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Immunology and Infection

वायरस प्रसार और सेल-आधारित वर्णमिति मात्रा का ठहराव

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल वेरो अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे की कोशिकाओं में जीका वायरस (ZIKV) के प्रसार और 24-अच्छी तरह से और 96-अच्छी तरह से (उच्च थ्रूपुट) प्रारूपों में सेल-आधारित वर्णमिति इम्यूनोडिटेक्शन विधियों का उपयोग करके ZIKV की मात्रा का वर्णन करता है।

Abstract

जीका वायरस (ZIKV) एक मच्छर जनित वायरस है जो जीनस फ्लेविवायरस से संबंधित है। ZIKV संक्रमण जन्मजात मस्तिष्क असामान्यताओं और वयस्कों में संभावित गुइलेन-बर्रे सिंड्रोम से जुड़ा हुआ है। रोग तंत्र को समझने के लिए ZIKV पर शोध वैक्सीन और उपचार के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। वायरोलॉजी के क्षेत्र में वायरस की मात्रा निर्धारित करने की विधि महत्वपूर्ण और मौलिक है। फोकस बनाने परख (एफएफए) एक वायरस मात्रा का ठहराव परख है जो एंटीबॉडी के साथ वायरल एंटीजन का पता लगाता है और पेरोक्सीडेज इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं के संक्रमण की पहचान करता है। वर्तमान अध्ययन 24-अच्छी तरह से और 96-अच्छी तरह से (उच्च थ्रूपुट) दोनों प्रारूपों का उपयोग करके वायरस प्रसार और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इसी तरह के अन्य अध्ययनों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल ने आगे foci आकार अनुकूलन का वर्णन किया है, जो अन्य वायरस के लिए इस परख के उपयोग का विस्तार करने के लिए एक गाइड के रूप में काम कर सकता है। सबसे पहले, ZIKV प्रसार 3 दिनों के लिए वेरो कोशिकाओं में किया जाता है। ZIKV युक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला काटा और FFA का उपयोग मात्रा निर्धारित की है. संक्षेप में, वायरस कल्चर को वेरो कोशिकाओं पर टीका लगाया जाता है और 2-3 दिनों के लिए ऊष्मायन किया जाता है। Foci गठन तो अनुकूलित धुंधला प्रक्रियाओं के बाद निर्धारित किया जाता है, सेल निर्धारण सहित, permeabilization, अवरुद्ध, एंटीबॉडी बाइंडिंग, और peroxidase सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेशन. सना हुआ वायरस foci एक स्टीरियो खुर्दबीन (24 अच्छी तरह से प्रारूप में मैनुअल गिनती) या सॉफ्टवेयर विश्लेषक (96 अच्छी तरह से प्रारूप में स्वचालित गिनती) का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं. एफएफए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, अपेक्षाकृत तेज़ परिणाम (3-4 दिन) प्रदान करता है और गैर-पट्टिका बनाने वाले वायरस सहित विभिन्न वायरस के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त है। इसके बाद, यह प्रोटोकॉल ZIKV संक्रमण के अध्ययन के लिए उपयोगी है और इसका उपयोग अन्य नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण वायरस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

जीका वायरस (ZIKV) संक्रमण एक उभरती हुई मच्छर जनित वायरल बीमारी है। ZIKV का पहला अलगाव 1947 1,2 में युगांडा में था; यह 1947 से 2007 तक उपेक्षित रहा, क्योंकि नैदानिक लक्षण सबसे अधिक स्पर्शोन्मुख होते हैं और आत्म-सीमित ज्वर की बीमारी की विशेषता होती है। 2007 में, जीका महामारी याप द्वीपों 3,4 में शुरू हुई, इसके बाद प्रशांत क्षेत्रों (फ्रेंच पोलिनेशिया, ईस्टर द्वीप, कुक आइलैंड्स और न्यू कैलेडोनिया) में 2013 से 2014 5,6,7,8 तक बड़ी महामारी हुई, जहांपहली बार वयस्कों में गंभीर न्यूरोलॉजिकल जटिलता गुइलेन-बैरे सिंड्रोम (जीबीएस) की सूचना मिली थी 9. 2015 और 2016 के दौरान, 2013-10 की शुरुआत में ब्राजील में ZIKV के एशियाई जीनोटाइप के उद्भव के बाद अमेरिका भर में पहली व्यापक ZIKV महामारी बह गई। इस प्रकोप के दौरान, नवजात शिशुओंमें माइक्रोसेफली और अन्य न्यूरोलॉजिकल विकारों के 440,000 से 1.3 मिलियन मामले सामने आए। वर्तमान में ZIKV संक्रमण के लिए कोई विशिष्ट इलाज या उपचार नहीं है; इसलिए, संक्रमण को रोकने में सक्षम ZIKV टीकों की तत्काल चिकित्सा आवश्यकता है, खासकर गर्भावस्था के दौरान।

वायरस की मात्रा का ठहराव एक नमूने में मौजूद वायरस की संख्या निर्धारित करने की एक प्रक्रिया है। यह अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और अकादमिक प्रयोगशालाओं में कई क्षेत्र शामिल हैं, जैसे कि चिकित्सा और जीवन विज्ञान। यह प्रक्रिया वाणिज्यिक क्षेत्रों में भी महत्वपूर्ण है, जैसे वायरल टीके, पुनः संयोजक प्रोटीन, वायरल एंटीजन या एंटीवायरल एजेंटों का उत्पादन। कई तरीकों या assays वायरस quantification12 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विधियों या परख का चुनाव सामान्य रूप से वायरस की विशेषताओं, सटीकता के वांछित स्तर और प्रयोग या अनुसंधान की प्रकृति पर निर्भर करता है। सामान्य तौर पर, वायरस की मात्रा निर्धारित करने के तरीकों को दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: आणविक परख जो वायरल न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या आरएनए) की उपस्थिति का पता लगाते हैं और परख जो इन विट्रो12 में वायरस संक्रामकता को मापते हैं। मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर, डीएनए के लिए) या मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर, आरएनए के लिए)13 और डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर14 किसी दिए गए नमूने15 में वायरल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सामान्य आणविक तकनीकों के उदाहरण हैं। हालांकि, इन अत्यधिक संवेदनशील आणविक तकनीक व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य वायरस15 के बीच अंतर नहीं कर सकते. इसलिए, अनुसंधान जिसके लिए जैविक विशेषताओं के बारे में जानकारी की आवश्यकता होती है, जैसे कि कोशिकाओं पर वायरस संक्रामकता, उपर्युक्त आणविक तकनीकों का उपयोग करके पूरा नहीं किया जा सकता है; परख जो व्यवहार्य वायरस की उपस्थिति को माप और निर्धारित कर सकते हैं, की आवश्यकता है। परख है कि उपाय वायरस संक्रामकता परख बनाने पट्टिका (पीएफए), 50% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50), फ्लोरोसेंट फोकस परख, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)12 शामिल हैं.

