Summary
本プロトコルは、上頸部神経節を同定および切除することによるアドレナリン作動性神経支配のアブレーションのマウスモデルを記載する。
Abstract
交感神経系が癌の進行に重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えています。アドレナリン作動性神経支配は、唾液腺分泌、概日リズム、黄斑変性症、免疫機能、および心臓生理学を調節します。マウス外科的交感神経切除術は、反復的な薬理学的介入の必要性と関連する副作用を回避しながら、完全な片側アドレナリン作動性アブレーションを可能にすることにより、アドレナリン作動性神経支配の効果を研究する方法です。しかし、マウスの外科的交感神経切除術は、上頸部神経節のサイズが小さいため、技術的に困難です。本研究では,上頸部神経節を確実に同定・切除し,交感神経系を切除するための術法について述べる.神経節の同定と除去の成功は、トランスジェニックマウスを使用して蛍光交感神経節を画像化し、切除後のホーナー症候群を特定し、切除された神経節のアドレナリン作動性マーカーを染色し、交感神経切除後の標的臓器におけるアドレナリン作動性免疫蛍光の低下を観察することによって検証されます。このモデルは、交感神経系によって調節される他の生理学的プロセスと同様に、癌の進行の将来の研究を可能にします。
Introduction
複数の研究により、腫瘍微小環境の神経が腫瘍の進行をサポートする上で積極的な役割を果たすことが報告されています。アドレナリン作動性交感神経のアブレーションは、in vivoで前立腺がんおよび胃がんの腫瘍の発生と播種を損なうことが示されています1,2,3一方、アドレナリン受容体の薬理学的遮断は頭頸部がんの腫瘍増殖を阻害します4。交感神経の関与は、膵臓癌、子宮頸癌、および基底細胞癌の進行においても説明されています5,6,7。
交感神経系内では、上頸部神経節(SCG)が頭を神経支配する交感神経幹の唯一の神経節です。SCGは、唾液分泌や概日リズムなどの様々な生理機能を調節し、頸部リンパ節を直接神経支配する8,9,10。SCGはまた、黄斑変性症11および大動脈解離12の進行などの病理学的プロセスにも関与している。さらに、SCGの切除は、虚血再灌流誘発性急性腎障害を悪化させ13、ラットの腸内細菌叢を変化させることが報告されています14。
マウスモデルにおけるSCGの完全なアブレーションは、癌と自律神経系の研究を可能にする貴重な実験技術を表すでしょう。多くの研究がアドレナリン作動性アブレーションとして薬理学的アドレナリン作動性受容体遮断を利用しているが15,16,17,18,19,20、外科的切除は、反復的な薬理学的介入の必要性および関連する副作用を回避しながら、完全な片側アドレナリン作動性アブレーションを可能にする21,22,23。
SCGの外科的切除はラット24で記載されており、上頸部神経節切除術(SCGx)の効果を研究しているほとんどの報告はラットモデルを採用しています。ラットモデルと比較して、SCGxは、SCGのサイズが小さいため、マウスでは技術的により困難です。ただし、マウスは比較的取り扱いが簡単で、費用効果が高く、遺伝子操作に適しています。Garciaらは、マウスでSCGxを最初に報告した人の1人であり、インスリン放出に影響を与えることが判明しました25。より最近になって、Zieglerらは、ラットについて記載された公表された技術に基づいてマウスにおけるSCGxを記載した24、26。この記事および他の記事は、総頸動脈(CCA)が最初に同定され解剖され、続いてSCGがCCA21、22、27、28の分岐部から除去される方法を説明する。この記事では、CCAの解剖を回避し、それによってこの手順の最も深刻な合併症であるCCAの損傷による出血を最小限に抑える、より侵襲的で安全な技術をマウスで説明します。
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Protocol
ここに記載されている動物の手順は、メモリアルスローンケタリングがんセンターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ここでは、8週齢の雄および雌のNSGマウスを使用した。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。器具は滅菌され、外科作業面は消毒され、動物の皮膚表面は消毒され、外科医は処置中ずっと滅菌手袋を着用します。
1. マウスの準備と術前のセットアップ
- 手術の前日に、誘導チャンバー(幅3.75 x 奥行き9 x 高さ3.75、 材料表参照)で2%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。
注:麻酔の外科的平面は、個々の動物に応じて、通常3〜5分で達成されます。つま先をつまんで麻酔の妥当性を評価し、必要に応じてイソフルランの割合を増やします。.- 首の腹側を剃るか、製造元の指示に従って化学脱毛剤を使用してください( 材料表を参照)。
- 手術当日に、誘導チャンバー内で2%イソフルランでマウスを麻酔する。つま先をつまんで麻酔の妥当性を評価し、必要に応じてイソフルランの割合を増やします。.
