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Immunology and Infection

Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Il presente protocollo descrive la propagazione del virus Zika (ZIKV) in cellule renali di scimmia verde africana Vero e la quantificazione di ZIKV utilizzando metodi di immunorilevazione colorimetrica basati su cellule nei formati a 24 e 96 pozzetti (high throughput).

Abstract

Il virus Zika (ZIKV) è un virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus. L'infezione da ZIKV è stata associata ad anomalie cerebrali congenite e potenzialmente alla sindrome di Guillain-Barré negli adulti. La ricerca su ZIKV per comprendere i meccanismi della malattia è importante per facilitare lo sviluppo di vaccini e trattamenti. Il metodo di quantificazione dei virus è cruciale e fondamentale nel campo della virologia. Il focus forming assay (FFA) è un test di quantificazione del virus che rileva l'antigene virale con gli anticorpi e identifica i focolai di infezione delle cellule utilizzando la tecnica di immunocolorazione della perossidasi. L'attuale studio descrive il protocollo di propagazione e quantificazione del virus utilizzando sia i formati a 24 pozzetti che a 96 pozzetti (high throughput). Rispetto ad altri studi simili, questo protocollo ha ulteriormente descritto l'ottimizzazione delle dimensioni dei focolai, che può servire come guida per espandere l'uso di questo test per altri virus. In primo luogo, la propagazione di ZIKV viene eseguita in cellule Vero per 3 giorni. Il surnatante di coltura contenente ZIKV viene raccolto e quantificato utilizzando l'FFA. In breve, la coltura virale viene inoculata su cellule Vero e incubata per 2-3 giorni. La formazione di focolai viene quindi determinata dopo processi di colorazione ottimizzati, tra cui la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l'incubazione con substrato di perossidasi. I focolai virali colorati vengono visualizzati utilizzando uno stereomicroscopio (conteggio manuale in formato a 24 pozzetti) o un analizzatore software (conteggio automatizzato in formato a 96 pozzetti). L'FFA fornisce risultati riproducibili e relativamente rapidi (3-4 giorni) ed è adatto per essere utilizzato per diversi virus, compresi quelli che non formano placca. Successivamente, questo protocollo è utile per lo studio dell'infezione da ZIKV e potrebbe essere utilizzato per rilevare altri virus clinicamente importanti.

Introduction

L'infezione da virus Zika (ZIKV) è una malattia virale emergente trasmessa dalle zanzare. Il primo isolamento di ZIKV avvenne in Uganda nel 1947 1,2; È rimasta trascurata dal 1947 al 2007, poiché i sintomi clinici sono più comunemente asintomatici e caratterizzati da malattia febbrile autolimitante. Nel 2007, l'epidemia di Zika è iniziata nelle isole Yap 3,4, seguita da epidemie più grandi nelle regioni del Pacifico (Polinesia francese, Isola di Pasqua, Isole Cook e Nuova Caledonia) dal 2013 al 2014 5,6,7,8, dove la grave complicanza neurologica sindrome di Guillain-Barré (GBS) è stata segnalata per la prima volta negli adulti 9. Tra il 2015 e il 2016, la prima epidemia diffusa di ZIKV si è diffusa nelle Americhe dopo l'emergere del genotipo asiatico di ZIKV in Brasile già nel 201310. Durante questa epidemia, sono stati segnalati da 440.000 a 1,3 milioni di casi di microcefalia e altri disturbi neurologici nei neonati. Attualmente non esiste una cura o un trattamento specifico per l'infezione da ZIKV; quindi, c'è un urgente bisogno medico di vaccini ZIKV in grado di prevenire le infezioni, in particolare durante la gravidanza.

La quantificazione dei virus è un processo per determinare il numero di virus presenti in un campione. Svolge un ruolo importante nella ricerca e i laboratori accademici coinvolgono molti campi, come la medicina e le scienze della vita. Questo processo è importante anche in settori commerciali, come la produzione di vaccini virali, proteine ricombinanti, antigeni virali o agenti antivirali. Per la quantificazione dei virus possono essere utilizzati molti metodi o saggi12. La scelta dei metodi o dei saggi dipende normalmente dalle caratteristiche del virus, dal livello di accuratezza desiderato e dalla natura dell'esperimento o della ricerca. In generale, i metodi di quantificazione dei virus possono essere suddivisi in due categorie: saggi molecolari che rilevano la presenza di acido nucleico virale (DNA o RNA) e saggi che misurano l'infettività del virus in vitro12. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR, per il DNA) o la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR, per l'RNA)13 e la PCR a goccia digitale14 sono esempi di tecniche molecolari comuni utilizzate per quantificare l'acido nucleico virale in un dato campione15. Tuttavia, queste tecniche molecolari altamente sensibili non sono in grado di distinguere tra virus vitali e non vitali15. Pertanto, le ricerche che richiedono informazioni sulle caratteristiche biologiche, come l'infettività del virus sulle cellule, non possono essere completate utilizzando le tecniche molecolari sopra menzionate; Sono necessari saggi in grado di misurare e determinare la presenza di virus vitali. I saggi che misurano l'infettività del virus includono il test di formazione della placca (PFA), la dose infettiva di coltura tissutale al 50% (TCID50), il test di focalizzazione fluorescente e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)12.