1952 में रेनाटो डुलबेको द्वारा विकसित पीएफए, वायरस अनुमापन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधियों में से एक है, जिसमें ZIKV16 भी शामिल है। इसका उपयोग संक्रामक लिटिक विषाणुओं के लिए वायरल सांद्रता को सीधे निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह विधि वायरल संक्रमण के बाद एक टीका कोशिका मोनोलेयर में साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई; कोशिका मृत्यु या सजीले टुकड़े के क्षेत्र, असंक्रमित कोशिकाओं से घिरे संक्रमण का एक क्षेत्र) उत्पन्न करने के लिए एक लिटिक वायरस की क्षमता पर आधारित है। हालांकि, परख में कई कमियां हैं जो इसकी उपयोगिता को प्रभावित करती हैं। परख समय लेने वाली है (वायरस के आधार पर लगभग 7-10 दिन लगते हैं), सीपीई-निर्भर, और त्रुटियों के लिए प्रवण। वर्तमान अध्ययन में, हम 24-वेल प्लेट और 96-वेल प्लेट प्रारूपों में ZIKV का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोकोरिमेट्रिक तकनीक, फोकस फॉर्मिंग परख (FFA) की रिपोर्ट करते हैं।

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Protocol

1. वायरस का प्रसार

  1. सेल की तैयारी
    1. एक 75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में वेरो कोशिकाओं को विकसित करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक डुलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) के 12 एमएल होते हैं। 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. एक खुर्दबीन के तहत कोशिकाओं की निगरानी; एक बार कोशिकाओं 70% -90% संगम तक पहुँचने के बाद, वे इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं(चित्रा 1 ए).
      नोट: वेरो कोशिकाएं लगभग हर 24 घंटे17 में दोगुनी हो जाती हैं। 1:10 के कमजोर पड़ने को 75 सेमी2 फ्लास्क में 80% -90% संगम तक पहुंचने में 3 से 4 दिन लगने चाहिए। दैनिक या हर दूसरे दिन कोशिकाओं की निगरानी करें।
  2. सेल मोनोलेयर का संक्रमण
    1. एक 10 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग सेल संस्कृति फ्लास्क से विकास माध्यम निकालें. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके डुलबेको के फॉस्फेट बफर खारा (डीपीबीएस) 2x के 3 एमएल के साथ फ्लास्क को कुल्ला।
      नोट: 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ एक बीकर फ्लास्क/प्लेटों से किसी भी छोड़े गए संक्रामक तरल कचरे कीटाणुरहित करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए।
    2. सीरम मुक्त DMEM के 2 एमएल (DMEM FBS के बिना 2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक) और सेल संस्कृति फ्लास्क में ZIKV inoculum के 20 माइक्रोन जोड़ें. वायरस सोखना की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल कमाल के साथ फ्लास्क सेते हैं.
      नोट: प्रारंभिक ZIKV स्टॉक का अनुमापन ZIKV इनोकुलम जोड़ (चरण 2) की मात्रा निर्धारित करने में सहायक होगा।
      चेतावनी: ZIKV को जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL-2) रोगज़नक़ के रूप में वर्गीकृत किया गया है। ZIKV युक्त सामग्री के साथ सभी प्रक्रियाओं को एक प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ सभी प्रयोगशाला मानक संचालन प्रक्रियाओं (एसओपी) का पालन करना चाहिए।
  3. ओवरले माध्यम का जोड़
    1. 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, निकालें और एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग पतला वायरस inoculum त्यागें. dPBS 2x के 3 एमएल के साथ सेल संस्कृति फ्लास्क कुल्ला.
    2. संक्रमित कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए सेल कल्चर फ्लास्क में रखरखाव मीडिया (डीएमईएम 2% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के 12 एमएल जोड़ें।
    3. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 3 दिनों के लिए संक्रमित वेरो कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत संक्रमित वेरो कोशिकाओं के सीपीई के लिए दैनिक निगरानी।
  4. ZIKV युक्त सेल कल्चर सुपरनेटेंट की कटाई
    1. संक्रमण के बाद 3 दिन पर, सेल गोलाई और टुकड़ी (सीपीई) देखा जा सकता है(चित्रा 1बी-डी)। एक 10 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग कर एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ZIKV युक्त सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला.
    2. सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला फिल्टर करने के लिए 0.22 माइक्रोन पॉलीएथरसल्फोन सिरिंज फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। फ़िल्टर्ड सेल कल्चर सुपरनेटेंट के विभाज्य 500 माइक्रोन को 2.0 एमएल स्क्रू कैप ट्यूबों में और आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: कटाई ZIKV लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      चेतावनी: अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए अगर एक सिरिंज सुई का उपयोग किया जाता है, के रूप में सुई त्वचा पंचर कर सकते हैं. प्रयोगशाला एसओपी स्थापित करने की आवश्यकता है।

