Summary
心电图（ECG）是了解心脏电生理学的关键变量。体育锻炼具有有益的效果，但在心血管疾病的背景下也可能是有害的。本手稿提供了一种在运动过程中记录实时心电图的方法，可用于研究其对小鼠心脏电生理学的影响。
Abstract
定期体育锻炼是心血管健康的主要贡献者，影响各种代谢和电生理过程。然而，在某些心脏病中，例如遗传性心律失常综合征，例如致心律失常性心肌病 （ACM） 或心肌炎，体育锻炼可能对心脏产生负面影响，导致致心律失常底物的产生。目前，运动相关致心律失常重塑的潜在分子机制在很大程度上是未知的，因此尚不清楚在疾病背景下哪种运动频率、持续时间和强度可以被认为是安全的。
所提出的方法允许通过将跑步机训练与心电图的实时监测相结合来研究体育锻炼的致心律失常/抗心律失常作用。植入式遥测设备用于在休息和跑步机训练期间连续记录自由移动小鼠长达 3 个月的心电图。数据采集软件及其分析模块用于分析基本心电图参数，如心率、P 波持续时间、PR 间期、QRS 间期或静息、训练期间和训练后的 QT 持续时间。此外，还评估心率变异性（HRV）参数和心律失常的发生。简而言之，本文描述了一种逐步探索运动诱导的心脏电生理学影响的分步方法，包括小鼠模型中潜在的致心律失常重塑。
Introduction
定期的体育锻炼对健康的生活很重要。然而，某些心血管疾病会导致这种常识性协议至少值得怀疑的情况。在心肌炎患者中，目前的数据甚至显示运动的不良反应，因此，建议在这些患者中暂停所有运动一段时间1，2，3。在其他心血管疾病（CVD）中，例如遗传性心律失常综合征，关于适当运动水平的证据相对较少4，5，6，7，这使得这些病例的临床咨询（主要是针对年轻和身体活跃的患者）非常具有挑战性。
导致收缩力和心力衰竭的不良重塑以及导致心律失常和心源性猝死的致心律失常重塑被认为是运动相关心脏有害影响的标志8。大量研究表明，适度运动对广泛的不同疾病有益9，10.然而，广泛的训练可能会对心脏产生不利影响，导致心律失常，尤其是在其他方面健康的运动员中11。尽管结构重塑过程导致脆弱的致心律失常基质产生可能是这种矛盾情况的基础，如马拉松运动员12所示，但在健康人和心血管疾病患者中与运动相关的不良重塑的具体机制仍然在很大程度上未知。
在动物中，特别是在小鼠中，已经开发了几种合适的模型来模拟广泛的心血管疾病13，14。此外，在小鼠15，16，17中建立了各种运动模型和训练方案，包括电动跑步机训练，自愿轮跑（VWR）和游泳17，18。通过心电图监测评估心脏电生理学通常取决于动物与某种检测装置之间的直接传导连接。因此，要么需要麻醉动物，例如，使用锋利的电极19获得心电图记录，要么需要用约束器20固定动物，或者由于运动伪影而降低数据质量，例如，当使用爪电极21或导电平台22仅允许基本分析时。因此，上述方法都与训练方案不兼容，因此阻止了对导致小鼠不良重塑的运动相关机制的研究。植入式遥测设备可以克服这些障碍，是当今评估有意识和移动动物体内小鼠电生理学的最有力工具和黄金标准23，24。目前的遥测硬件解决方案已经开发用于监测笼子25，26中的小鼠，并且通常需要在笼子下方放置接收器以进行数据采集，因此在这些情况下进行实时监测具有挑战性。在这里，我们提供了一种方法，通过使用植入遥测设备在小鼠跑步机训练期间实时记录心电图来研究运动对心脏电生理学和心律失常发生的影响。所有获得的参数均按照Tomsits等人23的先前描述进行分析。
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Protocol
所有动物程序均按照慕尼黑大学动物护理和伦理委员会的指导方针进行，所有程序均获得德国慕尼黑巴伐利亚州政府的批准（ROB-55.2-2532.Vet_02-16-200）。本研究使用了四只雄性野生型内部繁殖的C57BL / 6N小鼠。
1.发射机的准备和手术植入
注意：有关递质制备和植入的详细方案，请参阅McCauley等人26。
- 变送器的准备
- 直接使用新的变送器，因为它们是无菌的。如果重复使用发射器，请将其放入盐水中清洁设备以去除血迹，去除粘附在发射器和铅电极上的任何组织碎片。初始清洁后，如有必要，将变送器浸入1%清洁溶液（见 材料表）中4小时以进一步清洁变送器。
- 通过将随附的磁铁放在附近来激活发射器。激活后，使用无线电设备以 530 Hz AM 频率测试来自发射器的信号。尖锐而清晰的蜂鸣声表示发射器已激活，而停用的发射器不会发出任何信号。
