Summary
La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .
Abstract
Los macrófagos representan una línea de defensa crucial y son responsables de prevenir el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. La fagocitosis conidial es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares implicados en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados. La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. La evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. En este trabajo se presentan los métodos que se pueden utilizar para el análisis de la fagocitosis, aclaramiento y viabilidad de T. stromaticum conidia, un hongo que se utiliza como agente de biocontrol y biofertilizante y es capaz de inducir infecciones humanas. El protocolo consiste en 1) cultivo de Trichoderma , 2) lavado para obtener conidios, 3) el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el método de solución de polisacarosa y la diferenciación de los PBMCs en macrófagos, 4) un método de fagocitosis in vitro utilizando cubreobjetos de vidrio redondos y coloración, y 5) un ensayo de aclaramiento para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis de los conidios. En resumen, estas técnicas se pueden utilizar para medir la eficiencia de eliminación de hongos de los macrófagos.
Introduction
El género Trichoderma (Orden: Hypocreales, Familia: Hypocreaceae) está compuesto por hongos saprófitos ubicuos que son parásitos de otras especies fúngicas y son capaces de producir una variedad deenzimas comercialmente útiles. Estas especies fúngicas se utilizan para la producción de proteínas heterólogas2, la producción de celulosa3, etanol, cerveza, vino y papel4, en la industria textil5, la industria alimentaria6 y en la agricultura como agentes de control biológico 7,8. Además del interés industrial en estas especies fúngicas, el creciente número de infecciones en humanos ha dado a algunas especies de Trichoderma el estatus de patógenos oportunistas9.
Trichoderma spp. crece rápidamente en cultivo, con colonias inicialmente blancas y algodonosas que se vuelven de color amarillo verdoso a verde oscuro10. Están adaptados a vivir en un amplio rango de condiciones de pH y temperatura, y las especies oportunistas son capaces de sobrevivir a pH y temperaturas fisiológicas y, por lo tanto, colonizar diferentes tejidos humanos 11,12,13. Es importante destacar que el aumento en la tasa de infección de Trichoderma spp. puede estar asociado con factores de virulencia, y estos no están bien estudiados. Además, los estudios centrados en la comprensión de la respuesta inmunitaria contra especies oportunistas de Trichoderma siguen siendo escasos.
Durante una infección, junto con los neutrófilos, los macrófagos representan la línea de defensa responsable de la fagocitosis y, por lo tanto, evitan el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. Utilizando receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores tipo Toll y los receptores de lectina de tipo C, los macrófagos fagocitan hongos y los procesan en fagolisosomas, promoviendo así un estallido respiratorio, la liberación de citoquinas proinflamatorias y la destrucción de los microorganismos fagocitados14. El mecanismo de fagocitosis, sin embargo, puede verse afectado y evadido por diferentes estrategias microbianas, como el tamaño y la forma de las células fúngicas; la presencia de cápsulas que dificultan la fagocitosis; disminuir el número de receptores inductores de fagocitosis; la remodelación de la estructura de las fibras de actina en el citoplasma; dificultar la formación de seudópodos; y el escape de fagosomas o fagolisosomas después del proceso de fagocitosis14.
Muchos patógenos, incluido Cryptococcus neoformans, utilizan los macrófagos como nicho para sobrevivir en el huésped, diseminarse e inducir la infección15. El ensayo de fagocitosis y aclaramiento se utiliza para evaluar la respuesta inmune frente a patógenos e identificar las estrategias microbianas empleadas para evadir el sistema inmune innato 15,16,17. Este tipo de técnica también se puede utilizar para examinar la cinética diferencial de la fagocitosis, la acidificación retardada del fagosoma y el estallido oxidativo que dan lugar a una reducción de la muerte fúngica18.
Se pueden utilizar diferentes métodos para evaluar la fagocitosis, la supervivencia fúngica y la evasión del proceso de maduración del fagosoma. Entre ellas se encuentran la microscopía de fluorescencia, que se utiliza para observar la fagocitosis, la ubicación celular y las moléculas producidas durante la fagocitosis19; citometría de flujo, que proporciona datos cuantitativos sobre la fagocitosis y se utiliza para evaluar los diferentes marcadores implicados en el proceso20,21; microscopía intravital, que se utiliza para evaluar la captura microbiana y la maduración del fagosoma22; fagocitosis mediada por anticuerpos, que se utiliza para evaluar la especificidad del proceso de fagocitosis de un patógeno23; y otros 24,25,26,27.