2. वायरस मात्रा का ठहराव

  1. सेल की तैयारी
    1. नामित प्लेटों में बीज वेरो कोशिकाओं (24-अच्छी तरह से प्लेट: 0.5 एमएल / अच्छी तरह से, 7.5 एक्स 104 कोशिकाओं / अच्छी तरह से; 96 अच्छी तरह से प्लेट: 0.1 एमएल / अच्छी तरह से, 1.5 एक्स 104 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर थाली सेते हैं।
      नोट: परीक्षण किए जाने के लिए पांच अलग-अलग समय बिंदु हैं (24-अच्छी तरह से प्लेट: 48 एच, 60 एच, 72 एच, 84 एच, और 96 एच संक्रमण के बाद; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 24 एच, 36 एच, 48 एच, 60 एच, और 72 एच संक्रमण के बाद); इसलिए, प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक प्लेट तैयार करें।
    2. 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद और एक बार कोशिकाओं 70% -90% संगम(चित्रा 1E)तक पहुँचने के बाद, थाली संक्रमण के लिए तैयार है. सेल मोनोलेयर के संक्रमण से पहले पतला वायरस स्टॉक (चरण 2.2) तैयार करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. वायरस कमजोर पड़ने
    1. 24- और 96-अच्छी प्लेटों के लिए, प्रत्येक प्लेट के लिए छह बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें ताकि एक नकारात्मक नियंत्रण सहित दस गुना कमजोर पड़ने (10-1 तक 10-5) किया जा सके। एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रयोग सेटअप के लिए, सभी छह microcentrifuge ट्यूबों में सीरम मुक्त DMEM के 450 माइक्रोन जोड़ें. 96-अच्छी प्लेट के लिए प्रयोग सेटअप के लिए, छह ट्यूबों में सीरम मुक्त डीएमईएम के 135 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने से पहले इसकी सामग्री के कमजोर पड़ने को इंगित करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रत्येक ट्यूब को लेबल करें।
    2. धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए, 24 अच्छी तरह से थाली प्रयोग सेटअप के लिए, ZIKV शेयर है कि सीरम मुक्त DMEM के 450 माइक्रोन होता है कि 10-1 ट्यूब में चरण 1 से काटा गया था के 50 माइक्रोन जोड़ें. 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रयोग सेटअप के लिए, 10-1 ट्यूब में ZIKV स्टॉक के 15 माइक्रोन जोड़ें जिसमें सीरम मुक्त डीएमईएम के 135 माइक्रोन शामिल हैं।
    3. भंवर प्रत्येक ट्यूब वायरस और मध्यम मिश्रण करने के लिए. यह पहला दस गुना कमजोर पड़ने वाला है।
      नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने वाली ट्यूब में वायरस और संस्कृति माध्यम का उचित मिश्रण सटीक धारावाहिक कमजोर पड़ने को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
    4. 24 अच्छी तरह से प्लेट प्रयोग सेटअप के लिए, 10-1 ट्यूब resuspended और एक दूसरे दस गुना कमजोर पड़ने के रूप में 10-2 ट्यूब में पतला ZIKV के 50 माइक्रोन हस्तांतरण करने के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करें. 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रयोग सेटअप के लिए, 10-1 ट्यूब को फिर से निलंबित करने के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करें और दूसरे दस गुना कमजोर पड़ने के रूप में 10-2 ट्यूब में पतला ZIKV के 15 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
    5. पांचवें ट्यूब (नकारात्मक नियंत्रण को छोड़कर) तक चार बार कदम 2.2.4 दोहराएँ.
      नोट: क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक पाइपिंग चरण के बाद एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग करें।
  3. सेल मोनोलेयर का संक्रमण
    1. निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से (24 अच्छी तरह से प्लेट: 0.5 एमएल / अच्छी तरह से अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से प्लेट: 0.1 एमएल / अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम त्यागें).
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से dPBS 2x (24 अच्छी तरह से प्लेट: 300 μL/अच्छी तरह से; 96 अच्छी तरह से प्लेट: 60 μL/अच्छी तरह से) के साथ कुल्ला.
    3. उच्चतम से सबसे कम कमजोर पड़ने के लिए काम करना, अच्छी तरह से (24 अच्छी तरह से प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन / अच्छी तरह से प्रत्येक क्रमिक पतला वायरस इनोकुलम जोड़ें)।
      नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने का संक्रमण डुप्लिकेट कुओं में किया जाएगा। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दो असंक्रमित कुओं को बनाए रखें। भ्रम से बचने के लिए प्लेट और कुओं को स्पष्ट रूप से लेबल करें। पार संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक pipetting कदम के बाद विंदुक सुझावों को बदलें.
    4. वायरस सोखना की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल कमाल के साथ थाली सेते हैं.
  4. ओवरले सेल संस्कृति माध्यम का जोड़
    1. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, निकालें और उच्चतम करने के लिए सबसे कम एकाग्रता से वायरस निलंबन त्यागें.
    2. dPBS 2x (24 अच्छी तरह से प्लेट: 300 μL/अच्छी तरह से; 96 अच्छी तरह से प्लेट: 60 μL/अच्छी तरह से) के साथ संक्रमित कोशिकाओं धो लें.
    3. डीएमईएम (2% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) और 1.5% कम चिपचिपापन कार्बोक्सिमिथाइल सेलुलोज (सीएमसी; सामग्री की तालिकादेखें) (24-अच्छी तरह से प्लेट: 1 एमएल / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 0.2 एमएल / अच्छी तरह से)।
    4. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट सेते हैं.
      नोट: इस इनक्यूबेशन अवधि के दौरान प्लेट को परेशान न करें।
    5. अलग-अलग समय बिंदुओं पर धुंधला होने के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें (24-अच्छी तरह से प्लेट: 48 एच, 60 एच, 72 एच, 84 एच, और 96 एच संक्रमण के बाद; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 24 एच, 36 एच, 48 एच, 60 एच, और 72 घंटे संक्रमण के बाद)।

