna.
- PRP-L-lagring
- Märk varje applikator ordentligt och lägg dem i en plastpåse. Märk plastpåsen också, var noga med att markera givarens blodgrupp.
- Förvaras vid −80 °C i högst 24 månader före patienttilldelning, enligt italiensk lag23 ochriktlinjer 24.
3. PRP-L-dispens
- Utför patientuppdrag helst genom att matcha PRP-L-blodgruppen. Leverera PRP-L applikatorflaskor med en kylbox och se till att varje applikatorflaska innehåller 1,45 ml PRP-L, vilket motsvarar cirka 45 droppar. Instruera patienten att applikatorflaskor kan förvaras hemma hos patienter i upp till 1 månad vid −15 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Motivet för användningen av serumbaserade ögondroppar (som är den blodbaserade produkt som oftast används för behandling av ögonytesjukdomar) ligger i deras innehåll av GF, som nästan helt härrör från cirkulerande blodplättar. PRP innehåller ett signifikant högre antal blodplättar (och följaktligen av trombocyt-härledda GFs) jämfört med serum från perifert blod, mellan 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/ml. Enligt italienska lagar bör antalet blodplättar i PRP-enheter vara minst 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT / ml. För att erhålla en produkt som simulerar effekten av serumögondroppar bör PRP därför spädas till det fysiologiska trombocytinnehållet före lysatberedning.
Men eftersom vävnadsreparation huvudsakligen drivs av trombocyt-härledda GFs, kan PLT-scount ensam vara vilseledande för en effektiv behandling av ögonytesjukdomar. Vid DED, som är den ögonsjukdom som oftast behandlas med blodbaserade ögondroppar, försämras tårfilmsproduktionen och homeostasen. Trombocytbaserade produkter för behandling av DED bör därför också efterlikna det fysiologiska innehållet i tårar.
För att identifiera den lämpligaste PRP-L för behandling av ögonytesjukdomar, beskriven i steg 1.3.2. av detta protokoll bedömde vi preliminärt olika PRP-utspädningar, beroende på deras PLT-innehåll (mellan 0,7 x 10 9 / ml och 0,3 x 109 / ml), och några representativa GF från de som är kända för att vara involverade i ögonvävnadsreparation12,20,21.
Antalet blodplättar utfördes med en hemocytometer, medan GF bedömdes med hjälp av en multiplexproteinkvantifieringsanalys. Analysen utfördes som tidigare beskrivits25 enligt tillverkarens instruktioner. GF som visas i detta manuskript valdes ut för kvantifiering efter en preliminär screening av 36 GF och GFR utförda på PRP-lysat med en semikvantitativ proteinuppsättning. Luminexkvantifiering utfördes på 3 av de 36 screenade GF: EGF och PDGF (som visade sig vara de vanligaste i våra PRP-lysater) och TGFβ-1,2,3 isoformer (för vilka innehållet är viktigt för ögonytebehandlingen21). Egf- och PDGF-halten mättes eftersom de kan påverka effekten av PRP-L22, medan TGFβ-isoformer valdes ut för deras kända roll i immunsignalregualtion21.
Eftersom proteinmatriser är en del av en annan in vitro-studie om karakterisering av olika PRP26, presenteras dessa data inte i detta manuskript.
Vi utvärderade kvantitativt EGF, PDGF och TGFβ i PRP-lysater från två olika givare (D1 och D2), tidigare utspädda mellan 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLTs/ml i0,9% NaCl. Figur 2 visar resultaten av utspädningen på 0,3 x 109 PLT/ml, som visade sig mest likna tårkompositionen.
Utspädningen på 0,3 x 109 PLT/ml valdes utifrån litteraturdata om tårsammansättning. Fondens värden befanns vara ganska låga jämfört med det genomsnittliga rivningsvärdet, men fortfarande i intervalletnormalitet 27. Även PDGF, trots att det var mycket varierande mellan de två donatorerna som övervägdes, var alltid jämförbart med koncentrationen som hittades i normala tårar20. Slutligen befanns TGFβ-1 vara den vanligaste isoformen i PRP-L, liknande tårar21.