El protocolo presentado aquí emplea un método común, de bajo costo y directo que utiliza un microscopio óptico y un ensayo de crecimiento en placa para evaluar la fagocitosis y la eliminación de los conidios fúngicos. Este protocolo proporcionará a los lectores instrucciones paso a paso para realizar el ensayo de fagocitosis y aclaramiento utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana expuestos a T. stromaticum. Los PBMC se utilizaron porque los conidios de Trichoderma se aplican como biocontrol contra fitopatógenos y biofertilizante para cultivos de plantas en todo el mundo y han causado varias infecciones humanas, llamadas Trichodermosis. Además, solo hay dos trabajos previos centrados en la interacción entre los conidios de Trichoderma y el sistema inmune humano, en los que examinamos los neutrófilos28 y la autofagia en macrófagos29. Este artículo muestra, en primer lugar, cómo se puede estudiar la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum por macrófagos derivados de PBMC, y luego cómo se puede evaluar la viabilidad de los conidios engullidos utilizando técnicas simples basadas en microscopía. Este protocolo puede facilitar aún más las investigaciones sobre la respuesta inmunitaria asociada a macrófagos o los mecanismos relacionados con la modulación del sistema inmunitario.
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Protocol
Consideraciones éticas y sujetos humanos
Todos los experimentos con seres humanos descritos en este estudio fueron realizados de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las leyes federales brasileñas y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Estadual de Santa Cruz (código de identificación del proyecto: 550.382/ 2014).
Se colectó sangre periférica humana de voluntarios sanos de la ciudad de Ilhéus, Bahía, Brasil, no expuestos a actividades ocupacionales relacionadas con el hongo estudiado. Se excluyeron las personas con afecciones médicas de salud reportadas o que usaban medicamentos. Todos los sujetos aceptaron voluntariamente participar y firmaron un consentimiento informado antes de su inclusión en este estudio.
1. Preparación de los reactivos y soluciones
NOTA: Prepare los siguientes reactivos y soluciones antes de continuar. Consulte la Tabla de materiales (TOM) para obtener la información sobre el reactivo y el proveedor de materiales.
- Prepare una solución salina estéril balanceada tamponada con fosfato 1x (PBS).
NOTA: En este protocolo, no se utilizó PBS libre de endotoxinas. - Prepare agar papa dextrosa (PDA) medio y vierta 20 ml en cada placa de Petri para el cultivo de T. stromaticum . Prepare seis placas con PDA para cada donante y use una placa para cada condición: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h. Además, utilice tres placas para cada control: tres para el control de Trichoderma y tres para el control del medio R10. Utilice placas de Petri de 60 mm x 15 mm o 100 mm x 15 mm para una recuperación óptima de los conidios.
- Esterilizar glicerol al 100%.
- Preparar un medio R10 para el cultivo celular: medio RPMI suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina).
- Esterilizar el agua destilada para la lisis celular.
- Prepare agua a pH 7.0 para el proceso de coloración.
NOTA: Si es necesario, ajuste el pH con un medidor de pH y soluciones de 0,1 M/L de NaOH y 0,1 M/L de HCl. - Esterilizar cubreobjetos redondos de vidrio (13 mm) y pinzas.
2. Cultivo y procesamiento de Trichoderma stromaticum
- Preparación de una cepa madre (M1) de T. stromaticum:
NOTA: Se requiere una cepa madre (M1) para garantizar que todos los experimentos se realicen a partir del cultivo de la misma generación fresca (F1).- Cultivar un inóculo de T. stromaticum en placas de Petri con PDA a 28 °C en la oscuridad durante 7-10 días hasta que se observen los conidios y el cultivo se vuelva verde.