3. धुंधला हो जाना

  1. सेल निर्धारण
    1. इनक्यूबेशन के विशिष्ट घंटों के बाद (24 अच्छी तरह से प्लेट: 48 एच, 60 एच, 72 एच, 84 एच, और 96 एच के बाद संक्रमण; 96 अच्छी तरह से प्लेट: 24 एच, 36 एच, 48 एच, 60 एच, और 72 घंटे के बाद संक्रमण), निकालें और ओवरले माध्यम त्यागें और 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3x धोएं। 96 अच्छी तरह से थाली के लिए, निकालें और ओवरले माध्यम त्यागें और कोशिकाओं को 3x के साथ 3x धोएं 60 माइक्रोन/अच्छी तरह से 1x पीबीएस के साथ एक मल्टीचैनल विंदुक के साथ।
    2. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें (24-अच्छी तरह से प्लेट: 300 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 60 माइक्रोन / अच्छी तरह से)। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं.
      चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड एक ठोस पोलीमराइज्ड फॉर्मलाडेहाइड है। यह एक ज्वलनशील, ठोस, सफेद क्रिस्टलीय पाउडर है जो पानी के साथ मिश्रित या गर्म होने पर फॉर्मलाडेहाइड गैस छोड़ता है। पैराफॉर्मलडिहाइड के उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को एक प्रमाणित रासायनिक धूआं हुड या अनुमोदित समाप्त बाड़ों में आयोजित किया जाना चाहिए, जो फॉर्मलाडेहाइड युक्त रसायनों के लिए विशिष्ट प्रयोगशाला एसओपी के बाद होता है।
    3. 20 मिनट के बाद, पैराफॉर्मलडिहाइड को त्यागें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें। चरण 3.2-3.5 के बाद पारगम्यता, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी ऊष्मायन करें।
      नोट: 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को त्यागते समय, विश्वविद्यालय या संस्थान की अपशिष्ट निपटान प्रक्रिया का पालन करें।
  2. सेल permeabilization
    1. कोशिकाओं को पारगम्य बनाने के लिए 1% ऑक्टाइलफेनॉक्सी पॉली (एथिलीनऑक्सी) इथेनॉल ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें (24-अच्छी प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन / अच्छी तरह से)। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं.
    2. 15 मिनट के बाद, ऑक्टाइलफेनॉक्सी पॉली (एथिलीनऑक्सी) इथेनॉल को त्यागें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं।
  3. अवरुद्ध
    1. नमूने में निरर्थक बंधन को कम करने के लिए 3% स्किम दूध जोड़ें (24-अच्छी तरह से प्लेट: 500 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 100 माइक्रोन / अच्छी तरह से)। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं.
    2. 2 घंटे के बाद, 3% स्किम दूध त्यागें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
      नोट: यह एक रोक बिंदु है। 3% स्किम दूध जोड़ने के बाद, प्लेटों को प्राथमिक एंटीबॉडी प्रविष्टि से 2 दिन पहले तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. एंटी-फ्लेविवायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, 4G2 (क्लोन D1-4G2-4-15; प्राथमिक एंटीबॉडी, सामग्री की तालिका देखें) 1% स्किम दूध (1: 1,000 अनुपात) (24-अच्छी प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन / अच्छी तरह से) में पतला एंटी-फ्लेविवायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, 4 जी 2 (क्लोन डी 1-4 जी 2-4-15; प्राथमिक एंटीबॉडी, सामग्री की तालिका देखें) 1% स्किम दूध (1: 1,000 अनुपात) (24-अच्छी तरह से प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन / अच्छी तरह से)। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं.
    2. 1 घंटे के बाद, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी युक्त समाधान को हटा दें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी सहिजन पेरोक्सीडेज (एचआरपी) ( सामग्री की तालिका देखें) 1% स्किम दूध (1: 1,000 अनुपात) (24-अच्छी तरह से प्लेट: 200 माइक्रोन / अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन / अच्छी तरह से) में पतला के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    2. 1 घंटे के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान को हटा दें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  6. सब्सट्रेट इनक्यूबेशन
    1. 3,3'diaminobenzidine (डीएबी) पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें (24-अच्छी तरह से प्लेट: 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से; 96-अच्छी तरह से प्लेट: 40 माइक्रोन/अच्छी तरह से)। 30 मिनट के बाद, पानी के साथ कुओं धोने से प्रतिक्रिया बंद करो.
    2. प्लेटों को रात भर हवा में सुखाएं और प्लेटें पूरी तरह से सूखने के बाद foci गणना के लिए आगे बढ़ें।