Il PFA, sviluppato da Renato Dulbecco nel 1952, è uno dei metodi più comunemente utilizzati per la titolazione del virus, anche per ZIKV16. Viene utilizzato per determinare direttamente le concentrazioni virali per i virioni litici infettivi. Il metodo si basa sulla capacità di un virus litico di produrre effetti citopatici (CPE; zone di morte cellulare o placche, un'area di infezione circondata da cellule non infette) in un monostrato di cellule inoculate dopo l'infezione virale. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti nel test che ne influenzano l'utilità. Il test richiede molto tempo (richiede circa 7-10 giorni, a seconda dei virus), dipende da CPE ed è soggetto a errori. Nel presente studio, riportiamo una tecnica immunocolorimetrica, il test di formazione del fuoco (FFA), per rilevare e quantificare ZIKV in formati di piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti.

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Protocol

1. Propagazione del virus

  1. Preparazione delle cellule
    1. Coltivare le cellule Vero in un matraccio da75 cm contenente 12 mL di terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 2 mM di L-glutammina (vedi Tabella dei materiali). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
    2. Monitorare le cellule al microscopio; una volta che le celle raggiungono il 70%-90% di confluenza, sono pronte per essere utilizzate (Figura 1A).
      NOTA: Le celle Vero raddoppiano ogni 24 h17 circa. Le diluizioni di 1:10 dovrebbero richiedere da 3 a 4 giorni per raggiungere l'80%-90% di confluenza in un pallone da75 cm 2 . Monitora le cellule ogni giorno o a giorni alterni.
  2. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio di coltura cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Sciacquare il matraccio con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS) di Dulbecco 2 volte utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
      NOTA: Un becher con ipoclorito di sodio al 10% deve essere preparato per disinfettare eventuali rifiuti liquidi infettivi scartati da palloni/piastre.
    2. Aggiungere 2 mL di DMEM esente da siero (DMEM integrato con 2 mM di L-glutammina senza FBS) e 20 μL di inoculo ZIKV nel pallone di coltura cellulare. Incubare il matraccio con una leggera oscillazione per 1 ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento del virus.
      NOTA: La titolazione del grezzo iniziale di ZIKV sarà utile per determinare il volume dell'aggiunta dell'inoculo di ZIKV (fase 2).
      ATTENZIONE: ZIKV è classificato come patogeno di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Tutte le procedure con materiali contenenti ZIKV devono essere condotte in una cabina di biosicurezza certificata e seguire tutte le procedure operative standard di laboratorio (SOP) con adeguati dispositivi di protezione individuale.
  3. Aggiunta del supporto di sovrapposizione
    1. Dopo l'incubazione di 1 ora, rimuovere ed eliminare l'inoculo virale diluito utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml. Sciacquare il pallone di coltura cellulare con 3 mL di dPBS 2x.
    2. Aggiungere 12 mL di terreno di mantenimento (DMEM integrato con FBS al 2%, L-glutammina 2 mM e penicillina-streptomicina 100 U/mL) nel pallone di coltura cellulare per mantenere le cellule infette.
    3. Incubare le cellule Vero infette per 3 giorni in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Monitorare quotidianamente la CPE delle cellule Vero infette al microscopio.
  4. Raccolta del surnatante per colture cellulari contenente ZIKV
    1. Il giorno 3 dopo l'infezione, si può osservare l'arrotondamento e il distacco delle cellule (CPE) (Figura 1B-D). Prelevare il surnatante della coltura cellulare contenente lo ZIKV in una provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
    2. Utilizzare un filtro per siringa in polietersulfone da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali) per filtrare il surnatante della coltura cellulare. Aliquotare 500 μL del surnatante filtrato per colture cellulari in provette con tappo a vite da 2,0 mL e conservare a -80 °C fino al successivo utilizzo.
      NOTA: Lo ZIKV raccolto può essere conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
      ATTENZIONE: Se si utilizza un ago per siringa, è necessario prendere ulteriori precauzioni, poiché l'ago può perforare la pelle. È necessario stabilire le SOP di laboratorio.