- 先制全身鎮痛のために2 mg / kgのメロキシカムを皮下投与します。.局所眼軟膏( 材料表を参照)を塗布して、麻酔下での眼の損傷や乾燥を防ぎます。.
- マウスを解剖顕微鏡の背側に置き、熱サポートを提供します。精密気化器とノーズコーンを使用して、2%〜2.5%のイソフルランで吸入麻酔を維持します。低刺激性テープで両前肢をそっと固定します( 材料表を参照)。
- 首の剃った腹側をポビドンヨードできれいにしてから、70%アルコールで拭きます。このプロセスをさらに2回繰り返します。手術部位に抜け毛がないことを確認してください。
注:短い湾曲した鉗子のペアを使用することもできます。この限られたスペースで適切に機能するために、細かい鉗子または眼科用鉗子のペアを使用してください。追加の術前セットアップは、施設のガイドラインに従って含めることができます。
2.解剖
- あごの下約2 mmから胸骨の切り欠きの上2 mmまでの小さなハサミを使用して、首の腹側に1.5 cmの正中線の皮膚切開を行います。
- 鉗子で皮膚の縁を横方向に引っ込めて、下にある筋膜と顎下唾液腺を露出させます。両側の皮膚の下に先のとがったハサミを挿入して広げることにより、下にある筋膜から皮膚を分離します。鉗子で顎下腺を尾側に引き下げて、下にある筋肉を明らかにします。
- 顎二腹筋と舌骨筋の後腹の接合部を見つけます(図1A、黒丸)。前頸静脈は、舌骨筋に対して縦方向および外側に走っているのが見られます。
注:舌骨筋は気管を縦方向に覆い、顎二腹筋は気管の頭蓋側に横向きにあります(図1C)。- 前頸静脈の外側にあるこの接合部に45°の角度の鉗子の先端を挿入して、上にある深い頸部筋膜に開口部を突き刺して広げます。
- 手順2.3.1で作成したこのウィンドウは、45°の角度の鉗子で開いたままにします。もう一方の手で一対の湾曲した鉗子で拡散操作を実行して、この開口部をより広く拡大します。
3.神経節の同定と切除
- 明らかにされた空間の側壁にある上頸部神経節(SCG)を見つけます。それは丸い真珠のような組織として現れます。
注:SCGが特定されない場合は、この空間の組織をより横方向および上方に検査する必要があります。SCGは、この領域にしばしば存在する脂肪と簡単に混同される可能性があります。脂肪はわずかに黄色味を帯びていますが、対照的に、SCGは真珠のように白く見えます。 - もう一方の手で鉗子で開口部を維持しながら、鉗子でSCGをそっとつかみ、開口部から引き出して見やすくします。
- SCGが見えたら、SCGの外側の基部をつかみ、周囲の組織に付着したままにします。もう一方の手を使用して、SCGを腹側および尾方向にゆっくりと穏やかに引っ込めます。
- SCGを複数回引っ込めて、神経節を少しずつ徐々に剥離します。この操作中は神経節を無傷に保ち、残りの神経節の残骸が残らないようにします。
注意: このステップで出血が発生する可能性があるため、神経節をそっと引っ張ってください。軽度の出血が発生した場合は、酸化再生セルロースまたは滅菌ガーゼの小さなストリップを使用して、開口部に30秒から1分間圧力を保持します。次に、ガーゼをゆっくりと持ち上げて再評価します。出血が止まるまで、必要に応じて開口部に圧力を保持するプロセスを繰り返します。
- SCGを複数回引っ込めて、神経節を少しずつ徐々に剥離します。この操作中は神経節を無傷に保ち、残りの神経節の残骸が残らないようにします。
- 神経節の基部を保持している他の鉗子をゆっくりと放します。血液の溜まりを探して出血をチェックします。
注意: この時点でのわずかなにじみは正常です。手順を閉じて終了する前に、持続的または重大な出血がないことを監視し、確認します。これが発生した場合は、手順3.3.1の説明に従って、開口部に圧力をかけたままにします。 - 唾液腺を通常の解剖学的位置に戻します。単純な中断された5-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を近似して閉じます( 材料表を参照)。
- マウスを単独できれいなケージに入れて、麻酔から完全に回復できるようにします。
注意: マウスが麻酔から完全に目覚めるまでに5〜15分かかる場合があります。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復するまで、マウスを他のマウスと一緒にケージに入れないでください。マウスの術後回復を少なくとも24時間に1回、72時間評価する。