- 手术准备和植入
注意：所有外科手术必须在清洁和无菌的条件下进行。- 使用前对所有表面和可重复使用的设备进行消毒，并使用无菌一次性用品，例如纱布、手套等。
- 通过缩短到最佳长度来准备发射器的引线，负极（白色）引线约为 3.5 厘米，正极（红色）引线约为 2.5 厘米。通过做一个小切口来去除电极尖端的红色和白色绝缘护套，露出 5-7 mm 的导线。
注意：建议这些长度用于9-12周龄的BALB / c或C57BL / 6小鼠，重量~25克。调整研究中使用的动物是否更大/更重。 - 注意发射器的重量和鼠标的重量。另外，请注意 DSI 提供的变送器的序列号和校准值。
注意：动物的体重用于计算麻醉剂和镇痛药的剂量。初始体重也用作评估动物术后恢复的参考。 - 在连接到异氟烷蒸发器的诱导室中麻醉小鼠，异氟烷蒸发器用2%-3%异氟烷（体积/体积）冲洗，由1 L / min的100%氧气驱动。等待完全麻醉发作，并在继续之前检查脚趾捏和眼睑反射以确保麻醉的深度适当。
- 接下来，将麻醉动物置于仰卧位并使用软膏（见 材料表）以防止手术过程中眼睛干燥。在手术室的清洁条件下进行外科手术，以将小鼠的体温保持在37°C。 插入直肠探头作为温度传感器。
- 通过连续施用异氟醚（1.5%-2%）来维持麻醉。腹腔注射芬太尼 （0.50 μg/g） 用于镇痛。将吸附器连接到通风装置，以避免多余的气体逸入手术室（推荐）。
- 将双臂中的针式心电图电极和接地电极插入小鼠的左腿以获得导联 I 心电图配置，以在手术期间监测心电图并获得基线心电图。
- 剃除腹部和胸部，并使用洗必泰/酒精对手术区域进行消毒（ 材料表）。使用镊子收紧皮肤，并使用剪刀进行1.5-2厘米的腹侧中线腹部切口（剖腹手术）。
- 在心脏下方的右上胸部和左下胸部制作一个皮下口袋（约1 mm），用于放置电极导线，如图 1所示。
- 将递质体轻轻地放在肠道上方的腹膜中。从之前制作的右上胸部和左下胸口袋的两个口袋皮下插入 14 G 针头，以创建电极定位隧道。
- 引导红色和白色电极通过针头，将它们置于导联II配置中。用 6.0 缝合线定位并固定电极尖端，正极（红色）在左下胸部，负极（白色）在右上胸部。
- 使用6.0缝合线缝合所有切口，并在伤口上涂抹消毒剂（见 材料表）。将动物移至恢复笼（仅一个动物/笼子）并将其置于热源下以保持体温，直到麻醉完全恢复。只有在完全康复并能够保持胸骨卧位后，如果需要，动物才能被放回公司。
- 术后为动物提供足够剂量的镇痛药和抗生素。使用卡洛芬（5μg/g）作为镇痛药，恩诺沙星（5μg/g）作为抗生素。定期监测伤口，以确保没有炎症或伤口裂开。
- 术后恢复期 7-10 天后，动物准备接受跑步机训练。在开始训练之前，确保伤口已正确愈合，并且小鼠健康。
注意：实验期结束后，使用遥测发射器不需要特定的安乐死方法。方法的选择取决于后续分析及其对组织状况的具体要求，以及当地动物护理规则和法规以及相应当地伦理委员会的批准。
2. 数据采集
- 预安排
- 要开始数据采集，请将动物笼放在信号接收器上。将信号接收器连接到由数据交换矩阵和信号接口组成的数据采集系统。使用采集软件将数据采集系统连接到计算机以进行数据可视化（参见 图2A中的设置详细信息）。
- 启动软件并在以下屏幕上确认用户名和许可证 ，然后单击继续。单击 硬件 以设置发射器和信号接收器设备。选择 编辑理疗电话/高清 （MX2） 配置以打开配置窗口。
- 在配置选项卡的列表视图中选择 MX2 配置 ，以在可用列中查看所有可用的变送器及其序列号。单击并将植入的发射器从可用色谱柱拖动到所选色谱柱。
注意： 如果所选列中列出了发射器，则也会将其添加到最左侧配置选项卡中的 MX2 配置中。 - 变送器序列号旁边的彩色图标指示状态。检查所有发射机的状态：绿色带复选标记 = 变送器已同步并准备就绪;带感叹号的红色 = 发射器当前不可用，例如，当前在另一个系统上的实验中配置;黄色 = 发射器正在同步或未连接任何接收器。确保有绿灯指示标称数据传输。
- 要配置变送器，请选择添加的变送器的序列号，然后单击 创建新植入物。从种植体模型的下拉菜单中选择 ETA-F10 以查看种植体详细信息。
- 从与植入物相关的接收器的最左侧菜单中选择接收器的型号和序列号。已插入和连接的接收器列表将显示在此菜单下，并带有一个复选框。