2. Quantificazione del virus

  1. Preparazione delle cellule
    1. Seminare le cellule Vero in apposite piastre (piastra a 24 pozzetti: 0,5 ml/pozzetto, 7,5 x 104 cellule/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,1 ml/pozzetto, 1,5 x 104 cellule/pozzetto) e incubare la piastra per una notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Ci sono cinque diversi punti temporali da testare (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore post-infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione); Pertanto, prepara un piatto per ogni punto temporale.
    2. Dopo l'incubazione di 24 ore e una volta che le cellule raggiungono il 70%-90% di confluenza (Figura 1E), la piastra è pronta per l'infezione. Procedere alla preparazione del brodo virale diluito (fase 2.2) prima dell'infezione del monostrato cellulare.
  2. Diluizione del virus
    1. Per le piastre da 24 e 96 pozzetti, preparare sei provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL per ciascuna piastra per effettuare una diluizione decuplicata (da 10-1 a 10-5), incluso un controllo negativo. Per la configurazione dell'esperimento per una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 450 μL di DMEM privo di siero in tutte e sei le provette per microcentrifuga. Per la configurazione dell'esperimento per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 135 μL di DMEM privo di siero in sei provette.
      NOTA: Etichettare chiaramente ogni provetta per indicare la diluizione del suo contenuto prima di eseguire la diluizione seriale decuplicata.
    2. Per eseguire la diluizione seriale, per la configurazione dell'esperimento su piastra a 24 pozzetti, aggiungere 50 μL di ZIKV raccolto dalla fase 1 nella provetta 10-1 che contiene 450 μL di DMEM privo di siero. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 96 pozzetti, aggiungere 15 μL di ZIKV nella provetta 10-1 che contiene 135 μL di DMEM privo di siero.
    3. Vorticare ogni provetta per mescolare il virus e il mezzo. Questa è la prima diluizione decuplicata.
      NOTA: Per garantire un'accurata diluizione seriale, è necessaria una corretta miscelazione del virus e del terreno di coltura in ciascuna provetta di diluizione.
    4. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 24 pozzetti, utilizzare un puntale di pipetta nuovo per risospendere la provetta 10-1 e trasferire 50 μL di ZIKV diluito nella provetta 10-2 come seconda diluizione decuplicata. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 96 pozzetti, utilizzare un puntale di pipetta nuovo per risospendere la provetta da 10-1 e trasferire 15 μL di ZIKV diluito nella provetta da 10-2 come seconda diluizione decuplicata.
    5. Ripetere il passaggio 2.2.4 quattro volte fino alla quinta provetta (escludere il controllo negativo).
      NOTA: Utilizzare un puntale per pipette nuovo dopo ogni fase di pipettaggio per evitare la contaminazione incrociata.
  3. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere ed eliminare il terreno condizionato da ciascun pozzetto (piastra a 24 pozzetti: 0,5 ml/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,1 ml/pozzetto).
    2. Risciacquare ogni pozzetto con dPBS 2x (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto).
    3. Procedendo dalla diluizione più alta a quella più bassa, aggiungere ciascun inoculo virale diluito in serie nel pozzetto (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto).
      NOTA: L'infezione di ciascuna diluizione verrà eseguita in pozzetti duplicati. Mantenere due pozzetti non infetti come controllo negativo. Etichettare chiaramente la piastra e i pozzetti per evitare confusione. Sostituire i puntali delle pipette dopo ogni fase di pipettaggio per evitare la contaminazione incrociata.
    4. Incubare la piastra con un leggero dondolio per 1 ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento del virus.
  4. Aggiunta del terreno di coltura cellulare di copertura
    1. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dalla concentrazione più bassa a quella più alta.
    2. Lavare le cellule infette con dPBS 2x (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto).
    3. Sovrapporre il pozzetto con DMEM (integrato con FBS al 2%, L-glutammina 2 mM e penicillina-streptomicina 100 U/mL) e carbossimetilcellulosa a bassa viscosità all'1,5% (CMC; vedere la tabella dei materiali) (piastra a 24 pozzetti: 1 ml/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,2 ml/pozzetto).
    4. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Non disturbare la piastra durante questo periodo di incubazione.
    5. Estrarre la piastra dall'incubatore per colture cellulari per la colorazione in diversi momenti (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione).