- Lavar el cultivo de T. stromaticum. Añadir 3-5 mL de PBS a la superficie de cultivo con una pipeta. Recoja el PBS de la placa y vuelva a dispensarlo sobre el cultivo para eliminar gradualmente los conidios con la pipeta. Repita este proceso tantas veces como sea necesario hasta que la suspensión se vuelva verde oscuro.
NOTA: Alternativamente, se sugiere un lavado suave del cultivo agregando 3-5 mL de PBS a la placa seguido de un movimiento circular hasta que la suspensión se vuelva verde para recuperar los conidios. Con el pipeteo repetido, se pueden recolectar más conidios. - Transfiera la suspensión recuperada de la placa a un tubo estéril de 15 ml con una pipeta. Repita los pasos 2.1.2-2.1.3 tantas veces como sea necesario para obtener más conidios.
- Centrifugar la suspensión a 1.160 x g durante 5 min a 12 °C, y resuspender el pellet en 5 mL de PBS. Repita este paso (2.1.4) tres veces para obtener una suspensión sin hifas.
NOTA: Para resuspender el gránulo correctamente, después de la centrifugación, se recomienda un breve vórtice. - Vuelva a suspender el gránulo final en 2-3 ml de PBS y cuente los conidios en una cámara de Neubauer utilizando una dilución de 1:100 o 1:1.000.
NOTA: En condiciones óptimas, se puede recuperar una concentración final de 2 x 108 conidios/mL del cultivo. La evaluación de la viabilidad de los conidios mediante el método de exclusión de azul de tripano es opcional. - Alícuota de la suspensión en tubos estériles de 1,5 mL añadiendo 0,5 mL de la suspensión de conidios (del paso 2.1.5) a cada tubo. A continuación, añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 100% para obtener las existencias de M1. Vórtice brevemente, identifique los tubos y guárdelos a -20 °C o -80 °C.
- Cultivo de T. stromaticum y obtención de conidios para el experimento
- Placa de 10 μL de la suspensión M1 (preparada en el paso 2.1) en PDA a 28 °C en la oscuridad durante 7-10 días hasta que se observen los conidios y el cultivo se vuelva verde para obtener la nueva generación de F1.
NOTA: Para asegurar un nuevo cultivo de T. stromaticum para el experimento, evalúe el tiempo requerido para el crecimiento del hongo y el tiempo requerido para la diferenciación de macrófagos. - Recoja los conidios, repitiendo los pasos 2.1.2-2.1.4.
- Vuelva a suspender el gránulo final en 2-3 ml de PBS. Evalúe la viabilidad de los conidios utilizando el método de exclusión de azul de tripán, o cuente los conidios como se menciona en el paso 2.1.5.
- Placa de 10 μL de la suspensión M1 (preparada en el paso 2.1) en PDA a 28 °C en la oscuridad durante 7-10 días hasta que se observen los conidios y el cultivo se vuelva verde para obtener la nueva generación de F1.
3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
NOTA: Las PBMC se obtienen por el método de barrera de densidad utilizando una solución de polisacarosa de densidad 1.077 g/mL30.
- Alícuota 15 mL de la solución de polisacarosa a un tubo de 50 mL por cada muestra de donante que se recogerá.
- Recolectar 20 ml de sangre de cada donante usando tres o cuatro tubos de EDTA. Reclutar un mínimo de cuatro donantes por experimento. No junte la sangre de los donantes; En su lugar, use cada muestra por separado como una réplica biológica. Para cada donante, transfiera la sangre a un tubo de 50 mL y agregue PBS para obtener un volumen final de 35 mL.
- Transfiera la suspensión de sangre (paso 3.2) lentamente a lo largo de la pared del tubo que contiene la solución de polisacarosa (paso 3.1) para formar una suspensión bifásica.
NOTA: Para evitar que la sangre se mezcle con la solución de polisacarosa, agregue la sangre lentamente. Se recomienda el uso de un mínimo de 7 mL de sangre de cada donante para el aislamiento de PBMC. - Centrifugar inmediatamente el tubo que contiene la suspensión bifásica a 1.600 x g durante 30 min a 24 °C. Programe la centrifugación de los PBMC: utilice la aceleración 1 y la desaceleración 0 para evitar una parada brusca de la centrifugación.