- 单击 搜索ETA植入 物，为植入的发射器分配信号接收器。打开信号类型菜单，然后选择采样率为 1，000 Hz 的 ECG 。 在植入物包装背面输入校准值。选择 “保存并退出”。
- 单击菜单栏中的 设置 ，然后选择 主题设置。将出现一个包含主题详细信息的对话框。输入所需的文件名，该名称将保存在主题设置中。
- 选择动物的性别，然后从物种下拉菜单中选择 鼠标 。打开分析下拉菜单并选择 心电图 （模块）。如果需要，将默认标签更改为ECG，将单位更改为mV。选择心电图旁边的 触发器 。
- 单击最右侧菜单中主题名称下的心电图以打开频道详细信息菜单。选择所需的心电图参数，例如 Num（周期数）、HR（心率）或间隔，例如 PR-I、QT-I、RR-I、QRS 等。 从参数列表中。
- 要设置显示，请单击菜单栏中的 “ 设置”，然后选择 “实验设置”。将出现一个设置对话框。从最右侧菜单中选择图形设置，以定义多达 16 个 图形 窗口，提供原始数据，例如 ECG 信号和派生参数，例如 XY 环、心率趋势。要显示心电图，请选中第 1 页的 启用页面 复选框。
- 跑步机训练，同时实时心电图记录
- 为2车道跑步机准备一个实验设置，如图 2B 所示，在训练期间进行实时ECG监测。
注意：建议使用5车道啮齿动物跑步机（见 材料表）进行训练。该装置由一条分为五个运行隔间的传送带和一个带触摸屏的控制单元组成。每个运行室由一个带盖的透明Plexiglas箱组成，安装在传送带上。每个隔间都有一个电击网格，其中短电脉冲充当刺激以保持动物运行。每个隔间都单独连接到控制单元，以便能够对隔间进行特定的冲击强度调整。控制单元可以显示距离运行、冲击次数和冲击总持续时间。由于所有隔间共享同一条传送带，因此只能同时调整所有隔间的速度和倾斜度。 - 为了在训练期间实现良好的信号转导，将信号接收器放在与动物建立跑步通道的盒子顶部，如图 2B 所示。由于不同的信噪比，信号接收器在跑步道上的确切位置因个体动物而异。
- 移动信号接收器，直到找到运行车道上的最佳位置。通过对正在训练的动物进行测试实验并记下具有最佳信噪比的位置来做到这一点。将此最佳位置用于实际实验。
注意：由于信号接收器的大小和接收器垂直于运行通道轴的位置（如图 2B所示），在这种配置中，只有两只动物可以同时进行ECG监测训练。
- 移动信号接收器，直到找到运行车道上的最佳位置。通过对正在训练的动物进行测试实验并记下具有最佳信噪比的位置来做到这一点。将此最佳位置用于实际实验。
- 将跑步机训练分为以下两个阶段。
- 适应阶段：动物适应训练条件的时间。执行表 1 所示的 1 周适应方案，每天的跑步速度和训练时间如前所述。
- 训练阶段：适应后以固定速度训练动物，每天固定时间，总共 X 天。对于该协议，在3周内以25 cm / s的恒定速度和60分钟/天的持续时间进行5天的训练方案（表2）。训练 5 天后，在下周训练前提供 2 天的休息时间。
注意：X 定义训练的总天数，并根据实验目标定义。
- 打开跑步机。根据训练方案设置跑步机坡度、速度和冲击强度。使用向上 5° 的斜率，这会导致中等水平的应力（推荐）。在适应阶段和训练阶段使用相同的倾向。
注意：跑步机的倾斜度决定了训练强度;选择所需的倾斜度。训练方案可以根据实验目标而有所不同。 - 按控制单元中的 设置 ，然后选择 网格测试。这将打开网格大小选择屏幕。选择 鼠标。将出现一个网格测试屏幕，其中包含两个子测试：冲击测试和清洁测试。按“开始”开始冲击测试。将出现一条消息，警告用户测试冲击。要开始测试，请通过触摸屏幕确认警告。
- 将跑步机随附的海绵配件的导电部分放在跑步机的网格上。放置它，直到屏幕上出现 “通行证 ”一词。像这样测试所有网格。测试将在所有车道成功通过后自动结束，但用户可以随时通过按 停止 按钮停止。
- 要继续清洁测试，请按 >> 按钮并 启动 并等待测试运行。一旦所有车道通过，此测试也会自动停止。如果测试失败，屏幕上将显示一条警告消息。触摸消息以查看结果。
注意：进行这些测试是为了检查电网的清洁度和功能。电网必须清洁，以确保良好的动物检测，并在需要时正确传递电刺激。如果测试失败，请清洁网格，检查所有电缆是否正确连接，然后重复测试。 - 将动物转移到运行室。将信号接收器放在透明盒上，并通过连接电缆 将 信号接收器连接到数据采集系统，数据采集系统由数据交换矩阵和信号接口组成，信号接口又连接到运行采集软件的计算机，以便在实验过程中查看心电信号。