3. Colorazione

  1. Fissazione cellulare
    1. Dopo le ore specifiche di incubazione (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione), rimuovere ed eliminare il terreno di rivestimento e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS. Per la piastra a 96 pozzetti, rimuovere ed eliminare il mezzo di sovrapposizione e lavare le cellule 3 volte con 60 μL/pozzetto di 1 PBS con una pipetta multicanale.
    2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è una formaldeide polimerizzata solida. È una polvere cristallina bianca, solida e infiammabile che rilascia gas formaldeide quando viene miscelata con acqua o riscaldata. Tutte le procedure che prevedono l'uso di paraformaldeide devono essere condotte in una cappa chimica certificata o in involucri esaustivi approvati secondo le SOP di laboratorio specifiche per le sostanze chimiche contenenti formaldeide.
    3. Dopo 20 minuti, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule 3 volte con 1 PBS. Eseguire la permeabilizzazione, il blocco e l'incubazione degli anticorpi seguendo i passaggi 3.2-3.5.
      NOTA: Quando si smaltisce la paraformaldeide al 4%, seguire la procedura di smaltimento dei rifiuti dell'università o dell'istituto.
  2. Permeabilizzazione cellulare
    1. Aggiungere l'1% di ottilfenossia poli(etilenossi)etanolo (vedere Tabella dei materiali) per permeabilizzare le cellule (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Dopo 15 minuti, scartare l'ottilfenossia poli(etilenossi)etanolo e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  3. Inceppamento
    1. Aggiungere il 3% di latte scremato per ridurre il legame non specifico nel campione (piastra a 24 pozzetti: 500 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 100 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore.
    2. Dopo 2 ore, scartare il latte scremato al 3% e lavare le cellule 3 volte con 1 PBS.
      NOTA: Questo è un punto di arresto. Dopo l'aggiunta del 3% di latte scremato, le piastre possono essere conservate a 4 °C fino a 2 giorni prima dell'inserimento degli anticorpi primari.
  4. Incubazione di anticorpi primari
    1. Aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-flavivirus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15; anticorpo primario, vedere la tabella dei materiali) diluito in latte scremato all'1% (rapporto 1:1.000) (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C per 1 h.
    2. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione contenente l'anticorpo monoclonale e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  5. Incubazione secondaria degli anticorpi
    1. Aggiungere l'anticorpo secondario IgG di capra anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (vedere Tabella dei materiali) diluito in latte scremato all'1% (rapporto 1:1.000) (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare le piastre a 37 °C per 1 h.
    2. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione contenente l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  6. Incubazione del substrato
    1. Aggiungere il substrato di perossidasi 3,3'diaminobenzidina (DAB) (vedere la tabella dei materiali) e incubare la piastra per 30 minuti al buio (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Dopo 30 minuti, interrompere la reazione lavando i pozzetti con acqua.
    2. Asciugare le piastre all'aria durante la notte e procedere all'enumerazione dei focolai dopo che le piastre sono completamente asciutte.