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Representative Results
このプロトコルは、マウスモデルにおけるSCGの外科的除去を記述する。 図2 は、CCA、前頸静脈、およびSCGを含む解剖学的ランドマークを示しています。解剖(図2A)では、右前頸静脈が気管の外側境界に沿って流れているのを見ることができます。前頸静脈よりも深い位置にあるため、左CCAとその内頸動脈(ICA)および外頸動脈(ECA)への分岐部は、静脈の外側にかすかにしか見えません。NSGでこれを調べると。B6-P0TdTomatoトランスジェニックマウス(シュワン細胞が蛍光赤色であるP0-Cre TdTomatoマウス、未発表の研究)で赤色蛍光ニューロンを有する蛍光顕微鏡下で、蛍光迷走神経がCCAに横方向に流れているのを見ることができ、蛍光SCGはCCAの分岐部、前頸静脈の外側に見ることができます(図2B)。
正常マウス及びトランスジェニックマウスにおけるSCGの切除後、切除した組織を、非蛍光性SCG対照と比較した赤色蛍光(図3A)及びアドレナリン作動性神経のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する免疫蛍光染色により確認した13、29(図3B)。
処置が正しく行われれば、マウスは完全な意識を取り戻すと手術直後に同側ホーナー症候群を発症する24。眼瞼の垂れ下がる眼瞼下垂が観察され、これはホーナー症候群の徴候である(図4B)。
顎下唾液腺は、SCGによって神経支配される組織の1つです。SCGxの成功を検証するために、右SCGxに続く右顎下唾液腺でTHの免疫蛍光染色を行い、TH神経染色がない場合にアドレナリン作動性シグナル伝達のアブレーションが成功したことを確認しました(点線の右側、図5A)。対照的に、左側の対照顎下腺(SCGxなし)は、アドレナリン作動性入力と無傷のTH神経染色を維持しました(点線の左側、図5A)。これらの知見は、定量化により確認した(図5B)。これらの組織におけるノルエピネフリン13,30,31のELISA定量は、対照偽手術側とは対照的に、SCGx側の顎下腺におけるノルエピネフリン発現の有意な減少をさらに確認した(図6)。両方の定量化は、対応のない両側スチューデントのt検定によって分析されました。
図1:左前頸静脈は解剖学的ランドマークとして機能します 。 (A)左前頸静脈(青矢印)は、舌骨筋の縦方向および外側縁に沿っているのを見ることができます。顎二腹筋と舌骨筋の後腹の角度の間に深い頸部筋膜を穿刺する場合、穿刺も前頸静脈(黒丸)の外側にある必要があります。(B)深部頸部筋膜が少し伸びると、迷走神経(白矢印)と分岐部のある総頸動脈(赤矢印)も見られます。(C)(B)の様式化されたイラスト。スケールバー= 100 μm。 略語:M =筋肉。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光ニューロンを有するトランスジェニックマウスにおけるSCGとその解剖学的ランドマークとの関係 。 (A)赤色蛍光ニューロンを有するトランスジェニックマウスにおける解剖、右総頸動脈(その分岐部を指す赤い矢印)および前頸静脈を示す。総頸動脈は、外頸動脈(ECA)と内頸動脈(ICA)に分かれています。黄色の矢印は、総頸動脈に横方向に走る迷走神経を指しています。総頸動脈と迷走神経の間の距離は、マウスの頭を回してこの画像のすべての構造をキャプチャすると、ここでは広く見えます。(B)同様の解剖を蛍光イメージングで調べた。迷走神経(黄色の矢印)は赤色の蛍光を発しており、再び総頸動脈(赤い矢印はその分岐部を指す)に横方向に走っているのが見られます。蛍光SCGは頸動脈の分岐部に位置しています(黄色の矢じり)。前頸静脈(青い矢印)は、総頸動脈の内側を走っています。これらの構造を覆う深い頸部筋膜は、そのきらめく反射で見ることができます。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:切除された神経節の顕微鏡画像 。 (A)蛍光顕微鏡で切除した上頸部神経節。左は、非蛍光コントロールとして機能する正常なマウスから切除されたSCGを示す。右は、赤色蛍光ニューロンを有するトランスジェニックマウスから切除された蛍光SCGを示す。スケールバー = 500 μm。 (B)切除した赤色蛍光神経節(P0)におけるアドレナリン作動性神経のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の免疫蛍光染色。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:SCGx後のホーナー症候群の発症 。 (A)SCGx前の正常なマウス。 (B)眼瞼下垂症(黒矢印)の発症、眼瞼の垂れ下がり、同側SCGxに続く、ホーナー症候群の徴候。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:SCGxと偽手術後の標的組織におけるアドレナリン作動性マーカーの免疫蛍光および対応するH&E染色 。 (A)左、SCGxまたは偽手術後の顎下唾液腺におけるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の免疫蛍光染色。右は、同じ組織の対応するH&E染色。スケールバー = 200 μm。 (B)TH染色の定量。データはSEM±平均値を表します。 対応のない両側スチューデント t検定による統計解析、 p < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:SCGxと偽手術後の唾液腺におけるノルエピネフリンのELISA定量。 データはSEM±平均を表します。 対応のない両側スチューデント t検定による統計解析、 p < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、SCG入力の外科的片側アブレーションのためのマウスモデルを記述する。この技術は、様々な設定におけるアドレナリン作動性神経支配の効果を研究することを可能にする。さらに、切除された交感神経節は、 in vitro 実験30用の3Dマトリゲル培養で増殖させることもできる。
SCGxを含む研究は、解剖学的構造が大きいため、解剖学的に簡単に解剖できるため、主にラットで行われています。マウスのSCGxはZieglerらによって以前に記載されており26、他の研究で簡単に報告されていますが21、22、27、28、この技術はラットで使用されたものに基づいており、CCAはSCGの切除前に曝露および解剖されます。ラットモデルとは対照的に、マウスのCCAはより小さくて薄いため、解剖がより困難になり、したがって、CCAからの大出血の重篤な合併症を起こしやすくなります。さらに、CCAの曝露は、胸鎖乳突筋の変位、ならびに唾液腺の解剖および側方回転を含む、より広範な操作を必要とする26。対照的に、本法は解剖学的ランドマークとしてCCAの代わりに前頸静脈を使用する。CCAと比較して、前頸静脈はより表面的に位置し、さらに頭蓋方向に伸びています(図2A)。これにはいくつかの利点があります。第一に、このランドマークは、唾液腺と胸鎖乳突筋の解剖と変位なしでより簡単に見られ、手術の侵襲性を低下させます。したがって、このプロトコルでは、唾液をわずかに引き下げるだけで済みます(ステップ2.2)。最小限の解剖はまた、動物の手術時間と麻酔の持続時間を短縮します。さらに、CCAの広範な解剖を回避することにより、これはCCAを傷つける可能性を最小限に抑え、重篤な症例で大胆かつ致命的な出血につながる可能性があります。SCGはCCAの分岐部に位置しているため、CCAの操作は避けられませんが、CCAの真上にある筋膜を開くのではなく、前頸静脈の隣のピアスを介してこの領域に後方に近づくことにより、このプロトコルは、この主要な動脈との接触を最小限に抑え、したがって、損傷のリスクを最小限に抑えます。
この手術を行う際には、2つの大きな課題に直面します。1つ目は、特にマウスモデルにおける解剖学的ランドマークと神経節自体のサイズが非常に小さいことを考えると、SCGの同定に成功したことです。したがって、ランドマークの慎重な解剖と識別が不可欠です。ステップ2.3では、顎二腹筋と舌骨筋の後腹の角度で深い頸部筋膜を突き刺すために、角度の付いた鉗子を挿入する必要があります。このステップでは、前頸静脈は通常、舌骨筋の外側端に沿って走っているのが見られ、挿入点の内側に保つ必要があります(図1)。これは重要なランドマークであり、SCGを見つけるために正しいスペースに入るのに役立ちます。SCGがこの空間の外側領域に見られない場合、組織をより横方向および上方に探索する必要があります。この解剖中、頸動脈鞘は視野の外側に視覚化され、周囲の組織の出血を回避し、この構造の内側のSCGを識別するのに役立ちます。