- 按 开始 进入运行模式。动物在与电网接触时将接收到短电脉冲，这将把动物推向跑道。使用0.1 mA的最小冲击强度。这足以激励动物，但在心电图记录中不可见。尝试将食物颗粒放在动物视线内的跑步线外，以保持其动力。
注意：制造商给出的电击范围为 0.1 mA-2 mA。在不同的小鼠品系或不同的实验条件下，可能需要增加冲击强度，但是，我们建议使用尽可能低的冲击强度。或者，为了减少整体电击，请尝试通过轻轻推动动物来保持动物在跑步道上，例如，用棉耳塞或用轻轻的压缩空气刺激它。如果动物训练得好，电网和跑道可以用一块聚苯乙烯泡沫塑料隔开，以避免不必要的冲击。 - 如果动物没有训练并且即使电击也无法激励，如果在实验的前 15 分钟内没有改善，请将其从当天的训练方案中移除。
- 完成后，让动物在训练后休息 5 分钟，然后将其移回笼子。从透明盒中取出信号接收器，然后将其放回笼子下方，如图 2A所示。关闭跑步机以避免任何不必要的冲击。
- 用非酒精清洁剂清洁跑步机皮带、跑步室和电网。干净的车道带来更好的培训效果。
注意：在训练期间，不断清洁车道很重要，因为动物会停止在肮脏的车道上奔跑。我们在训练时使用棉耳塞来清除动物粪便。
- 为2车道跑步机准备一个实验设置，如图 2B 所示，在训练期间进行实时ECG监测。
3. 数据分析
注意：根据个人研究目的，可以获得和分析各种参数。该协议侧重于两个方面：使用Tomsits等人先前描述的方法分析定量心电图特征和训练前，期间和训练后心律失常的发生23;以及心率变异性 （HRV） 分析27。
- 心电图分析
- 有关详细说明，请参阅Tomsits et al.23。简而言之，启动软件，确认软件许可证的用户名和序列号，然后单击 继续。
- 打开扩展名的文件。PnmExp，点击 加载实验。将打开“浏览文件夹”对话框，选择文件，然后单击“ 打开”。
- 转到工具栏中的“ 操作/ 开始 复习”，然后选择“ 加载复查数据 ”对话框，该对话框概述了先前选择的实验中的所有受试者及其记录的信号。
- 通过在屏幕左侧的 “主题 ”面板中单击其名称旁边的复选框来选择要分析的文件。要分析心电图，请在信号类型面板中选中心电图旁边的复选框。
- 选择整个录制或使用时间范围选项定义范围或持续时间。单击“ 确定” 将所选数据集加载到审阅中，事件和参数窗口将自动打开。
- 要显示心电图，请单击菜单工具栏中的 图形设置 以打开一个新窗口。在信号类型中选择 主要 ，输入时间 0：00： 00：01，然后通过输入相应的文本框选择所需的 标签、 显示单位以及 低 轴 和高轴限制 。单击 “启用页面 ”复选框进行确认，将出现定义的ECG跟踪窗口。
- 双击调整心电图的 X 轴和 Y 轴尺寸。左键单击迹线以显示波注释，并正确识别和注释迹线的每个段，P、Q、R、T 波。
注意：如果注释不正确，可以使用几个选项， QRS，PT，高级，噪声，标记，注释，精度进行优化，例如，使用右键单击的分析 /属性 选项。有关详细说明，请参阅Tomsits et al.23。 - 从参数窗口中选择所需的ECG参数，然后复制到电子表格或统计软件中进行进一步分析。
- 心律失常检测
- 对于心律失常检测，请单击 实验/ 数据见解以打开新的数据见解窗口。
- 定义自定义搜索规则以在搜索面板中筛选录制内容。通过在搜索列表中单击鼠标右键后选择“创建新搜索”来 创建新搜索 。
- 在输入对话框的下拉菜单中，定义相应的搜索规则，然后单击“ 确定” 将此搜索规则添加到列表中。要应用搜索规则，请单击它们并将其拖动到左侧感兴趣的频道。
- 在结果面板中，将显示ECG记录中应用该规则的每个部分。有关不同检索规则的详细概述，请参阅 Tomsits et al.23。有关两个示例性规则，心动过缓和心动过速，请参阅下面的定义和描述。
注意：对于这些搜索规则，根据Kaese等人28 将小鼠生理心率定义为500-724次/分钟，对应于82-110ms的周期长度。- 心动过缓：采用两步法，识别每个超过 120 ms 的 RR 间期。由于心动过缓需要多个延长的 RR 间期，因此定义一个附加搜索规则，仅将超过 120 ms 的 20 个连续 RR 间期标识为心动过缓，如下所示：心动过缓-单个作为值 （HRcyc0） <500，心动过缓作为系列（心动过缓-单，1）>=20。单击“ 确定 ”将此搜索规则添加到列表中。