4. Determinazione del titolo virale

  1. Processo di conteggio manuale dei focolai (formato a 24 pozzetti)
    1. I fuochi possono essere visualizzati al microscopio stereoscopico. Selezionare la diluizione che produce 50-200 fuochi.
    2. Contare i fuochi per ogni replica della diluizione selezionata. Calcolare il numero medio di focolai per ciascuna delle diluizioni selezionate.
    3. Calcolare l'unità formante focolai per mL (FFU/mL) per ciascun campione con la formula seguente: FFU/mL = numero medio di focolai contati/(diluizione x volume di virus diluito aggiunto).
  2. Processo automatizzato di conteggio dei focolai (formato a 96 pozzetti)
    1. Eseguire la scansione della piastra a 96 pozzetti su un analizzatore software commerciale.
      1. Fare doppio clic sul software (vedere la tabella dei materiali) per aprirlo.
      2. Fare clic su Switch Suites (Cambia suite) e assicurarsi che la suite sia passata a quella applicabile (Figura 1A supplementare). Fare clic su OK.
      3. Iniziare la scansione facendo clic su Scansione > Scansione dell'intera lastra (Figura 1B supplementare).
      4. Fare clic su Dashboard per assicurarsi che il formato di acquisizione sia il formato a 96 pozzetti (Figura 2A supplementare).
      5. Selezionare la modalità di centraggio come "Preallineamento automatico verificato dall'utente" (Figura 2B supplementare).
      6. Fare clic su Espelli per caricare la piastra.
        NOTA: Aprire il coperchio della piastra e posizionarla verso l'alto con la fila A in alto (Figura supplementare 3A).
      7. Immettere il nome della targa e fare clic su OK. Fare clic su Carica per caricare la piastra.
      8. Fare clic su Avvia per avviare la scansione. Successivamente, calibrare le posizioni per A1, A12 e H1 utilizzando i pulsanti "Su, Giù, Sinistra, Destra" e fare clic su Conferma (Figura supplementare 3B).
        NOTA: Il software inizierà la scansione di ogni pozzetto.
      9. Una volta completata la scansione, verrà visualizzata un'immagine panoramica. Fare clic su Chiudi.
      10. Esci dalla scansione facendo clic su Torna al centralino.
    2. Contare la piastra a 96 pozzetti utilizzando il software.
      1. Fare clic su Conteggio > Conteggio intelligente.
      2. Sul software, mostrerà "Passaggio 1 di 5: selezionare le piastre da contare". Fare clic su Caricare piastra/e. Spuntare l'intera cartella e fare clic su Seleziona per importare la lastra scansionata (Figura supplementare 4A).
      3. Sul software, mostrerà "Passaggio 2 di 5: definire i parametri di conteggio". Fare clic su Regola parametri e verranno visualizzati i parametri (processo diffuso; piccolo/normale/grande/più grande/più grande +1; separazione spot; area contata; bilanciamento dello sfondo; rimozione delle fibre; gating).
        NOTA: Iniziare con un pozzetto e controllare avanti e indietro per trovare le impostazioni migliori per tutti i pozzetti.
      4. Al termine, fare clic su Avanti (Figura 4B supplementare).
      5. Sul software, mostrerà "Passaggio 3 di 5: seleziona/deseleziona i pozzetti". Una volta completata la selezione del pozzetto da contare, cliccare su Avanti per procedere.
        NOTA: I pozzetti selezionati per il conteggio appariranno con una "C" nell'angolo in alto a destra di ciascun pozzetto (Figura supplementare 5A).
      6. Sul software, mostrerà "Passaggio 4 di 5: Impostazioni di output". Fare clic su Visualizza/Modifica impostazioni di output per verificare se le impostazioni (come il formato immagine) sono adatte. Fare clic su Salva ed esci > Avanti (Figura 5B supplementare).
      7. Sul software, mostrerà "Passaggio 5 di 5: avvia il conteggio automatico". Fare clic su Avvia conteggio automatico (Figura supplementare 6A).
      8. Una volta completato, fai clic su Esci dal conteggio automatico.
  3. Eseguire il controllo di qualità (QC) nell'analizzatore di software commerciale.
    1. Nella pagina del centralino, fare clic su Controllo qualità > Aggiungi piastra. Spuntare l'intera cartella per importare la piastra contata, fare clic su Seleziona > Avvia CQ (Figura 6B supplementare).
    2. Fare doppio clic su ciascun pozzetto per controllare i punti. Fare clic su Conteggio per rimuovere eventuali macchie. Il software inizierà a contare.
      NOTA: Assicurarsi che l'opzione "Macchie: Rimuovi" sia selezionata. Il completamento del conteggio può essere indicato dal numero contato di fuochi, ad esempio "30" (Figura supplementare 7A).
    3. Una volta terminato il conteggio (indicato dal numero contato di fuochi, ad esempio "30"), fare clic su "Sì" per rimuovere le macchie (Figura supplementare 7B). Fare triplo clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto da rimuovere. Fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare, quindi fare clic su Sì.
    4. Fare clic su Finish Plate e andare alla panoramica del progetto una volta completato il controllo qualità.
  4. Eseguire l'imaging utilizzando l'analizzatore software.
    1. Controllare l'immagine della piastra scansionata, conteggiata e QC (Figura 2).

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Representative Results

Lo ZIKV può essere quantificato utilizzando l'FFA, come illustrato schematicamente nella Figura 3. Per la piastra a 24 pozzetti, le cellule Vero infette sono state fissate a 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione. I risultati hanno mostrato che le cellule sono rimaste intatte (non è stato osservato alcun distacco cellulare) dopo 96 ore (4 giorni) dall'infezione (Figura 4 e Figura 8A-E supplementare). La comparsa di focolai virali è stata osservata per la prima volta a 48 ore (2 giorni) dopo l'infezione (Figura 4A-F). Tuttavia, la dimensione dei fuochi era troppo piccola, rendendo difficile contare i fuochi con precisione. La dimensione ottimale dei focolai è stata raggiunta a 60 ore (2,5 giorni) dopo l'infezione (Figura 4B). Negli ultimi momenti (72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione), i focolai erano più grandi e tendevano a fondersi o sovrapporsi. I focolai fusi o sovrapposti sono aumentati nel tempo (Figura 4C-E). Pertanto, i focolai formatisi a 60 ore (2,5 giorni) dopo l'infezione sono stati scelti per determinare il titolo ZIKV in una piastra a 24 pozzetti (Figura 4B).