När den lämpligaste PLT-utspädningen för att förbereda aferes PRP-L hade identifierats började transfusionsmedicinenheten distribuera dessa produkter till patienter som drabbats av ögonytestörningar 2015. Ögonläkarna samlade rutinmässigt in OSDI-frågeformulären för att övervaka DED-symtom; OSDI-testet bedömer livskvalitetsmått, såsom uppfattningen av okulär irritation och hur det påverkar funktionen relaterad till syn. Frågeformuläret, som skapades av Outcomes Research Group vid Allergan Inc. 1995 och nu accepteras som ett giltigt instrument för att övervaka DED, skickas till patienter och analyseras som tidigare beskrivits28,29.
Här visar vi de aggregerade resultaten av OSDI-tester av DED-patienter som behandlats mellan januari 2020 och januari 2021 (n = 27). Efter en 6 månaders behandling med PRP-L minskade OSDI-poängen från 56 ± 21 till 45 ± 21, vilket indikerar en förbättring av patienternas livskvalitet (figur 3).
Trots att dessa data fortfarande ligger i det svåra intervallet och inte relaterar till kliniska resultat av effekt, föreslår de att DED-patienter anser att PRP-L är en användbar produkt som lindrar okulärt obehag; Denna aspekt bör undersökas ytterligare i prospektiva kliniska prövningar som syftar till att bedöma dess effekt vid behandling av ögonsjukdomar.
I tabell 1 redovisar vi en jämförelse av den nuvarande produktionsmetoden med en annan metod för beredning av allogen PRP-L för ögondroppar30 och för andra ändamål22. Såvitt vi vet är Zhangs30-protokoll och det nuvarande protokollet de enda publicerade metoderna för att producera PRP-L för ögonytan. I båda erhålls PRP-L från aferes; Skillnaderna mellan de två protokollen, främst när det gäller antalet frys- och upptiningscykler och centrifugeringssteg, bör jämföras för att förbättra produktionen av grundförutsättningar. Dessa metodologiska skillnader har dock inte visat sig vara skadliga för den regenerativa förmågan hos PRP-L som testats på andra vävnader22.
Figur 1: De viktigaste stegen i protokollet för beredning av PRP-L. (A) Schema för protokollet, från PRP-insamling till PRP-L-förberedelse och dispensering. (B) Representativa bilder av de viktigaste stegen i protokollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Luminexkvantifiering av trombocytbaserade tillväxtfaktorer för utspädningen av grundförutsättning för utspädningen av grundförutsättning för 0,3 x 109/ml. (A) Epidermal tillväxtfaktor (EGF). B) Tillväxtfaktor som härrör från trombocyter (PDGF). C) transformerande tillväxtfaktor-beta isoform 1 (TGFβ1), D) transformerande tillväxtfaktor-beta isoform 2 (TGFβ2), (E) transformerande tillväxtfaktor-beta isoform 3 (TGFβ3). Värdena uttrycks som pg/ml, medelvärde ± standardavvikelse för tre oberoende mätningar. D1 och D2 är två olika trombocytgivare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Aggregerade OSDI-poäng för DED-patienter som behandlats med PRP-L mellan januari 2020 och januari 2021 vid oftalmologiska enheten vid AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 patienter. OSDI-poäng aggregerade resultat representeras som medelvärde ± standardfel, p-värdet beräknades med ett parat t-test med dataanalysprogramvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Den här artikeln | PRP-L för ögat (in vitro-studie )29 | PRP-L för andra ändamål21 | |
| Källa | PLTs aferes | PLTs aferes | Aferes och helblod |
| Frys- och tina cykler | 1 (vid -80 °C) | 2 (vid -80 °C) | 1–3 (vid -20 °C och -80 °C) |
| Förvaringstemperatur | vid -80 °C | vid -80 °C | vid -20 °C och -80 °C |
| Centrifugeringshastighet före lagring | 3000 x g/30 minuter | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtrering före lagring | Nej | Ja | Nej/Ja |
Tabell 1: Jämförelse av protokoll för beredning av allogen PRP-L från trombocytbaserade produkter som samlats in genom aferes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har den kliniska användningen av trombocytbaserade produkter för okulära ytpatologier ökat, men deras diffusion hindras av bristen på vetenskaplig robusthet. Detta orsakas främst av stor heterogenitet i givarkällor och beredningsprotokoll, som ofta inte är fullständigt avslöjade eller inte specifikt utformade för det syfte för vilket de dispenseras. Särskilt saknas fortfarande information om trombocytbaserade produkter som samlats in av aferes. Syftet med detta arbete var därför att beskriva den stegvisa bearbetningen av trombocytrika plasmalysater (PRP-L) erhållna genom aferes för behandling av DED.