- Observe la formación de un anillo blanco que contiene los PBMC después de la centrifugación. Los glóbulos rojos y los granulocitos residen en la capa inferior, la siguiente capa contiene la solución de polisacarosa y los PBMC residen en el anillo blanco entre la solución de polisacarosa y el plasma (capa superior). Recoja el anillo blanco aspirando suavemente con una pipeta o una pipeta Pasteur estéril para no atrapar glóbulos rojos, plasma o solución de polisacarosa, y transfiéralo a un tubo de 15 ml.
- Añadir PBS al tubo de 15 mL que contiene las PBMC para obtener un volumen final de 10 mL. Homogeneizar la suspensión y centrifugar el tubo a 1.600 x g durante 30 min a 24 °C.
- Lavar las células tres veces a 1.600 x g durante 5 min a 24 °C con 10 mL de PBS. A continuación, vuelva a suspender el gránulo final en 2 ml de medio R10.
- Evaluar la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de tripano y contar las células en una cámara de Neubauer.
4. Cinética de fagocitosis
NOTA: Los macrófagos mononucleares de sangre periférica humana se tratan con conidios de T. stromaticum en una multiplicidad de infección (MOI) de 1:10 o solo en medio R10 como control. La multiplicidad de infección (MOI) representa la proporción de los agentes infecciosos añadidos a las dianas de infección y se presenta como números absolutos: MOI = agentes:dianas31. Aquí, usamos 1 conidio de T. stromaticum (agente) para 10 macrófagos (dianas). Luego, las células se incuban a 37 °C y 5% de CO2 durante diferentes períodos de tiempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h). A continuación, se utiliza un cubreobjetos de vidrio redondo para visualizar los macrófagos adherentes implicados en el proceso de fagocitosis bajo un microscopio. Se proporciona una figura de diseño experimental (Figura 1).
NOTA: Se sugiere el uso de placas de 24 pocillos.
- Tratamiento de macrófagos de origen humano con conidios de T. stromaticum
- Agregue un cubreobjetos de vidrio redondo estéril (13 mm) a cada pocillo con pinzas estériles.
- Ajustar el volumen de la suspensión celular obtenida en los pasos 3.7-3.8 a la placa 8 x 105 celdas por pocillo a un volumen final de 1 mL con medio R10. Utilice un microscopio invertido para evaluar la morfología celular.
NOTA: Las células deben estar suspendidas en el medio y tener una morfología redondeada. - Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante 7 días, y sustituir el medio por medio R10 fresco cada 2 días para la diferenciación de los monocitos en macrófagos32. Observar la morfología celular con un microscopio invertido. Los macrófagos presentarán morfología fusiforme, con formas aplanadas y extendidas; También se puede observar un aumento de la relación citoplasmática y la presencia de seudópodos. Busca macrófagos mononucleares adherentes.
NOTA: Una proporción muy pequeña de monocitos indiferenciados puede permanecer suspendida en el medio. - Retire el medio de cada pocillo con una pipeta y lave las células con 1 ml de PBS para eliminar los residuos y las células no adherentes.
- Utilizar la suspensión preparada en el paso 2.2 para preparar una nueva suspensión de conidios de T. stromaticum a una concentración final de 8 x 104 conidios/ml en medio R10.
- Añadir 1 ml de la suspensión de conidios preparada en el paso 4.1.5 a cada pocillo de tratamiento (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) para obtener un MOI de 1:10. A los controles, agregue solo 1 ml de medio R10 al pocillo.
- Desafiar a los macrófagos durante 3 h con conidios de T. stromaticum a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 . Después de 3 h, retire el medio y lave las células para eliminar los conidios no fagocitados.
- Agregue 1 mL de medio R10 a cada pocillo e incube la placa durante diferentes tiempos (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 .
- Coloración y análisis
- Retire el medio de cada pocillo después de que se complete la incubación correspondiente (paso 4.1.8) y agregue 1 ml de PBS a ese pocillo.
- Retire los cubreobjetos redondos de vidrio de los pocillos con pinzas estériles y una aguja para colorear con un kit de tinción.