Per la piastra a 96 pozzetti, le cellule Vero infette sono state fissate a 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione. I risultati hanno mostrato che le cellule sono rimaste intatte dopo 72 ore (3 giorni) dall'infezione (Figura 5A-F e Figura 9A-E supplementare). La comparsa di focolai virali è stata osservata per la prima volta 24 ore (1 giorno) dopo l'infezione (Figura 5A). Tuttavia, la dimensione dei focolai era troppo piccola fino a 36 ore (1,5 giorni) dopo l'infezione, rendendo difficile determinare con precisione il numero di focolai (Figura 5A,B). La dimensione ottimale dei focolai è stata raggiunta a 48 ore (2 giorni) dopo l'infezione (Figura 5C). In questi ultimi momenti (60 ore e 72 ore dopo l'infezione), sono stati osservati focolai sovrapposti o fusi e il numero di focolai sovrapposti è aumentato nel tempo (Figura 5D,E). Pertanto, i focolai formatisi a 48 ore (2 giorni) dopo l'infezione sono stati scelti per determinare il titolo virale degli isolati ZIKV (Figura 5C). In alternativa, la formazione dei focolai può essere visualizzata ed enumerata utilizzando analizzatori software commerciali.

Figure 1
Figura 1: Immagine microscopica delle cellule Vero. (A) Le cellule Vero con ingrandimento 40x hanno mostrato una confluenza del 70%-90% in un pallone di coltura cellulareda 75 cm 2 per la propagazione del virus. (B) CPE su cellule Vero dopo essere state infettate da ZIKV il giorno 1 post-infezione con ingrandimento 100x. (C) CPE su cellule Vero dopo essere state infettate da ZIKV il giorno 2 post-infezione con ingrandimento 100x. (D) CPE su cellule Vero dopo essere state infettate da ZIKV il giorno 3 post-infezione con ingrandimento 100x. (E) Le cellule Vero con ingrandimento 40x hanno mostrato una confluenza del 70%-90% in una piastra a 24 pozzetti dopo 24 ore di incubazione per la quantificazione del virus. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine di una piastra di controllo post-qualità in formato 96 pozzetti scansionata, contata e post-qualità utilizzando un analizzatore software commerciale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Flusso di lavoro della colorazione per il saggio di formazione dei focolai. I processi di colorazione includono la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l'incubazione con substrato di perossidasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Saggio di formazione di focolai per ZIKV P6-740 in piastre a 24 pozzetti in diversi punti temporali. (A) I focolai sono meno distinti il giorno 2 (48 h) dopo l'infezione. (B) La dimensione ottimale dei focolai può essere osservata il giorno 2,5 (60 h) dopo l'infezione. (C-E) I focolai si sono fusi il giorno 3 (72 h), il giorno 3,5 (84 h) e il giorno 4 (96 h) dopo l'infezione. (F) Controllo negativo della targa. Barra graduata: 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Saggio di formazione di focolai per ZIKV P6-740 in piastre da 96 pozzetti in diversi punti temporali. (A) I focolai sono meno distinti per essere conteggiati sull'analizzatore software commerciale il giorno 1 (24 h) post-infezione. (B) I focolai sono meno distinti per essere conteggiati sull'analizzatore software commerciale il giorno 1,5 (36 h) dopo l'infezione. (C) La dimensione ottimale dei focolai può essere osservata il giorno 2 (48 h) dopo l'infezione. (D,E) I focolai si sono fusi il giorno 2,5 (60 ore) e il giorno 3 (72 ore) dopo l'infezione. (F) Controllo negativo della targa. Barra graduata: 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Screenshot della pagina di avvio dell'analizzatore software commerciale. (A) Passare la suite a una qualsiasi applicabile sull'analizzatore di software commerciale. Fare clic su "OK" una volta terminato. (B) Per avviare la scansione sull'analizzatore software commerciale, fare clic su "Scansione" e quindi su "Scansione lastra completa". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Schermate per visualizzare il "Formato di acquisizione" e la modalità di centraggio selezionata come "Preallineamento automatico verificato dall'utente" sull'analizzatore software commerciale. (A) Per visualizzare il formato di acquisizione, fare clic su "Dashboard" e selezionare il formato a 96 pozzetti come formato di acquisizione. (B) Per la modalità di centratura, selezionare "Preallineamento automatico verificato dall'utente". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 3 supplementare: Posizionamento della piastra a 96 pozzetti sul vassoio del lettore di piastre dell'analizzatore software commerciale e schermata per calibrare le posizioni per i pozzetti A1, A12 e H1. (A) Posizionare la piastra verso l'alto con la fila A in alto. (B) Per calibrare le posizioni dei pozzetti A1, A12 e H1, utilizzare i pulsanti "Su, Giù, Sinistra, Destra". Una volta terminato, fai clic su "Conferma". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 4 supplementare: Schermate per selezionare le cartelle contenenti le piastre scansionate per il conteggio sull'analizzatore software commerciale e "Passaggio 2 di 5: Definire i parametri di conteggio". (A) Per contare le piastre scansionate, fare clic su "Caricare piastra". Spuntare l'intera cartella e fare clic su "Seleziona" per importare le lastre scansionate. (B) Regolare i parametri di conteggio. Fare clic su "Avanti" una volta impostati i parametri. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 5 supplementare: Screenshot dell'analizzatore software commerciale "Passaggio 3 di 5: Selezionare/deselezionare i pozzetti" e "Passaggio 4 di 5: Impostazioni di output". (A) Selezionare e deselezionare i pozzetti da contare e fare clic su "Avanti" una volta terminato. (B) Per le impostazioni di output, fare clic su "Visualizza/Modifica impostazioni di output" per verificare se le impostazioni sono adatte (ad es. formato immagine). Al termine, fare clic su "Salva ed esci", quindi fare clic su "Avanti". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 6 supplementare: Screenshot dell'analizzatore software commerciale "Passaggio 5 di 5: Avvio di AutoCount" e della pagina di controllo qualità. (A) Una volta pronto per il conteggio delle piastre, fare clic su "Avvia conteggio automatico". (B) Nella pagina del controllo qualità, selezionare l'intera cartella per importare la piastra contata, fare clic su "Seleziona", quindi fare clic su "Avvia QC". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 7 supplementare: Screenshot della pagina di controllo della qualità dell'analizzatore software commerciale. (A) Fare doppio clic su ciascun pozzetto per controllare i punti. Fare clic su "Conteggio" per rimuovere qualsiasi punto. Spunta "Macchie: rimuovi". (B) Fare triplo clic con il pulsante sinistro del mouse per rimuovere le macchie. Fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare, quindi fare clic su "Sì". Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 8 supplementare: Saggio di formazione dei focolai per ZIKV P6-740 in piastre da 24 pozzetti in diversi punti temporali. Una diluizione seriale di dieci volte (da 10-1 a 10-5) è stata eseguita su ZIKV P6-740 e l'infezione è stata eseguita su cellule Vero in duplicato, incluso un controllo negativo. Un'immagine di dati grezzi è stata scattata utilizzando uno stereomicroscopio, con la barra della scala che indicava 1.000 μm. (A) Giorno 2 (48 ore) post-infezione. (B) Giorno 2,5 (60 h) dopo l'infezione. (C) Giorno 3 (72 h) post-infezione. (D) Giorno 3,5 (84 ore) post-infezione. (E) Giorno 4 (96 h) post-infezione. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 9 supplementare: Saggio di formazione di focolai per ZIKV P6-740 in piastre a 96 pozzetti in diversi punti temporali. Una diluizione seriale di dieci volte (da 10-1 a 10-5) è stata eseguita su ZIKV P6-740 e l'infezione è stata eseguita su cellule Vero in duplicato, incluso un controllo negativo. È stata scattata un'immagine di dati grezzi utilizzando uno stereomicroscopio, con la barra della scala che indicava 1.000 μm. (A) Giorno 1 (24 ore) dopo l'infezione. (B) Giorno 1,5 (36 h) dopo l'infezione. (C) Giorno 2 (48 h) post-infezione. (D) Giorno 2,5 (60 h) dopo l'infezione. (E) Giorno 3 (72 h) post-infezione. Fare clic qui per scaricare il file.

