Summary
本协议描述了通过识别和切除颈上神经节来消融肾上腺素能神经支配的小鼠模型。
Abstract
越来越多的证据表明，交感神经系统在癌症进展中起着重要作用。肾上腺素能神经支配调节唾液腺分泌、昼夜节律、黄斑变性、免疫功能和心脏生理学。小鼠外科交感神经切除术是一种研究肾上腺素能神经支配作用的方法，允许完全、单侧肾上腺素能消融，同时避免重复药物干预和相关副作用。然而，由于颈上神经节的尺寸较小，小鼠的手术交感神经切除术在技术上具有挑战性。本研究描述了一种手术技术，用于可靠地识别和切除颈上神经节以消融交感神经系统。通过使用转基因小鼠对荧光交感神经节进行成像、鉴定切除后的霍纳综合征、对切除的神经节中的肾上腺素能标志物进行染色以及观察交感神经切除术后靶器官中肾上腺素能免疫荧光减弱，验证了神经节的成功鉴定和去除。该模型能够对癌症进展以及交感神经系统调节的其他生理过程进行未来研究。
Introduction
多项研究报道，肿瘤微环境中的神经在支持肿瘤进展方面起着积极作用。肾上腺素能交感神经的消融已被证明会损害体内前列腺癌和胃癌的肿瘤发展和播散1,2,3，而肾上腺素能受体的药理学阻断抑制头颈癌的肿瘤生长4。交感神经受累也见于胰腺癌、宫颈癌和基底细胞癌进展 5,6,7。
在交感神经系统中，颈上神经节（SCG）是交感神经干中唯一支配头部的神经节。SCG调节各种生理功能，如唾液分泌和昼夜节律，并直接支配颈部淋巴结8,9,10。SCG 还与病理过程有关，例如黄斑变性11 和主动脉夹层的进展 12。此外，据报道，SCG切除会加重缺血再灌注引起的急性肾损伤13，并改变大鼠的肠道微生物群14。
在小鼠模型中完全消融SCG将代表一种有价值的实验技术，使癌症和自主神经系统研究成为可能。虽然许多研究已利用药物学肾上腺素能受体阻断作为肾上腺素能消融术15,16,17,18,19,20，但手术切除允许完全，单侧肾上腺素能消融，同时避免需要重复的药物干预和相关副作用21,22,23。
SCG的手术切除已在大鼠24中描述，大多数研究颈上神经节切除术（SCGx）效果的报告都采用了大鼠模型。与大鼠模型相比，由于SCG的尺寸小，SCGx在小鼠中的技术更具挑战性。然而，小鼠相对更容易处理，更具成本效益，并且更适合基因操作。Garcia等人是最早在小鼠中报告SCGx的人之一，发现它会影响胰岛素释放25。最近，Ziegler等人根据已发表的大鼠24,26技术描述了小鼠中的SCGx。本文和其他文章描述了一种方法，其中首先识别和解剖颈总动脉（CCA），随后从CCA 21,22,27,28的分叉中取出SCG。在本文中，描述了一种侵入性较小且更安全的小鼠技术，该技术避免了CCA的解剖，从而最大限度地减少了该过程最严重的并发症 - CCA损伤引起的出血。
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Protocol
这里描述的动物程序得到了纪念斯隆凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会的批准。这里使用了八周龄的雄性和雌性NSG小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。器械经过消毒，手术工作表面消毒，动物皮肤表面消毒，外科医生在整个手术过程中戴无菌手套。
1.小鼠的准备和术前设置
- 在手术前一天，在诱导室（3.75英寸宽x 9英寸深x 3.75英寸高，见 材料表）中用2%异氟醚麻醉小鼠。
注意：麻醉的手术平面通常在3-5分钟内完成，具体取决于个体动物。通过捏住脚趾评估麻醉的充分性，并酌情增加异氟醚百分比。- 根据制造商的说明剃除颈部的腹侧或使用化学脱毛剂（见 材料表）。
- 在手术当天，在诱导室中用2%异氟醚麻醉小鼠。通过捏住脚趾评估麻醉的充分性，并酌情增加异氟醚百分比。
- 皮下注射 2 mg/kg 美洛昔康，用于预防性全身镇痛。应用局部眼药膏（见 材料表），以防止麻醉下的眼部损伤和干燥。