NOTA: Alternativamente, la tinción se puede realizar con la tinción de May Grünwald-Giemsa33. - A cada uno de los cubreobjetos redondos de vidrio, agregue fijador de manchas (5 s), Tinte 1 (5 s), Tinte 2 (2 s) y agua tamponada pH 7.0 (5 s), que son los componentes del kit de tinción. Espere hasta que estén secos y fije los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con un agente de montaje.
- Cuantificar el resultado: Cuente un total de 100 macrófagos (Mø) para cada condición de tiempo. Usando un microscopio óptico, cuente el número de macrófagos con conidios fagocitados usando un objetivo de 100x y aceite de inmersión (ecuación [1]).
(1) - Obtener el número de conidios fagocitados por macrófago: Correlacionar los conidios presentes en 100 macrófagos divididos por el número de macrófagos con al menos un conidio fagocitado (ecuación [2])34.
(2)
NOTA: Para evaluar y contar los conidios, se puede utilizar el software ImageJ35. - Fotografíe la fagocitosis de cada muestra y condición de tiempo utilizando objetivos de 40x y 100x para presentar los resultados.
(1)
(2)
Figura 1: Representación esquemática del ensayo de fagocitosis y viabilidad conidial utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana. (1-10) Ensayo de fagocitosis: El T. stromaticum debe cultivarse en PDA, y los conidios se recuperan lavando la placa con PBS. Las PBMC deben aislarse por el método de barrera de densidad utilizando el protocolo descrito, cultivarse en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio redondos estériles durante 7 días para su diferenciación en macrófagos, y luego tratarse con un MOI de 1:10 con diferentes intervalos de tiempo. Los cubreobjetos redondos de vidrio se retiran y se tiñen con el kit de tinción, y los resultados se analizan mediante microscopía óptica. (1-8,11-13) Ensayo de viabilidad de conidios: Después del aislamiento, los PBMC se cultivan en placas de 24 pocillos sin cubreobjetos de vidrio redondos durante 7 días para su diferenciación en macrófagos y luego se tratan con un MOI de 1:10 durante diferentes intervalos de tiempo. Las células deben ser lisadas por incubación con agua destilada; luego se centrifuga la suspensión y luego el gránulo resuspendido se recubre en PDA para analizar la cinética de crecimiento de Trichoderma. Esta figura fue diseñada a partir de una base de datos de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Ensayo de viabilidad de conidios después de la fagocitosis
NOTA: Se proporciona una figura de diseño experimental (Figura 1).
NOTA: Utilice placas de 24 pocillos.
- Desafía a los macrófagos de origen humano con conidios de T. stromaticum .
- Repita los pasos 4.1.2-4.1.8 para diferenciar los monocitos y tratar los macrófagos con conidios de T. stromaticum .
NOTA: No utilice cubreobjetos de vidrio redondos en los pozos. Utilice los mismos intervalos de tiempo utilizados para analizar la cinética de la fagocitosis de modo que la fagocitosis pueda correlacionarse con la viabilidad de los conidios. - Evaluar el impacto del medio R10 sobre el crecimiento de T. stromaticum utilizando pocillos con la suspensión preparada en el paso 4.1.5 (medio R10 + conidios) como control.
- Repita los pasos 4.1.2-4.1.8 para diferenciar los monocitos y tratar los macrófagos con conidios de T. stromaticum .
- Ensayo de viabilidad de conidios
- Retire el medio después de cada período de incubación (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) y lave las células dos veces con PBS para eliminar los conidios que no han sido fagocitados.
NOTA: El control que contiene medio R10 + conidios no debe lavarse. - Añadir 0,5 mL de agua destilada estéril a cada pocillo e incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min. Después de este tiempo, observe la morfología celular bajo un microscopio invertido para asegurarse de que las células hayan sido lisadas.
- Recoja la suspensión y transfiérala a tubos de 1,5 ml. Centrifugar la suspensión con una mini centrífuga a 6.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender el gránulo en 10 μL de agua destilada estéril e inocule 10 μL de la suspensión en la placa que contiene PDA a 28 °C en la oscuridad.