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Discussion

Esistono diversi test per determinare il titolo del virus; il PFA ha un protocollo di quantificazione del virus simile a quello dell'FFA, in cui l'inoculo virale viene diluito per consentire di distinguere le singole placche o focolai. Dopo la colorazione, ogni placca o focolai indica una singola particella infettiva nell'inoculo19. Il PFA è colorato con cristallo viola per visualizzare la formazione di placca causata dalla lisi o dalla morte cellulare. Quindi, il PFA richiede più tempo, in quanto richiede un tempo più lungo affinché il virus causi CPE ed è limitato solo ai virus che inducono la lisi o la morte cellulare. Molti laboratori hanno utilizzato con successo gli FFA per determinare i titoli dei virus infettivi per i flavivirus, tra cui ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. L'FFA è un metodo di immunorilevazione colorimetrica basato sulle cellule che rileva l'antigene virale con gli anticorpi e, quindi, identifica le aree di focolai delle cellule infette utilizzando la tecnica dell'immunocolorazione, ma non le placche12,26. L'FFA offre alcuni vantaggi per ZIKV rispetto al PFA. Un chiaro vantaggio è che si basa sul riconoscimento anticorpale dei componenti virali senza CPE distinguibili. Inoltre, l'uso di anticorpi virus-specifici è utile anche per identificare diversi virus o sierotipi virali in popolazioni miste27. Pertanto, l'FFA è più specifico del PFA in quanto misura tutte le infezioni virali e non dipende dai virus che causano una morte cellulare sufficiente a formare una placca visibile28. L'FFA ha anche un periodo di incubazione più breve rispetto al PFA, che richiede un CPE evidente che indica la lisi e la morte cellulare. Infine, utilizzando una piastra a 96 pozzetti, il metodo FFA offre il vantaggio di utilizzare più repliche e diluizioni maggiori per rilevare e titolare il virus27,29. Inoltre, il test FFA riportato può essere facilmente adattato per i test di neutralizzazione del virus e i metodi per lo screening dei composti antivirali. L'incorporazione di strumenti o software per il conteggio automatico delle cellule commerciali o gratuiti può migliorare ulteriormente l'usabilità (coerenza, precisione, produttività) dell'FFA e dei suoi metodi associati.