PRP-L är en optimal källa för produktion av ögondroppar eftersom den innehåller fler GF än de andra blodbaserade produkterna22, och jämfört med serum eller PRP är dess produktion eller lagring billig och enkel. För att erhålla PRP-L utsätts blodplättar för lys (vanligtvis genom en eller flera frys- och upptiningscykler) för att frigöra innehållet. Denna process garanterar en lösning berikad i aktiva molekyler som stimulerar vävnadsregenerering22,26. Ett ökande antal sjukdomar har behandlats med PRP-L 22, men indikationen för användning i oftalmologi är fortfarande svag på grund av de låga standardiseringskriterierna vid trombocytinsamling och PRP-L-produktion 3,22.
Allogena trombocytbaserade produkter bör föredras eftersom de är mer standardiserbara än autologa, både när det gäller givaregenskaper och beredningsmetod. Patientens hälsotillstånd kan påverka produktens kvalitet 6,16,17, medan de interna kiten för att samla in autologa blodplättar från helblod när transfusionstjänster inte är direkt tillgängliga inte uppfyller den standardkvalitet som krävs för transfusionsmedicin31.
Såvitt vi vet finns det inga kliniska studier som karakteriserar användningen av allogen PRP-L i oftalmologi 3, medan det finns få rapporter om autologa PRP-L ögondroppar3 och endast en studie med allogen PRP-L erhållen från navelsträngsblod för att behandla patienter med ögonytesjukdomar32. Även om allogen PRP-L är listad i de kliniska riktlinjerna24 och dess användning har föreslagits 3,30, saknas det fortfarande bevis för dess effekt jämfört med andra behandlingar och andra blodbaserade produkter (t.ex. serum). Här syftar det presenterade protokollet till att hjälpa det vetenskapliga samfundet att utveckla gemensamma produktionsmetoder och att belysa de metodologiska skillnaderna.
Här beskrev vi PRP-L-produktion med utgångspunkt från allogen PRP som samlats in genom aferes. Trombocytbaserade allogena produkter för att erhålla trombocytlysater kan också samlas in från buffy-coats (BC), och båda källorna har rapporterats lika31. BC erhålls från poolade givare (vanligtvis fyra eller fem), vilket minimerar de interindividuella skillnaderna. Omvänt ökar poolning risken för överföring av smittämnen eller prioner eller stimulerar ett allogent svar31,33. Aferes är ett komplext och invasivt förfarande, och endast en minoritet av givarna är berättigade till eller uppfyller kraven i det34. Ändå är trombocytbaserade produkter som erhålls genom aferes fria från andra kvarvarande cirkulerande blodkroppar och innehåller en högre mängd PLTs35. Av dessa skäl är det nuvarande arbetet inriktat på att utveckla kliniska studier för att jämföra PRP-L från dessa två olika källor.
I detta protokoll var utgångskoncentrationen av PLT i PRP-enheter som samlats in genom aferes i genomsnitt 1 x 109/ml, vilket överensstämmer med de rapporterade koncentrationerna för andra trombocytbaserade produkter22. I denna metod späds PLTs därefter med 0,9% NaCl-lösning till 0,3 x 109 / ml. Andra protokoll rapporterar användningen av plasma för utspädningen22.