4. वायरस टिटर का निर्धारण

  1. मैनुअल foci गिनती प्रक्रिया (24-अच्छी तरह से प्रारूप)
    1. Foci को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। उस कमजोर पड़ने का चयन करें जो 50-200 foci पैदा करता है।
    2. चयनित कमजोर पड़ने के प्रत्येक प्रतिकृति के लिए foci की गणना करें। चयनित dilutions में से प्रत्येक के लिए foci की औसत संख्या की गणना.
    3. नीचे दिए गए सूत्र के साथ प्रत्येक नमूने के लिए प्रति एमएल (एफएफयू/एमएल) foci बनाने वाली इकाई की गणना करें: FFU/mL = foci की औसत संख्या गिना गया/(पतला वायरस का कमजोर पड़ने x मात्रा जोड़ा गया)।
  2. स्वचालित foci गिनती प्रक्रिया (96-अच्छी तरह से प्रारूप)
    1. एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर 96 अच्छी तरह से थाली स्कैन.
      1. खोलने के लिए सॉफ़्टवेयर पर डबल क्लिक करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. स्विच सूट पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि सूट लागू है कि किसी एक के लिए स्विच किया गया है (अनुपूरक चित्रा 1 ए)। ओके पर क्लिक करें।
      3. स्कैन > पूर्ण प्लेट स्कैन (अनुपूरक चित्रा 1 बी) पर क्लिक करके स्कैन शुरू करें।
      4. कैप्चर प्रारूप 96-अच्छी तरह से प्रारूप (पूरक चित्रा 2 ए) सुनिश्चित करने के लिए डैशबोर्ड पर क्लिक करें।
      5. "ऑटो प्रीलिग्नमेंट उपयोगकर्ता सत्यापित" (पूरक चित्रा 2 बी) के रूप में केंद्रित मोड का चयन करें।
      6. प्लेट लोड करने के लिए बेदखल पर क्लिक करें.
        नोट: प्लेट का ढक्कन खोलें और इसे शीर्ष पर पंक्ति ए के साथ ऊपर की ओर रखें (पूरक चित्रा 3 ए)।
      7. प्लेट का नाम एन्टर करें और OK पर क्लिक करें। प्लेट लोड करने के लिए लोड पर क्लिक करें.
      8. स्कैन शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें। उसके बाद, "ऊपर, नीचे, बाएं, दाएं" बटन का उपयोग करके A1, A12 और H1 के लिए पदों को जांचें और पुष्टि करें (पूरक चित्रा 3B) पर क्लिक करें।
        नोट: सॉफ्टवेयर प्रत्येक अच्छी तरह से स्कैन करना शुरू कर देगा।
      9. एक बार स्कैनिंग पूरी हो जाने के बाद, एक अवलोकन छवि पॉप अप होगी। बंद करें पर क्लिक करें।
      10. स्विचबोर्ड पर वापस क्लिक करके स्कैन से बाहर निकलें।
    2. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से थाली गिनती.
      1. स्मार्ट गणना > गणना पर क्लिक करें.
      2. सॉफ्टवेयर पर, यह दिखाएगा "चरण 1 का 5: गिनती करने के लिए प्लेटों का चयन करें"। लोड प्लेट पर क्लिक करें। पूरे फ़ोल्डर टिक और स्कैन किया गया थाली (पूरक चित्रा 4 ए) आयात करने के लिए चयन करें पर क्लिक करें.
      3. सॉफ्टवेयर पर, यह दिखाएगा "5 का चरण 2: गिनती मापदंडों को परिभाषित करें"। पैरामीटर समायोजित करें पर क्लिक करें, और पैरामीटर प्रदर्शित किए जाएंगे (फैलाना प्रक्रिया; छोटा/सामान्य/बड़ा/सबसे बड़ा/सबसे बड़ा +1; स्पॉट पृथक्करण; गिना हुआ क्षेत्र; पृष्ठभूमि संतुलन; फाइबर हटाने; गेटिंग)।
        नोट: एक अच्छी तरह से शुरू करें, और सभी कुओं के लिए सर्वोत्तम सेटिंग्स खोजने के लिए आगे और पीछे जांचें।
      4. एक बार हो जाने के बाद, अगला (पूरक चित्रा 4 बी) पर क्लिक करें।
      5. सॉफ्टवेयर पर, यह "5 का चरण 3: कुओं का चयन / एक बार गिने जाने वाले कुएं का चयन पूरा हो जाने के बाद, आगे बढ़ने के लिए नेक्स्ट पर क्लिक करें।
        नोट: गिने जाने के लिए चुने गए कुओं को प्रत्येक कुएं के ऊपरी दाएं कोने में "सी" के साथ दिखाई देगा (पूरक चित्रा 5 ए)।
      6. सॉफ्टवेयर पर, यह "5 में से चरण 4: आउटपुट सेटिंग्स" दिखाएगा। सेटिंग्स (जैसे छवि प्रारूप) उपयुक्त हैं या नहीं, यह जांचने के लिए आउटपुट सेटिंग्स देखें/संशोधित करें पर क्लिक करें। सहेजें और बाहर निकलें > अगला (पूरक चित्रा 5 बी) पर क्लिक करें।
      7. सॉफ्टवेयर पर, यह "5 का चरण 5: ऑटोकाउंट प्रारंभ करें" दिखाएगा। स्टार्ट ऑटोकाउंट (पूरक चित्रा 6 ए) पर क्लिक करें।
      8. एक बार पूरा हो जाने पर, Exit AutoCount पर क्लिक करें।
  3. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक में गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) करें।
    1. स्विचबोर्ड पेज पर, Quality Control > Add plate(s) पर क्लिक करें। गिना प्लेट आयात करने के लिए पूरे फ़ोल्डर टिक करें, चयन > प्रारंभ QC (अनुपूरक चित्रा 6B) पर क्लिक करें.
    2. स्पॉट ऑडिट करने के लिए प्रत्येक कुएं पर डबल-क्लिक करें। किसी भी धब्बे को हटाने के लिए गिनती पर क्लिक करें. सॉफ्टवेयर गिनती शुरू कर देगा।
      नोट: सुनिश्चित करें कि "स्पॉट: निकालें" पर टिक किया गया है। गिनती के पूरा होने foci की गिनती संख्या से संकेत किया जा सकता है, उदाहरण के लिए "30" (अनुपूरक चित्रा 7 ए).
    3. एक बार गिनती समाप्त हो जाने के बाद (foci की गिनती संख्या द्वारा इंगित, उदाहरण के लिए "30"), स्पॉट (अनुपूरक चित्रा 7B) को हटाने के लिए "हां" पर क्लिक करें। हटाए जाने वाले स्थान पर ट्रिपल लेफ्ट-क्लिक करें। समाप्त करने के लिए राइट-क्लिक करें, फिर हाँ पर क्लिक करें।
    4. फिनिश प्लेट पर क्लिक करें और क्यूसी पूरा होने के बाद प्रोजेक्ट ओवरव्यू पर जाएं ।
  4. सॉफ्टवेयर विश्लेषक का उपयोग करके इमेजिंग करें।
    1. स्कैन की गई, गिने जाने वाली और क्यूसी प्लेट छवि (चित्र 2) की जाँच करें।

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Representative Results

ZIKV को FFA का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 3 में योजनाबद्ध रूप से उल्लिखित है। 24 अच्छी तरह से थाली के लिए, संक्रमित वेरो कोशिकाओं 48 एच, 60 एच, 72 एच, 84 एच, और 96 घंटे के बाद संक्रमण पर तय किए गए थे. परिणामों से पता चला है कि कोशिकाएं 96 घंटे (4 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 4 और पूरक चित्रा 8 ए-ई) के बाद बरकरार रहीं (कोई सेल टुकड़ी नहीं देखी गई थी)। वायरस foci की उपस्थिति पहली बार 48 घंटे (2 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 4A-F) में मनाया गया था. हालांकि, foci का आकार बहुत छोटा था, जिससे foci को सटीक रूप से गिनना मुश्किल हो गया। इष्टतम foci आकार 60 घंटे (2.5 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 4B) पर हासिल किया गया था. बाद के समय बिंदुओं (72 एच, 84 एच, और 96 एच पोस्ट-संक्रमण) में, foci बड़े थे और विलय या ओवरलैप करने के लिए प्रवृत्त थे। विलय या अतिव्यापी foci समय के साथ वृद्धि हुई (चित्रा 4C-E). इसलिए, संक्रमण के बाद 60 घंटे (2.5 दिन) में गठित foci को 24-अच्छी प्लेट (चित्रा 4B) में ZIKV टिटर निर्धारित करने के लिए चुना गया था।