- 遵循相同的心动过速方法，将单心动过速定义为值 （HRcyc0） >724，识别每个短于 82 毫秒的单独 RR 间期，然后将附加搜索规则心动过速添加为系列（心动过速单，1）>=20。单击“ 确定 ”将此搜索规则添加到列表中。
- 心率变异性分析
注意：心率变异性 （HRV） 分析不在采集软件中完成，需要以可读格式从采集软件导出数据。在这里，我们提供了一个简短的分步指南，用于以广泛使用的欧洲数据格式 （EDF） 导出数据。- 启动软件，确认用户名和序列号，然后单击 继续。
- 要导出ECG轨迹以进行HRV分析，请单击 “实验 ”并选择 “导出到EDF”。在导出到EDF窗口中，选择动物编号，检查ECG，选择要导出数据的时间范围，然后单击 导出。
注意：软件设置的导出时间范围没有限制，处理时间更长的数据。也可以将导出拆分为多个部分，例如 24 小时，并在需要时在以后的时间点重新集成它们。 - 启动用于HRV分析的分析软件（见 材料表），单击 文件 并选择 打开 以加载所需的EDF文件。
- 单击 HRV 并选择 设置。这将打开一个窗口来设置各种参数。在心跳检测下，选择要进行 HRV 分析的物种。物种的选择会将分析面板中的直方图箱宽度、pRR 阈值和 SDARR 平均值的值设置为预定义的标准。
- 选择 HRV ，然后选择 报表视图。将结果复制到统计软件以进行进一步的统计分析。
- 在训练阶段，信号质量可能会明显降低。如果是这样，请手动选择具有可见P和QRS的循环以进行后续分析。从分析中排除不良数据标记和没有明确 P 波的数据标记。在经验丰富的心电图分析师的仔细考虑下进行此操作，以避免消除良好的数据点。
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Representative Results
根据个人研究目标，对获得的遥测数据的后续分析将有很大差异。在这里，我们通过获得训练期间记录的高质量数据来证明该方法的可行性，并提供训练前、训练中和训练后心电图和心率变异性分析的示例性结果。数据以平均值±标准平均值误差（SEM）表示，所有统计分析均使用合适的统计软件进行（见 材料表）。通过学生 t检验评估 统计学意义。如Roussel等人之前讨论的那样，使用公式QTc = QT / （√（RR / 100））29校正QT间期。
在训练期间成功记录遥测心电图
使用该协议，可以在训练期间获得动物中具有清晰P，Q，R，S和T波的ECG数据，如图 3所示。
一只动物的所有测量值都来自同一天。基线测量在训练前10点±10分钟进行，当时动物仍在其永久住所中。训练期间的测量值从训练第三周第3天的60分钟训练±10分钟开始，训练后5分钟休息期间和重新转移到永久住房之前进行训练后测量，并在训练后1小时±10分钟进行恢复测量。根据读数，从这些定义的部分中手动选择合适的ECG跟踪部分进行分析，例如， 图4所示数据的连续40个周期。
评估心电图衍生参数
数据用于分析运动前、运动中和运动后的生理变化，如图 4 中的一只示例动物所示。心率（图 4A）、PR 间期（图 4B）、QRS 持续时间（图 4C）和 QTc 间期（图 4D）通过平均连续 40 个心电图周期来评估。当动物运动时，心率增加到 800 bpm 左右，并在训练后逐渐恢复到基线。PR 间期、QRS 持续时间和 QTc 间期在压力下缩短，一旦压力结束，就回到基线。显示了一种动物的示例性数据。
检测心动过速
如步骤3.2.4中所述使用搜索定义来检测心动过速和心动过缓发作。 图5A 显示了基线时的窦性心律。训练期间窦性心动过速的代表性痕迹如图 5B所示。此处显示了一种动物的示例数据。
通过评估心率变异性参数进行数据质量评估
HRV分析如步骤3.3中所述。 HRV分析的5分钟切片如图6所示。 图6A 显示了单个动物在实验过程中的心率。训练期间心率增加并逐渐恢复到训练后的基线，这种趋势也可以通过中位RR间隔来可视化，如图 6B所示。 图6C 显示了在基线和训练期间通过自动RR注释获得的RR间隔（SDRR）的可比标准偏差，证明了数据质量。获得的数据来自三只小鼠。SDRR 是所有拍频间隔 （IBI） 的标准偏差，由软件使用以下公式自动计算为围绕平均 IBI 的 IBI 方差的正平方根：
σx = 