- 将鼠标放在其背面的解剖显微镜下并提供热支持。使用精密蒸发器和鼻锥用2%-2.5%异氟醚维持吸入麻醉。用低过敏性胶带轻轻固定双前肢（见 材料表）。
- 用聚维酮碘清洁剃光的颈部腹侧，然后用70%的酒精擦拭。再重复此过程两次。确保手术部位没有任何松散的毛发。
注意：也可以使用一对短弯曲的镊子。确保使用一对细镊子或眼科镊子在这个密闭空间内充分工作。根据机构指南，可以包括额外的术前设置。
2. 解剖
- 使用小剪刀在颈部腹侧切开 1.5 cm 的中线皮肤切口，从下巴下方约 2 毫米到胸骨切口上方 2 毫米。
- 用镊子横向缩回皮肤边缘，露出下面的筋膜和下颌下唾液腺。通过在每侧的皮肤下插入尖剪刀并展开，将皮肤与下面的筋膜分开。用镊子向下拉下颌下腺尾部，露出下面的肌肉。
- 找到二腹肌和舌骨肌后腹部的交界处（图1A，黑色圆圈）。颈前静脉可见于舌骨肌纵向和外侧延伸。
注意：舌骨肌纵向覆盖气管，而二腹肌横向位于气管的颅面（图1C）。- 将 45° 角镊子的尖端插入颈前静脉外侧的交界处，以刺穿并张开上覆的深颈筋膜开口。
- 使用45°角镊子打开在步骤2.3.1中创建的此窗口。通过另一只手用一对弯曲的镊子进行展开动作来扩大这个开口。
3.识别和切除神经节
- 在显示空间的侧壁上找到颈上神经节 （SCG）。它看起来像一个圆形的珍珠组织。
注意：如果未识别SCG，则需要对该空间中的组织进行更横向和更高级的检查。SCG可能很容易与脂肪混淆，脂肪通常存在于该区域。脂肪略带黄色，而相比之下，SCG 呈珍珠白。 - 在用另一只手用镊子保持开口的同时，用镊子轻轻抓住SCG，并将其从开口中拉出，使其更清晰地看到。
- 一旦SCG在视野中，抓住SCG的侧基部，它仍然附着在周围组织上。用另一只手，缓慢而轻柔地在腹侧和尾部方向缩回SCG。
- 多次缩回SCG，逐渐撕脱神经节。在此过程中保持神经节完整，以确保不会留下残留的神经节残留物。
注意：轻轻拉动神经节，因为在此步骤中可能会出现出血。如果发生轻微出血，请使用氧化再生纤维素或一小条无菌纱布在开口上保持压力30秒至1分钟。然后，慢慢提起纱布并重新评估。根据需要重复对开口保持压力的过程，直到出血停止。
- 多次缩回SCG，逐渐撕脱神经节。在此过程中保持神经节完整，以确保不会留下残留的神经节残留物。
- 慢慢松开握住神经节底部的其他镊子。通过寻找血液淤积来检查出血。
注意：此时有轻微渗出是正常的。在关闭和完成手术之前，监测并确保没有持续或显着的出血。如果发生这种情况，请按住开口的压力，如步骤 3.3.1 中所述。 - 将唾液腺移回其正常的解剖位置。使用简单的中断5-0尼龙缝合线近似并闭合皮肤（见 材料表）。
- 将鼠标单独放在干净的笼子中，以便从麻醉中完全恢复。
注意：鼠标可能需要 5-15 分钟才能从麻醉中完全唤醒。在小鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。在鼠标完全恢复之前，不要将鼠标与其他小鼠一起放在笼子里。每24小时至少评估一次小鼠术后恢复，持续72小时。
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Representative Results
该协议描述了小鼠模型中SCG的手术切除。 图 2 显示了解剖标志，包括 CCA、颈前静脉和 SCG。通过夹层（图2A），可以看到右颈前静脉沿着气管的侧缘流动。由于它位于颈前静脉更深的地方，因此左 CCA 及其分叉到颈内动脉 （ICA） 和颈外动脉 （ECA） 仅在静脉外侧隐约可见。在 NSG 中检查此问题时。B6-P0TdTomato转基因小鼠（一种P0-Cre TdTomato小鼠，其中雪旺细胞为荧光红色，未发表的工作）在荧光显微镜下具有红色荧光神经元，可以看到荧光迷走神经横向向CCA，并且在CCA的分叉处可以看到荧光SCG，在颈前静脉外侧（图2B）。