96-अच्छी प्लेट के लिए, संक्रमित वेरो कोशिकाओं को 24 एच, 36 एच, 48 एच, 60 एच और 72 एच पोस्ट-संक्रमण पर तय किया गया था। परिणामों से पता चला है कि कोशिकाओं 72 घंटे (3 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 5 ए-एफ और पूरक चित्रा 9 ए-ई) के बाद बरकरार रहे. वायरस foci की उपस्थिति पहली बार 24 घंटे (1 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 5A) में मनाया गया था. हालांकि, संक्रमण के बाद 36 घंटे (1.5 दिन) तक foci का आकार बहुत छोटा था, जिससे foci की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करना मुश्किल हो गया (चित्र 5A,B)। इष्टतम foci आकार 48 घंटे (2 दिन) के बाद संक्रमण (चित्रा 5C) पर हासिल किया गया था. बाद के समय बिंदुओं (60 घंटे और 72 घंटे के बाद संक्रमण) पर, ओवरलैप या विलय किए गए फ़ॉसी देखे गए, और समय के साथ अतिव्यापी फ़ॉसी की संख्या में वृद्धि हुई(चित्रा 5डी, ई)। इसलिए, संक्रमण के बाद 48 घंटे (2 दिन) में गठित foci को ZIKV आइसोलेट्स(चित्रा 5C)के वायरस टिटर को निर्धारित करने के लिए चुना गया था। विकल्प के रूप में वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक का उपयोग करके foci गठन की कल्पना और गणना की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: वेरो कोशिकाओं की सूक्ष्म छवि। (ए)40x आवर्धन में वेरो कोशिकाओं ने वायरस प्रसार के लिए 75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में 70% -90% संगम दिखाया। (बी) 100x आवर्धन पर संक्रमण के बाद दिन 1 पर ZIKV से संक्रमित होने के बाद वेरो कोशिकाओं पर CPE। (सी) 100x आवर्धन पर संक्रमण के बाद दिन 2 पर ZIKV से संक्रमित होने के बाद वेरो कोशिकाओं पर CPE। (डी) 100x आवर्धन पर संक्रमण के बाद दिन 3 पर ZIKV से संक्रमित होने के बाद वेरो कोशिकाओं पर CPE। (ई)40x बढ़ाई पर वेरो कोशिकाओं वायरस मात्रा का ठहराव के लिए इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद एक 24 अच्छी तरह से थाली में 70% -90% संगम से पता चला. स्केल बार: 100 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक का उपयोग कर स्कैन किया गया, गिना गया, और बाद की गुणवत्ता नियंत्रण प्लेट एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप की छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: foci बनाने परख के लिए धुंधला हो जाना के कार्यप्रवाह. सेल निर्धारण, permeabilization, अवरुद्ध, एंटीबॉडी बाइंडिंग, और peroxidase सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेशन सहित धुंधला प्रक्रियाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अलग-अलग समय बिंदुओं पर 24-अच्छी प्लेटों में ZIKV P6-740 के लिए Foci परख बनाना। (ए) संक्रमण के बाद 2 (48 घंटे) दिन में Foci कम अलग हैं। (बी) इष्टतम foci आकार दिन 2.5 (60 घंटे) के बाद संक्रमण पर देखा जा सकता है। (सीई) Foci दिन 3 (72 h), दिन 3.5 (84 h), और दिन 4 (96 h) पोस्ट-संक्रमण पर विलय हो गया है। (एफ) प्लेट का नकारात्मक नियंत्रण। स्केल बार: 1,000 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अलग-अलग समय बिंदुओं पर 96-अच्छी प्लेटों में ZIKV P6-740 के लिए Foci परख बनाना। (ए) Foci संक्रमण के बाद 1 (24 घंटे) पर वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर गिने जाने के लिए कम विशिष्ट हैं। (बी) Foci संक्रमण के बाद 1.5 (36 घंटे) दिन वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर गिने जाने के लिए कम अलग हैं। (सी) इष्टतम foci आकार संक्रमण के बाद 2 (48 घंटे) दिन पर देखा जा सकता है। (डी, ई) Foci दिन 2.5 (60 h) और दिन 3 (72 h) पोस्ट-संक्रमण पर विलय हो गया है। (एफ) प्लेट का नकारात्मक नियंत्रण। स्केल बार: 1,000 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर विश्लेषक के स्टार्टअप पृष्ठ के स्क्रीनशॉट। (ए) वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर किसी भी लागू एक के लिए सूट स्विच करें। एक बार हो जाने के बाद "ओके" पर क्लिक करें। (बी) वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर स्कैनिंग शुरू करने के लिए, "स्कैन" पर क्लिक करें और फिर "पूर्ण प्लेट स्कैन" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर "कैप्चर प्रारूप" और चयनित केंद्र मोड को "ऑटो प्रीलिग्नमेंट उपयोगकर्ता सत्यापित" के रूप में देखने के लिए स्क्रीनशॉट। (ए) कैप्चर प्रारूप देखने के लिए, "डैशबोर्ड" पर क्लिक करें और कैप्चर प्रारूप के रूप में 96-वेल प्रारूप का चयन करें। (बी) केंद्रित मोड के लिए, "ऑटो प्रीलिग्नमेंट उपयोगकर्ता सत्यापित" चुनें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक प्लेट रीडर ट्रे पर 96-अच्छी तरह से प्लेट प्लेसमेंट और कुओं A1, A12, और H1 के लिए पदों को जांचने के लिए एक स्क्रीनशॉट। (ए) शीर्ष पर पंक्ति ए के साथ प्लेट को ऊपर की ओर रखें। (बी) कुओं A1, A12, और H1 के लिए पदों को जांचने के लिए, "ऊपर, नीचे, बाएँ, दाएँ" बटन का उपयोग करें। एक बार हो जाने के बाद, "पुष्टि करें" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक पर गिनती के लिए स्कैन की गई प्लेटों वाले फ़ोल्डरों का चयन करने के लिए स्क्रीनशॉट और "5 का चरण 2: गिनती मापदंडों को परिभाषित करें"। (ए) स्कैन की गई प्लेटों की गणना करने के लिए, "लोड प्लेट" पर क्लिक करें। पूरे फ़ोल्डर पर टिक करें और स्कैन की गई प्लेटों को आयात करने के लिए "चयन करें" पर क्लिक करें। (बी) गिनती मापदंडों को समायोजित करें। पैरामीटर सेट होने के बाद "अगला" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक के स्क्रीनशॉट "5 का चरण 3: कुओं का चयन / अचयनित करें" और "5 का चरण 4: आउटपुट सेटिंग्स"। (ए) गिने जाने वाले कुओं का चयन करें और अचयनित करें और एक बार किए जाने पर "अगला" पर क्लिक करें। (बी) आउटपुट सेटिंग्स के लिए, सेटिंग्स उपयुक्त हैं या नहीं (जैसे, छवि प्रारूप) की जांच करने के लिए "आउटपुट सेटिंग्स देखें/संशोधित करें" पर क्लिक करें। एक बार हो जाने के बाद "सहेजें और बाहर निकलें" पर क्लिक करें और फिर "अगला" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 6: वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर विश्लेषक "5 का चरण 5: ऑटोकाउंट प्रारंभ करें" और गुणवत्ता नियंत्रण पृष्ठ के स्क्रीनशॉट। (ए) प्लेट गिनती के लिए तैयार होने के बाद, "ऑटोकाउंट प्रारंभ करें" पर क्लिक करें। (बी) गुणवत्ता नियंत्रण पृष्ठ पर, गिने गए प्लेट को आयात करने के लिए पूरे फ़ोल्डर पर टिक करें, "चयन करें" पर क्लिक करें, फिर "क्यूसी प्रारंभ करें" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 7: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विश्लेषक गुणवत्ता नियंत्रण पृष्ठ के स्क्रीनशॉट। (ए) ऑडिट स्पॉट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से डबल-क्लिक करें। किसी भी स्थान को हटाने के लिए "गणना" पर क्लिक करें। टिक "स्पॉट: निकालें"। (बी) स्पॉट को हटाने के लिए ट्रिपल बायाँ-क्लिक करें। समाप्त करने के लिए राइट क्लिक करें, फिर "हां" पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 8: अलग-अलग समय बिंदुओं पर 24-अच्छी प्लेटों में ZIKV P6-740 के लिए परख बनाने वाली Foci। ZIKV P6-740 पर दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने (10-1 से 10-5) का प्रदर्शन किया गया था और नकारात्मक नियंत्रण सहित दो प्रतियों में वेरो कोशिकाओं पर संक्रमण किया गया था। एक कच्चे डेटा छवि 1,000 माइक्रोन का संकेत स्केल पट्टी के साथ, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था. (ए) दिन 2 (48 घंटे) संक्रमण के बाद. (बी) दिन 2.5 (60 घंटे) संक्रमण के बाद। (सी) दिन 3 (72 घंटे) संक्रमण के बाद। (डी) दिन 3.5 (84 एच) संक्रमण के बाद। (ई) दिन 4 (96 एच) संक्रमण के बाद। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 9: अलग-अलग समय बिंदुओं पर 96-अच्छी प्लेटों में ZIKV P6-740 के लिए Foci बनाने वाली परख बनाना। ZIKV P6-740 पर दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने (10-1 से 10-5) का प्रदर्शन किया गया था और नकारात्मक नियंत्रण सहित दो प्रतियों में वेरो कोशिकाओं पर संक्रमण किया गया था। एक कच्चे डेटा छवि 1,000 माइक्रोन का संकेत देने के पैमाने पट्टी के साथ, एक स्टीरियो खुर्दबीन का उपयोग कर लिया गया था. (ए) दिन 1 (24 घंटे) संक्रमण के बाद. (बी) दिन 1.5 (36 घंटे) संक्रमण के बाद। (सी) दिन 2 (48 घंटे) संक्रमण के बाद। (डी) दिन 2.5 (60 घंटे) संक्रमण के बाद। (ई) दिन 3 (72 एच) संक्रमण के बाद। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वायरस टिटर निर्धारित करने के लिए कई परख हैं; पीएफए में एफएफए के समान वायरस क्वांटिटेशन प्रोटोकॉल है, जिसमें वायरस इनोकुलम को अलग-अलग सजीले टुकड़े या foci को प्रतिष्ठित करने की अनुमति देने के लिए पतला किया जाता है। धुंधला होने के बाद, प्रत्येक पट्टिका या foci inoculum19 में एक एकल संक्रामक कण इंगित करता है. पीएफए क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग है सेल लसीका या मौत के कारण पट्टिका गठन कल्पना करने के लिए. इसलिए, पीएफए अधिक समय लेने वाला है, क्योंकि वायरस को सीपीई का कारण बनने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, और यह केवल उन वायरस तक ही सीमित है जो सेल लाइसिस या मृत्यु को प्रेरित करते हैं। कई प्रयोगशालाओं ने ZIKV 19,20,21,22,23,24,25 सहित फ्लेविवायरस के लिए संक्रामक वायरस टाइटर्स निर्धारित करने के लिए FFA का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। एफएफए एक सेल आधारित वर्णमिति immunodetection विधि है कि एंटीबॉडी के साथ वायरल प्रतिजन का पता लगाता है और इसलिए, immunostaining तकनीक का उपयोग संक्रमित कोशिकाओं के foci क्षेत्रों की पहचान करता है, लेकिन सजीले टुकड़े12,26 नहीं. एफएफए पीएफए पर जेडआईकेवी के लिए कुछ फायदे प्रदान करता है। एक स्पष्ट लाभ यह है कि यह स्पष्ट सीपीई के बिना वायरल घटकों की एंटीबॉडी मान्यता पर आधारित है। इसके अलावा, वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग मिश्रित आबादी27 में विभिन्न वायरस या वायरल सीरोटाइप की पहचान करने में भी उपयोगी है। इसलिए, एफएफए पीएफए की तुलना में अधिक विशिष्ट है क्योंकि यह सभी वायरस संक्रमणों को मापता है और वायरस पर निर्भर नहीं है जो एक दृश्य पट्टिका28 बनाने के लिए पर्याप्त कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। एफएफए में पीएफए की तुलना में कम इनक्यूबेशन अवधि भी होती है, जिसके लिए एक स्पष्ट सीपीई की आवश्यकता होती है जो सेल लसीका और मृत्यु को दर्शाता है। अंत में, एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर, एफएफए विधि का पता लगाने और वायरस27,29 अनुमापन करने के लिए अधिक प्रतिकृति और बड़ा dilutions का उपयोग करने का लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, रिपोर्ट किए गए एफएफए परख को वायरस न्यूट्रलाइजेशन परीक्षणों और एंटीवायरल यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के तरीकों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। वाणिज्यिक या मुक्त स्वचालित सेल गिनती उपकरणों या सॉफ्टवेयर को शामिल करने से एफएफए और इसके संबंधित तरीकों की उपयोगिता (स्थिरता, सटीकता, थ्रूपुट) में सुधार हो सकता है।