图 1：遥测发射器和导联定位的示意图。 鼠标处于仰卧位;将递质置于腹膜内，导联以 II 导联配置皮下固定。使用生物渲染创建。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：实验设置 。 （A） 在训练前后使用植入式遥测技术进行心电图记录设置，并将信号接收器保存在动物笼子下方。（B） 在跑步机训练期间设置实时心电图监测。为了获得最佳信号质量，信号接收器放置在透明盒上。使用生物渲染创建。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：训练期间的代表性心电图。正常窦性心律、P 波、QRS 和 T 波用大写字母表示，RR 间期用条形标记。请点击此处查看此图的大图。
图 4：一段时间内的遥测数据。 趋势图显示了 （A） 心率 （BPM） 的代表性结果。（B） 公关间隔（毫秒）。（C） QRS 持续时间（毫秒）。（D）QTc间期（ms）之前（基线），训练期间，训练后立即（训练后）和完全恢复（恢复）。通过平均连续40个心电图周期从一只动物获得数据。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：训练前和训练期间的代表性心电图。 （A）训练前的窦性心律。（B）训练期间窦性心动过速。数据来自一只动物。请点击此处查看此图的大图。
图6：通过HRV分析进行数据质量评估 。 （A）运动前（基线）、运动中（训练）和运动后（训练后）的代表性心率趋势。（B）训练前（基线）和训练期间（训练）以及完全恢复（恢复）后的中位RR间隔，显示为SEM平均值±，未配对的学生 t检验，***p<0.001。（C） 训练前（基线）和训练期间（训练）以及完全恢复（恢复）后的特别提款权，n = 3，显示为SEM±平均值。 请点击此处查看此图的大图。
| 5天适应阶段 | ||
| 日 | 速度（厘米/秒） | 时间（分钟） |
| 1 | 16.7 | 10 |
| 2 | 18.3 | 20 |
| 3 | 20 | 30 |
| 4 | 21.7 | 40 |
| 5 | 23.3 | 50 |
| 备注：每15分钟休息2分钟 | ||
表1： 适应阶段的培训制度。
| 为期5天的培训阶段 | ||
| 日 | 速度（厘米/秒） | 时间（分钟） |
| 1 | 25.0 | 60 |
| 2 | 25.0 | 60 |
| 3 | 25.0 | 60 |
| 4 | 25.0 | 60 |
| 5 | 25.0 | 60 |
| 备注：每15分钟休息2分钟 | ||
表2：培训阶段的培训制度。
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Discussion
目前的指南建议定期进行身体活动，因为它已被证明是心血管危险因素的重要调节因素30。还有越来越多的证据表明，适度的身体活动可以在一级和二级预防中预防心房颤动（AF）31，32，33。相反，马拉松运动员等耐力运动员患AF的风险更高，这表明耐力训练也可能产生负面影响34，35。心律失常风险与训练强度之间的这种 U 形关系在其他健康运动员9、36、37、38 和潜在心脏病患者中已清楚地显示，然而，关于训练强度和心律失常发生知之甚少4，5，6，7。
为了克服这一限制并改善患者护理，有必要进一步研究运动对心脏电生理学的影响。为了研究响应训练许多动物物种的不同模型的基本机制和分子/细胞适应，已经开发了15。鉴于每个模型/物种的内在好处和局限性，研究人员必须为每个单独的研究问题选择最合适的一个;关于电生理学和心律失常研究小鼠13，14，39，40和猪模型13，14，41，42，43被广泛使用。尽管已经在猪中开发了使用电动跑步机的训练方案，但仍存在许多重大挑战，包括（i）猪的久坐行为，这需要在实验前进行时间和劳动密集型的调节，以及在实验期间保持猪顺从性的刺激和（ii）体型和体重，这可能会阻止对老年猪的训练或长时间的训练15，44.在小鼠中，已经开发了几种运动方案，包括电动跑步机训练、VWR 或游泳17，18。尽管VWR模仿了啮齿动物的自然跑步模式，并且与游泳和跑步机训练等强制运动方法相比压力较小，但它也有一定的缺点45。VWR的自发性不允许控制运动的强度，持续时间或频率，从而阻止了控制良好的实验。在游泳模型中，可以轻松调节训练的持续时间和强度，必要的设备简单且成本低廉，并且可以在大多数研究实验室中建立该方法46。尽管有这些优点，但在游泳模型中研究电生理学是困难的，因为目前没有选择在游泳过程中监测心电图。本协议中描述的方法将植入式遥测系统与跑步机运动模型相结合，因此克服了电生理学研究背景下其他训练模型的局限性47，48。使用跑步机可以控制各种运动条件，例如强度（斜坡倾斜度和跑步速度）或持续时间。此外，可以研究不同的训练方案，包括耐力运动训练、间歇训练和急性运动。遵循该协议，现在还可以在鼠标在跑步机上运行时使用植入式遥测发射器记录和监测心电图。