- Preparar un control positivo para el crecimiento de T. stromaticum : Utilice la suspensión de conidios de T. stromaticum (paso 2.2) para preparar una nueva suspensión con una concentración final de 8 x 106 conidios/mL. Placa de 10 μL de esta suspensión en PDA a 28 °C en la oscuridad.
NOTA: 10 μL de esta suspensión contendrán el mismo número de conidios (8 x 104) que se utilizaron para infectar los macrófagos mononucleares derivados de la sangre. La diferencia entre este control positivo y el mencionado en el paso 5.1.2 es que el control mencionado anteriormente en el paso 5.1.2 se utiliza para evaluar el posible impacto del medio R10 en el crecimiento de Trichoderma durante el tiempo de fagocitosis. Este control positivo en el paso 5.2.5 utilizando la suspensión de conidios de T. stromaticum recolectados en PBS representa un control para el crecimiento de Trichoderma sin la influencia del medio R10 para reflejar cómo crece el hongo de forma natural. Con este control, es posible evaluar si el medio R10 influye en el crecimiento de Trichoderma . - Observe la cinética de crecimiento de T. stromaticum en PDA todos los días y fotografíe el cultivo.
- Análisis: Se pueden utilizar dos puntos para evaluar los resultados: 1) el tiempo (en días) requerido para que el cultivo ocupe toda la placa de cultivo, y 2) el tiempo (en días) hasta la aparición de la pigmentación verde característica de los conidios de T. stromaticum en cultivo.
- Retire el medio después de cada período de incubación (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) y lave las células dos veces con PBS para eliminar los conidios que no han sido fagocitados.
6. Análisis estadístico
- Utilice una prueba de Kruskal-Wallis para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los 8 grupos/tratamientos. Considere p < 0,05 como estadísticamente significativo. Todos los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE). En las figuras, # indica significación estadística en p < 0,05.
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Representative Results
La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. Utilizamos la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis, ya que la evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. Los investigadores deben realizar estas técnicas como uno de los primeros ensayos cuando se investiga una especie de interés clínico.
Figura 2: Fagocitosis de conidios de T. stromaticum por macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana. Resultados representativos de la cinética de fagocitosis (A) bajo objetivos de 40x y (B) 100x que muestran macrófagos derivados de PBMC que contienen conidios de T. stromaticum . (C) T. stromaticum conidios libres y adheridos a la membrana externa; (D) Conidios de T. stromaticum completamente internalizados por macrófagos; (E) conidios de T. stromaticum en un plano superior; (F) fagocitosis múltiple; y (G) germinación de conidios dentro de (H) y fuera de los macrófagos. Flechas: amarillos, conidios libres; blanco, conidios adheridos a la membrana externa; conidios negros, completamente internalizados; rojo, germinación de conidios dentro de los macrófagos. Flechas discontinuas: negras, fagocitosis múltiple; rojos, conidios que germinan en el medio R10 fuera de los macrófagos; blanco, conidios en el plano superior. La barra de escala indica 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la Figura 2 se muestran los resultados representativos de la cinética de fagocitosis. Al inicio del proceso de fagocitosis se pueden observar conidios libres de T. stromaticum, así como conidios adheridos a la membrana externa de los macrófagos o completamente internalizados por ellos (Figura 2A-C). Se pueden observar menos conidios libres o adheridos a la membrana externa de los macrófagos con el aumento del tiempo de fagocitosis.
Cabe destacar que en este trabajo se pueden encontrar conidios libres y adheridos a la membrana externa (Figura 2C) al inicio del proceso de fagocitosis, completamente internalizados por los macrófagos (Figura 2D), o en un plano superior en comparación con los macrófagos (Figura 2E) pero no fagocitados, y se puede encontrar más de un conidio en el mismo macrófago (Figura 2F). Después de largos períodos de tiempo (96 h), los conidios fagocitados podrían germinar dentro de los macrófagos (Figura 2G), y los conidios libres podrían germinar en el medio R10 para formar hifas a 37 °C (Figura 2H).