जब 96 अच्छी तरह से थाली के लिए 24 अच्छी तरह से थाली की तुलना, यह 24 अच्छी तरह से प्रारूप monolayer संस्कृतियों में उगाया जा करने के लिए कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है, साथ ही मीडिया और वायरस स्टॉक की बड़ी मात्रा में की आवश्यकता है कि ध्यान रखना महत्वपूर्ण है. नतीजतन, 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप सीमित मात्रा वाले नमूनों के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। इस सीमा को 96-वेल प्रारूप का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, जैसा कि इस पत्र में वर्णित है। सबसे पहले, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में कम सामग्री की आवश्यकता होती है, जिससे यह अधिक लागत प्रभावी विकल्प बन जाता है। इसके अतिरिक्त, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में सना हुआ वायरस foci की स्वचालित गिनती उच्च थ्रूपुट और तेजी से विश्लेषण की अनुमति देती है, जो 24-अच्छी तरह से प्रारूप में संभव नहीं है, जिसके लिए मैन्युअल गिनती की आवश्यकता होती है। यह स्वचालित गिनती प्रक्रिया प्रजनन क्षमता को भी बढ़ाती है और मैन्युअल गिनती की तुलना में व्यक्तिपरकता को कम करती है, जिससे एफएफए के अधिक सटीक और विश्वसनीय परिणाम मिलते हैं। इसलिए, स्वचालित इमेजिंग सिस्टम के साथ 96 अच्छी तरह से प्रारूप अत्यधिक प्रयोगशालाओं है कि उच्च throughput और विश्वसनीय वायरस मात्रा का ठहराव की आवश्यकता होती है के लिए सिफारिश की है.