この手順の2番目の大きな課題は、出血のリスクを管理することです。SCGに隣接して、CCA、外頸動脈、内頸静脈など、複数の重要な血管構造があります。私たちの経験では、出血が発生した場合、それは術後ではなく術中に遭遇します。出血は、ステップ3.4で鉗子を外すステップ中に発生する可能性があります。血管の損傷は、周囲の血管や組織から神経節を剥がして穏やかに剥離しようとすると最も起こりやすいです。活発な出血は、その領域の血管の近くに鉗子のペアが固定されているため、すぐには見られない場合があります。そのため、鉗子を離すと出血が特定される可能性があり、神経節を抜いた後はその部位を注意深く検査することが重要です。主要な血管の裂傷による放血のまれな例では、出血の速度が速いため、その領域に圧力をかけることは無駄です。この状況では、手術を終了し、マウスを安楽死させなければなりません。
SCG同定の課題と出血合併症の可能性を考えると、実験的な生存手術を行う前に、まず死体マウスでSCG解剖と除去を練習して解剖学に慣れることをお勧めします。
この方法は、外科医の利き手によっても影響を受ける可能性があります。この手順は、外科医の利き手と同じ側で実行する方が簡単です。例えば、マウスの右側にSCGxを施す場合、外科医の左手で神経節の基部をつかみ、右手で神経節を剥がすため、右手でのフィネスが必要になります。両側SCGxを実施する場合、外科医の非利き側で実施するには時間がかかり、より多くのトレーニングが必要になる場合があります。
マウスモデルにおけるSCGxのこの外科的技術は、腫瘍学的および生理学的設定の両方で交感神経系の影響を調べる将来の実験的研究を可能にします。マウスモデルは、低コスト、取り扱いの容易さ、遺伝子操作の容易さなど、他の in vivo モデルに比べて複数の利点があり、より強力な実験モデルを作成することができます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
Q. W.はNIH T32CA009685の支援を受けました。R. J. W. は NIH R01CA219534 の支援を受けました。メモリアルスローンケタリングがんセンターのコア施設は、NIH P30CA008748によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | EMD Millipore | AB152 | |
| Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | 59399-162-35 | |
| Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile | Covidien | 1806 | |
| Derf Needle Holder | Thomas Scientific | 1177K00 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ETHILON Nylon Suture | Ethicon | 698H | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Hypoallergenic Surgical Tape | 3M Blenderm | 70200419342 | |
| Induction Chamber, 2 Liter | VetEquip | 941444 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc | 40002957 | chemical hair removing agent |
| NORADRENALINE RESEARCH ELISA | Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) | BA E-5200 | |
| NSG Mouse | Jackson Laboratory | JAX:005557 | |
| Povidone-Iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 |
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