Después de la fagocitosis, fue posible observar que los conidios de T. stromaticum seguían siendo viables incluso después de 120 h de interacción con los macrófagos humanos derivados de PBMC. Los resultados representativos muestran el cultivo de los conidios recuperados (Figura 3A) y representan el tiempo (en días) requerido para que el cultivo ocupe toda la placa de cultivo (Figura 3B) y forme conidios de color verde (Figura 3C). Solo los conidios discretos de T. stromaticum fueron capaces de evadir el fagosoma y ser encontrados libres en el citoplasma de los macrófagos mononucleares derivados de la sangre periférica humana29. La capacidad de Trichoderma para disminuir la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno también puede contribuir a la supervivencia de los conidios dentro del fagosoma y explicar la viabilidad después de la fagocitosis 28,29,36. Hasta ahora, hemos demostrado que los conidios fagocitados siguen siendo viables y son capaces de crecer en el medio PDA incluso después de 120 h. También se ha informado que otros microorganismos sobreviven después de ser engullidos por macrófagos, como Aspergillus 27,37 y Cryptococcus38.
Figura 3: Capacidad de eliminación de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana infectados con conidios de T. stromaticum . Después de un desafío con conidios de T. stromaticum (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h o 120 h) se lisaron los macrófagos derivados de PBMC y la suspensión se sembró en PDA para evaluar la viabilidad de los conidios fagocitados. (A) Se muestran resultados representativos del crecimiento de T. stromaticum después de la fagocitosis por macrófagos derivados de PBMC. Monitorización de (B) el crecimiento de T. stromaticum y (C) la conidiación en diferentes días para el control positivo con T. stromaticum en PBS (ver paso 5.2.5), el control para el medio R10 (ver paso 5.1.2) y los conidios fagocitados por macrófagos durante diferentes períodos de tiempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h). Resultados representativos de cuatro donantes sanos. Media ± desviación estándar (DE). Prueba de Kruskal-Wallis. El símbolo # indica significación en p < 0,05, n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para varios patógenos fúngicos, incluyendo Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans y otros, la fagocitosis conidial o de levadura es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados 14,39,40. La fagocitosis es el proceso clave en la interacción Trichoderma-huésped. El género Trichoderma modula varias vías de fagocitosis, incluyendo Dectina-1 y Dectina-2, receptor tipo Toll 2 y receptor tipo Toll 4, MHC y NF-κB 25,28,41,42,43. Trichoderma causa tricodermosis en individuos comprometidos y no inmunocomprometidos9. Es importante destacar que varias especies de este género se utilizan en la agricultura y son la fuente potencial de Trichodermosis. Es urgente comprender los factores de virulencia de T. stromaticum y el mecanismo de la respuesta inmune en el cuerpo humano contra estos hongos, ya que los riesgos laborales causados por las especies de Trichoderma, incluida T. stromaticum, están aumentando de manera alarmante. El método que aquí se presenta proporciona detalles para realizar el ensayo de fagocitosis y muerte para estudiar la interacción Trichoderma-macrófagos en macrófagos derivados de sangre periférica humana; Sin embargo, este método también se puede utilizar para estudiar macrófagos de diferentes tejidos, incluidos macrófagos alveolares, peritoneales o de linaje.
El primer paso de este protocolo comienza con una suspensión de la madre madre (M1) para obtener cultivos frescos del hongo. Los cultivos de Trichoderma crecen rápidamente, ya que generalmente se apoderan de toda la placa y comienzan a mostrar conidios de color verde en 5 días. La temperatura y la luz son factores cruciales para el crecimiento de Trichoderma , y las alteraciones en estos factores pueden afectar la cinética de Trichoderma y comprometer el experimento44.
Después de lavar el cultivo de T. stromaticum, se debe recuperar un volumen final entre 5-8 mL. La intensidad del color de la suspensión es proporcional a la concentración de conidios. La suspensión de conidios obtenida puede utilizarse para ensayos in vitro e in vivo, como la evaluación de la fagocitosis26, las trampas extracelulares de neutrófilos28, la exposición intranasal36,41, la exposición intraperitoneal26, la infección intracutánea45 y la infección intravenosa46. Investigaciones previas realizadas con macrófagos humanos han evaluado la autofagia inducida por Trichoderma29 y la capacidad del género para inhibir la formación de trampas extracelulares en neutrófilos28, que es un mecanismo utilizado para eliminar patógenos fúngicos y otros microorganismos.