दूसरी ओर, कुछ लोग ZIKV 25,27,28,30,31 का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट फोकस परख का उपयोग करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकस परख एफएफए को समानांतर करता है, सिवाय इसके कि यह फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एंटीजन को इम्यूनोस्टेनिंग करके किया जाता है, इसके बाद एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप25 के तहत संक्रमण foci की गिनती होती है। इस परख अधिक महंगा अभिकर्मकों का उपयोग करता है और परख को पूरा करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की जरूरत है. इसलिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकस परख बेहतर सुसज्जित प्रयोगशालाओं तक सीमित है, जैसे कि रेफरल प्रयोगशालाएं। संसाधन-चुनौतीपूर्ण सेटिंग में इस परख का उपयोग करना आसान नहीं है।

हालांकि एफएफए के कई फायदे हैं, लेकिन इसकी कुछ सीमाएं भी हैं। पीएफए जैसे अन्य परखों की तुलना में, एफएफए में धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान अधिक कदम शामिल हैं। जबकि निर्धारण के बाद के चरण लचीले होते हैं और रात भर या लंबे समय तक विराम की अनुमति देते हैं, foci के धुंधला होने में अभी भी पूरा होने में अधिक समय लगता है। इसके अलावा, एफएफए को धुंधला प्रक्रिया में विशिष्ट या क्रॉस-रिएक्शन एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, जो नए या उपन्यास वायरस की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए इसकी प्रयोज्यता को सीमित करता है। इसके अलावा, पीएफए की तुलना में एफएफए की लागत अधिक है, जिसे धुंधला होने के लिए केवल क्रिस्टल वायलेट की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह ध्यान देने योग्य है कि स्वचालित गिनती प्रक्रिया (96-अच्छी तरह से प्रारूप) केवल उपयुक्त उपकरणों के साथ एक प्रयोगशाला में की जा सकती है; इसलिए, यह आवश्यक उपकरणों के बिना प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त नहीं होगा।

अंत में, हम सेल आधारित वर्णमिति immunodetection परख या 24 अच्छी तरह से थाली और 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों में एफएफए का उपयोग ZIKV के प्रचार और मात्रा का ठहराव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल रिपोर्ट. विधि शास्त्रीय पीएफए पर व्यावहारिक लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. यह उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए तेज़ और उत्तरदायी है जब foci गिनती के लिए एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम के साथ लागू किया जाता है। इस अध्ययन के लिए विश्वसनीय प्रोटोकॉल का मानकीकरण जीका अनुसंधान में बहुत योगदान देगा और अन्य नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण वायरस को निर्धारित करने के लिए मोटे तौर पर अनुकूलित भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को दीर्घकालिक अनुसंधान अनुदान योजना (LRGS MRUN चरण 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) के तहत उच्च शिक्षा मंत्रालय मलेशिया से समर्थन प्राप्त हुआ और उच्च संस्थान उत्कृष्टता केंद्र (HICoE) कार्यक्रम (MO002-2019) के लिए वित्त पोषण हुआ। इस अध्ययन में चित्रा 3 जो foci बनाने की परख के लिए धुंधला होने के वर्कफ़्लो को दिखाता है, BioRender.com (2022) द्वारा "डीएबी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री" से अनुकूलित किया गया है। https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry से लिया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

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