Quando si confronta la piastra a 24 pozzetti con la piastra a 96 pozzetti, è importante notare che il formato a 24 pozzetti richiede un numero maggiore di cellule da coltivare in colture monostrato, nonché maggiori quantità di terreni e scorte virali. Di conseguenza, il formato della piastra a 24 pozzetti potrebbe non essere adatto per l'uso con campioni con volumi limitati. Questa limitazione può essere superata utilizzando il formato a 96 pozzetti, come descritto in questo documento. In primo luogo, il formato a 96 pozzetti richiede meno materiale, il che lo rende un'opzione più conveniente. Inoltre, il conteggio automatizzato dei focolai di virus colorati nel formato a 96 pozzetti consente un'elevata produttività e un'analisi rapida, che non è possibile nel formato a 24 pozzetti, che richiede il conteggio manuale. Questo processo di conteggio automatizzato aumenta anche la riproducibilità e riduce la soggettività rispetto al conteggio manuale, portando a risultati più accurati e affidabili dell'FFA. Pertanto, il formato a 96 pozzetti con sistemi di imaging automatizzati è altamente raccomandato per i laboratori che richiedono un'elevata produttività e una quantificazione affidabile dei virus.

D'altra parte, alcune persone usano il test di messa a fuoco immunofluorescente per rilevare ZIKV 25,27,28,30,31. Il test di focalizzazione dell'immunofluorescenza è parallelo all'FFA, tranne per il fatto che viene eseguito immunocolorando gli antigeni con anticorpi specifici coniugati con fluorocromo, seguito dal conteggio dei focolai di infezione al microscopio a fluorescenza25. Questo test utilizza reagenti più costosi e necessita di microscopia a fluorescenza per completare il test. Pertanto, il test di focalizzazione dell'immunofluorescenza è limitato ai laboratori meglio attrezzati, come i laboratori di riferimento. Non è facile utilizzare questo test in un ambiente che richiede molte risorse.

Sebbene l'FFA abbia molti vantaggi, ha anche alcune limitazioni. Rispetto ad altri saggi, come il PFA, l'FFA prevede più passaggi durante i processi di colorazione. Mentre i passaggi dopo la fissazione sono flessibili e consentono pause notturne o più lunghe, la colorazione dei fuochi richiede ancora più tempo per essere completata. Inoltre, l'FFA richiede anticorpi specifici o cross-reattivi nel processo di colorazione, il che ne limita l'applicabilità per l'identificazione e la quantificazione di virus nuovi o inediti. Inoltre, il costo dell'FFA è più alto rispetto al PFA, che richiede solo il viola cristallino per la colorazione. Inoltre, vale la pena notare che il processo di conteggio automatizzato (formato a 96 pozzetti) può essere eseguito solo in un laboratorio con l'attrezzatura appropriata; quindi, non sarà adatto per i laboratori senza l'attrezzatura necessaria.

In conclusione, riportiamo protocolli dettagliati per la propagazione e la quantificazione di ZIKV utilizzando il test di immunorilevazione colorimetrica basato su cellule o l'FFA nei formati di piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti. Il metodo offre una serie di vantaggi pratici rispetto al PFA classico. È più veloce e adatto per applicazioni ad alta produttività se applicato con un sistema di imaging automatizzato per il conteggio dei fuochi. La standardizzazione di protocolli affidabili per questo studio contribuirà notevolmente alla ricerca su Zika e può anche essere ampiamente adattata per quantificare altri virus clinicamente importanti.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e il finanziamento del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 di questo studio, che mostra il flusso di lavoro della colorazione per il test di formazione dei focolai, è adattata da "DAB Immunoistochemistry" di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

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Immunologia e infezione Numero 194 Virus Zika (ZIKV) Flavivirus Anomalie cerebrali congenite Sindrome di Guillain-Barrã© Virologia Focus Forming Assay (FFA) Antigene virale Tecnica di immunocolorazione della perossidasi Formato a 24 pozzetti Formato a 96 pozzetti Ottimizzazione delle dimensioni dei focolai Cellule Vero Incubazione Processi di colorazione Fissazione cellulare Permeabilizzazione Blocco Legame anticorpale Substrato della perossidasi
Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare
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