Es importante tener en cuenta que el medio de cultivo utilizado para mantener las células puede afectar la germinación de los conidios (Figura 3G, H). Si no se desea la germinación para un experimento en particular, recomendamos realizar un ensayo de cribado inicial con el medio de cultivo celular para establecer la cinética de crecimiento de Trichoderma en ese medio en particular. Este ensayo debe realizarse antes de comenzar los experimentos in vitro con el linaje celular deseado, y el experimento debe detenerse después de 72 horas si se determina que el medio no es compatible. La germinación de los conidios de Trichoderma (Figura 3G,H) se puede observar a partir de las 96h dentro y fuera de los macrófagos.
Como las especies de Trichoderma presentan diferencias en la morfología y la temperatura y el pH óptimos para su crecimiento, los resultados presentados aquí pueden no ser reproducibles para todas las especies del género, y este protocolo puede necesitar adaptaciones cuando se realiza con otras especies. Por ejemplo, los conidios de Trichoderma asperelloides germinan más rápidamente en cultivo que los de T. stromaticum.
Los protocolos previamente documentados para evaluar la fagocitosis y la eliminación del patógeno mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia requieren reactivos costosos, pero proporcionan información específica sobre el proceso de fagocitosis19. El protocolo presentado en este artículo solo requiere un microscopio óptico y el crecimiento de la placa para evaluar la fagocitosis y proporciona imágenes completas del proceso de fagocitosis. Se pueden utilizar diferentes protocolos para obtener macrófagos diferenciados e inducir la lisis de macrófagos. Estos protocolos incluyen el uso de diferentes tiempos para la diferenciación de los macrófagos en lugar de los 7 días utilizados aquí26 o el uso de desoxicolato al 2,5%47 para lisar los macrófagos en lugar de agua destilada a 37 °C y 5% deCO2 durante 30 min, como se utiliza aquí en este protocolo. Estos métodos se han utilizado eficazmente para diferentes especies de hongos como A. fumigatus27, A. nidulans18 y Cryptococcus neoformans15.
Algunas limitaciones de este protocolo están relacionadas con el uso de PBS que no está libre de endotoxinas, el uso de cubreobjetos redondos de vidrio y el uso de sangre humana. Recomendamos probar el PBS (no libre de endotoxinas) en las células para asegurarse de que no puede activar los monocitos y sesgar el experimento. El uso de cubreobjetos de vidrio redondos es muy útil para teñir y contar las células, pero es posible que las células no se distribuyan uniformemente debajo del portaobjetos, ya que algunas células migran al borde del pozo de la placa, y esta diferencia puede tener un impacto en el número total estimado de células en los cubreobjetos de vidrio redondos. Como no utilizamos inmunofluorescencia o técnicas similares en este protocolo, la presencia de conidios no fagocitados en un plano superior en comparación con los macrófagos puede llevar a una mala interpretación de los resultados de la fagocitosis. Como utilizamos sangre de donantes humanos, el recuento final de PBMC varía entre los donantes, y los recuentos bajos de células de donantes pueden no ser suficientes para todos los experimentos.
En resumen, estas técnicas se pueden utilizar para medir la función de los macrófagos y el aclaramiento de hongos, específicamente para hongos filamentosos como Trichoderma y otros microbios, como levaduras y bacterias. Además, este protocolo proporciona direcciones futuras para estudiar la variabilidad real en la respuesta inmune frente a hongos formadores de conidios en poblaciones humanas, que no se puede observar utilizando modelos animales isogénicos o líneas celulares.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes instituciones financieras brasileñas: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con subvenciones RED0011/2012 y RED008/2014. U.R.S., J.O.C. y M.E.S.M. reconocen la beca otorgada por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y la FAPESB, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
References
- Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
- Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
- Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
- Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
- Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
- Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
- Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M.
- Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
- dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
- Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
- Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
- Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
- Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
- Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
- Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
- Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
- Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
- Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
- Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
- Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
- Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
- Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
- Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
- Harvath, L., Terle, D. A.
- dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
- Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
- Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
- Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
- Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
- Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
- Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
- Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
- Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
- Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
- Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
- Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
- Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
- Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
- Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
- Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).