在正常小鼠和转基因小鼠中切除SCG后，与非荧光SCG对照（图3A）和酪氨酸羟化酶（TH）的免疫荧光染色（TH）（肾上腺素能神经的标志物13,29）相比，通过其红色荧光确认了切除的组织（图3B）。
如果手术正确执行，小鼠在恢复完全意识后立即在手术后发生同侧霍纳综合征24。观察到眼睑下垂，这是霍纳综合征的征兆（图4B）。
下颌下唾液腺是SCG支配的组织之一。为了验证成功的SCGx，在右侧SCGx之后对右侧下颌下唾液腺进行了TH的免疫荧光染色，并确认肾上腺素能信号传导成功消融，没有TH神经染色（虚线右侧，图5A）。相比之下，左对照下颌下腺（无SCGx）保持其肾上腺素能输入和完整的TH神经染色（虚线左侧，图5A）。这些发现通过量化得到证实（图5B）。与对照假手术侧相比，这些组织中去甲肾上腺素13、30、31 的 ELISA 定量进一步证实，SCGx 一侧下颌下腺中去甲肾上腺素表达显着降低（图 6）。两者的量化均通过未配对的双尾学生t检验进行分析。
图 1：左颈前静脉作为解剖学标志。 （A）可以看到左颈前静脉（蓝色箭头）纵向和沿着舌骨肌的外缘流动。当刺穿二腹肌和舌骨肌后腹部角之间的深颈筋膜时，穿孔也应在颈前静脉（黑圈）的外侧。（B）当颈深筋膜轻微拉伸时，也可以看到迷走神经（白色箭头）和颈总动脉及其分叉（红色箭头）。（C） （B） 风格化的插图。比例尺 = 100 μm。 缩写：M = 肌肉。请点击此处查看此图的大图。
图2：SCG及其与具有荧光神经元的转基因小鼠解剖标志的关系 。 （A）用红色荧光神经元解剖转基因小鼠，说明右颈总动脉（红色箭头指向其分叉）和颈前静脉。颈总动脉分叉为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。黄色箭头指向横向延伸至颈总动脉的迷走神经。颈总动脉和迷走神经之间的距离在这里看起来更宽，因为鼠标的头部被转动以捕获此图像中的所有结构。（B）用荧光成像检查相同的解剖。迷走神经（黄色箭头）具有红色荧光，再次可见横向延伸至颈总动脉（红色箭头指向其分叉）。荧光SCG位于颈动脉的分叉处（黄色箭头）。颈前静脉（蓝色箭头）向颈总动脉内侧延伸。覆盖在这些结构上的深颈筋膜可以通过其闪闪发光的反射看到。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：切除神经节的显微图像 。 （A）在荧光显微镜下切除颈上神经节。左图显示了从正常小鼠上切除的SCG，用作非荧光对照。右图显示了从具有红色荧光神经元的转基因小鼠上切除的荧光SCG。比例尺 = 500 μm。 （B）在切除的红色荧光神经节（P0）中对酪氨酸羟化酶（TH）进行免疫荧光染色，酪氨酸羟化酶是肾上腺素能神经的标志物。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：SCGx后霍纳综合征的发展 。 （A）SCGx之前的正常小鼠。 （B）同侧SCGx后上睑下垂（黑色箭头），眼睑下垂的发展，这是霍纳综合征的征兆。 请点击此处查看此图的大图。
图5：SCGx与假手术后靶组织中肾上腺素能标志物的免疫荧光和相应的H&E染色 。 （A）左，SCGx或假手术后下颌下唾液腺中酪氨酸羟化酶（TH）的免疫荧光染色。右，同一组织的相应H&E染色。比例尺 = 200 μm。 （B） TH 染色的定量。数据代表 SEM ±平均值。 通过未配对的双尾学生 t 检验进行统计分析， p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：SCGx 与假手术后唾液腺中去甲肾上腺素的 ELISA 定量。 数据表示 SEM ±平均值。 通过未配对的双尾学生 t 检验进行统计分析， p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议描述了用于SCG输入的手术单侧消融的小鼠模型。该技术允许研究肾上腺素能神经支配在各种环境中的影响。此外，切除的交感神经节也可以在3D基质胶培养物中生长，用于 体外 实验30。