鉴于小鼠通常只心甘情愿地奔跑几分钟，因此需要刺激，例如用小棍子敲击背部，吹压缩空气或电刺激。然而，这些刺激会诱发心理压力，从而显着影响实验数据的质量。因此，我们试图通过让鼠标在适应阶段适应跑步机来最小化这些压力因素，以稳定的速度增量并使用前面描述的最小到零冲击强度 15，17，45。
一般来说，在记录心电图时，运动伪影是一个主要问题，尤其是在体力活动期间。按照我们提出的协议，研究人员将能够获取高质量的心电图信号，从而清楚地区分和注释P，Q，R，S，T（图3）。因此，可以使用自动化软件算法在训练之前、期间和之后可靠地评估各种心电图参数，例如心率、心率变异性、PR 间期、QRS 持续时间或 QT 持续时间。此外，可以检测到心律失常，例如快速性心律失常、缓慢性心律失常或停顿。由于心率变异性分析（通常用于研究自主神经系统对心脏的影响）依赖于足够的R波注释，因此可以通过在休息和训练期间通过自动注释获得的类似低SDRR值来验证数据质量，如图6所示。
与每种实验技术一样，这种方法并非没有陷阱，并且包含几个关键步骤。无菌条件和较短的手术时间是成功植入递质、伤口愈合和术后动物快速恢复的必要条件。缝合线不能太紧，否则会导致皮肤坏死。一般来说，外科手术需要实践经验，结果会随着时间的推移而改善。导联定位会影响记录的主矢量，在两个位置陡峭的导联下获得最佳结果，因为它会导致更高的P波和R波振幅，这反过来又是以后ECG分析的关键要求。训练小鼠可能具有挑战性，因为并非所有动物都愿意训练。精心设计的适应方案，包括对跑步机环境的介绍，传送带速度的缓慢增加以及积极增强良好的训练行为，例如，使用食物颗粒，可以帮助调节动物以更好地训练并减少对实验期间潜在干扰刺激的需求。将所有刺激降低到绝对最小值非常重要，因为它们可能会影响数据质量。然而，最关键的一步是在跑步机训练期间遥测接收器的最佳定位，因为它直接决定了所获得数据的质量。必须同时确定每对动物训练的接收器位置，因为它取决于遥测设备和引线的确切位置以及个体动物的运行模式。通过反复试验找到位置，实时直观地判断信号质量。在实验开始之前，所有要分析的心电图特征必须清晰可见。鉴于鼠心率高，即使记录时间短，也会积累许多数据点。正如我们之前讨论的那样，这一点以及整体低信号幅度，自然导致啮齿动物的信噪比低于人类或大型动物，这使得数据分析极具挑战性23.除了执行遥测和跑步机培训所需的昂贵设备外，该协议的一个主要限制是对外科手术和数据分析的高技术要求，限制了该领域初学者的可访问性。
总之，心电图是研究心脏电生理学和心律失常发生的绝妙工具。在人类中，常规进行压力测试以记录运动期间的心电图，并允许评估与训练相关的心脏电生理学影响。小鼠是研究中最常用的物种，已经开发了几种运动方案，但到目前为止，在训练期间监测实时心电图是不可能的。我们提出的方案允许首次在小鼠运动期间获得心电图记录。这将使研究人员能够研究导致有益心脏适应和适应不良，致心律失常重塑的运动相关机制，从而最终改善未来的患者护理。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会（DFG;血管医学临床科学家计划（PRIME），MA 2186/14-1至P. Tomsits），德国心血管研究中心（DZHK;81X2600255至S. Clauss），科罗纳基金会（S199/10079/2019至S. Clauss）和ERA-NET心血管疾病（ERA-CVD; 01KL1910至S. Clauss）。资助者在手稿准备中没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge needle | Sterican | 584125 | |
| Any mouse | e.g. Jackson Laboratories | ||