Få studier har rapporterat användningen av PRP-L i oftalmologi; I dessa fall framställdes autologa ögondroppar vid koncentrationer av PLT från 0,5 x 10 9/ml-1 x 109/ml36,37,38. Som diskuterats tidigare är standardiseringsmarkörer önskvärda och skulle också hjälpa till att bestämma rätt utspädning. Här rapporterar vi till exempel koncentrationen av några centrala GF i PRP-L. EGF- och PDGF-innehåll påverkar effekten av PRP-L22, medan TGFβ-isoformer är involverade i regleringen av immunsignalering21,39, och deras koncentration är finreglerad. Därför kan TGFβ-koncentrationen i trombocytbaserade ögondroppar påverka inte bara effekten utan också framkalla potentiella skadliga effekter39; Därför bör det undersökas noggrant innan man definierar rätt utspädning. Icke desto mindre baserades den valda utspädningen -0,3 x 109 PLT/ml-på GFs-halten i tårar21,25. jämförde tidigare serumbaserade ögondroppar, både autologa och allogena, och trombocytbaserade lysater för deras innehåll i GF och för deras förmåga att främja regenerering av hornhinneceller in vitro30. Studien visade hur dessa produkter har jämförbara egenskaper, där PRP-L har högre EGF-koncentration men lägre fibronektin. I deras protokoll upprepades frysnings-/upptiningsprocessen två gånger, centrifugen utfördes vid 3500 x g i 30 minuter och trombocytlysatet lagrades vid −80 °C30.
Frysning och upptining är verkligen ett kritiskt steg; De flesta protokollen (inklusive detta) utvecklades med −80 °C frysning och 37 °C upptining, men frysning har också rapporterats vid −24 °C, −196 °C och −150 °C 22,33 Även antalet utförda frys-/upptiningscykler varierar, från 1 till 522,33. Ett begränsat antal studier rapporterade också ultraljudsbehandling eller lösningsmedel/tvättmedel behandling för att erhålla trombocytlysater22,33. Andra metodvariabler som tidigare rapporterats vid beredningen av PRP-L gäller centrifugeringssteget mellan 300 x g och 10000 x g, från 2 min till 60 min, och långtidslagringen, som i de flesta fall ligger vid −80 °C, även om liknande produkter också har lagrats direkt vid −20 °C22. I synnerhet bör lagringsförhållandena övervakas noggrant eftersom de kan påverka tillgängligheten och aktiviteten hos GF som ingår i lysater. I detta mycket heterogena sammanhang bör kvalitetskontroller och kliniska studier som tar hänsyn till frisättningen av biogena faktorer och skillnaderna i terapeutisk effekt utvärderas snarast.
Slutligen visar vi här hur denna metod har utvärderats signifikant med ett positivt resultat från en aggregerad analys av patienter med torra ögonsjukdomar som får PRP-L i 6 månader (OSDI-frågeformulär3). Även om OSDI är lovande är det inte tillräckligt för att fastställa effekten av PRP-L vid behandling av DED och andra okulära ytsjukdomar, och kliniska studier om användningen av allogen PRP-L är motiverade. Dessutom bör eventuella skillnader i produktsammansättning på grund av alternativa metodsteg (dvs. frysning och upptining, centrifugering, lagring) jämföras för att optimera metodförfarandet.
Sammanfattningsvis hindrar den höga heterogeniteten hos blodkällor och protokoll fortfarande den definitiva översättningen av blodbaserade produkter till klinisk behandling av okulära ytsjukdomar. Även om PRP-L är en framväxande produkt med vissa fördelaktiga egenskaper, är ytterligare studier nödvändiga för att validera dess användning och för att utveckla gemensamma riktlinjer. Att dela och detaljera förberedelseprotokollet kan utöka användbarheten och belysa de kritiska stegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka "Casa del Dono di Reggio Emilia" för att ha tillhandahållit donatorbaserade trombocytkoncentrat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