涉及SCGx的研究大多在大鼠中进行，因为它们较大的解剖结构允许更容易的解剖可视化和解剖。虽然Ziegler等人之前已经描述了小鼠中的SCGx26，并在其他研究中简要报道了21,22,27,28，但该技术基于大鼠中使用的技术，其中CCA在切除SCG之前暴露和解剖。与大鼠模型相比，小鼠的CCA更小更薄，使得解剖更加困难，因此更容易出现CCA大出血的严重并发症。此外，CCA的暴露需要更广泛的操作，包括胸锁乳突肌的移位，以及唾液腺26的解剖和侧向旋转。相比之下，本方法使用颈前静脉而不是CCA作为解剖标志。与CCA相比，颈前静脉位于更浅表，并进一步向颅骨延伸（图2A）。这提供了一些优点。首先，在没有唾液腺和胸锁乳突肌的解剖和移位的情况下，更容易看到这个标志，使手术的侵入性更小;因此，该协议仅要求稍微拉下唾液（步骤2.2）。最少的解剖也缩短了动物的手术时间和麻醉时间。此外，通过避免对CCA进行广泛解剖，这最大限度地减少了伤害CCA的机会，这可能导致严重情况下的大出血和致命的出血。操作 CCA 是不可避免的，因为 SCG 位于 CCA 的分叉处，但是通过颈前静脉旁边的穿孔接近该区域后内侧，而不是打开直接覆盖 CCA 的筋膜，该方案最大限度地减少了与该大动脉的接触，从而减少了损伤该大动脉的风险。
进行这种手术时面临两个主要挑战。首先是SCG的成功鉴定，特别是考虑到小鼠模型中解剖标志和神经节本身的尺寸非常小。因此，仔细解剖和识别地标至关重要。在步骤2.3中，必须插入倾斜的镊子以在二腹肌和舌骨肌后腹部的角度刺穿深颈筋膜。在此步骤中，通常可以看到颈前静脉沿着舌骨肌的外缘运行，并应保持在插入点的内侧（图1）;这是一个重要的地标，将有助于进入正确的空间找到SCG。如果在该空间的侧位区域未看到SCG，则需要更横向和更优越地探索组织。在解剖过程中，颈动脉鞘在视野的侧面可见，以避免周围组织出血，并帮助识别该结构的SCG内侧。
该手术的第二个主要挑战是管理出血风险。SCG 附近有多个关键血管结构，包括 CCA、颈外动脉和颈内静脉。根据我们的经验，如果发生出血，则在术中而不是术后发生。在步骤 3.4 中松开镊子的步骤中可能会遇到出血。当试图从周围的血管和组织中剥离并轻轻地撕脱神经节时，最有可能发生血管损伤。活动性出血可能不会立即看到，因为一对镊子夹在该区域的血管附近。因此，一旦释放镊子，就可以发现出血，并且在切除腱鞘后仔细检查该区域很重要。在极少数因大血管撕裂而放血的情况下，由于出血速度很快，对该区域保持压力是徒劳的。在这种情况下，必须终止手术，并且必须对小鼠实施安乐死。
鉴于SCG识别的挑战和可能的出血并发症，建议在进行实验性生存手术之前首先对尸体小鼠进行SCG解剖和切除，以熟悉解剖结构。
这种方法也可能受到外科医生的手性的影响。该手术更容易与外科医生的惯用手在同一侧进行。例如，在鼠标右侧进行SCGx时，外科医生的左手将用于抓住神经节的底部，而右手将用于剥离神经节，这意味着手术需要用右手进行更多的技巧。如果要进行双侧SCGx，则可能更耗时，并且需要更多的培训才能在外科医生的非优势侧进行。
SCGx在小鼠模型中的这种手术技术使未来的实验研究能够检查交感神经系统在肿瘤和生理环境中的影响。与其他 体内 模型相比，小鼠模型具有多种优势，包括低成本、易于处理和易于遗传操作，从而能够创建更强大的实验模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Q. W.得到了NIH T32CA009685的支持。R. J. W. 得到了 NIH R01CA219534 的支持。纪念斯隆凯特琳癌症中心的核心设施得到了NIH P30CA008748的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
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