| Bepanthen | Bayer | 1578675 | |
| Carprofen 0.005 mg/µL | Zoetis | 53716-49-7 | |
| Data Exchange Matrix 2.0 (MX2) | Data Science International | Manages communication between PhysioTel and PhysioTel HD telemetry implants and the acquisition computer. | |
| Enrofloxacin 25 mg/ml | Baytril | 400614.00.00 | |
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Five Lane Treadmill for Mouse | Panlab - Harvard Apparatus | 76-0896 | Includes treadmill unit, touchscreen control unit, a sponge , and cables |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-Pharma | 31303 | |
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| LabChart Pro 8.1.16 | ADInstruments | ||
| Magnet | Data Science International | ||
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Modular connectors | Data Science International | Connecting cables between Reciever, Signal Interface and Matrix 2.0 (MX2) | |
| Novafil s 5-0 | Medtrocin/Covidien | 88864555-23 | |
| Octal BioAmp | ADInstruments | FE238-0239 | Amplifier for recording Surface ECG |
| Octenisept | Schülke | 121418 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| PhysioTel ETA-F10 transmitter | Data Science International | ||
| PhysioTel receiver RPC-1 | Data Science International | Signal reciever | |
| Ponemah 6.42 | Data Science International | ECG Analysis Software | |
| Powerlab | ADInstruments | 3516-1277 | Suface ECG Acquisition hardware device. Includes ECG electrode leads |
| Prism 8.0.1 | Graph Pad | ||
| Radio Device (Sony AF/AM) | Sony | ||
| Signal Interface | Data Science International | Acquires and synchronizes digital signals with telemetry data in Ponemah v6.x. | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| Tergazyme 1% | Alconox | 13051.0 | Commercial cleaning solution |
| Tweezers | Kent Scientific | INS600098-2 |
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