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Summary

Apesar do papel crucial do plexo coroide no cérebro, estudos de neuroimagem dessa estrutura são escassos devido à falta de ferramentas confiáveis de segmentação automatizada. O presente protocolo visa garantir a segmentação manual padrão-ouro do plexo coroide que possa subsidiar futuros estudos de neuroimagem.

Abstract

O plexo coroide tem sido implicado no neurodesenvolvimento e em uma série de distúrbios cerebrais. Evidências demonstram que o plexo coroide é crítico para a maturação cerebral, regulação imuno/inflamatória e funcionamento comportamental/cognitivo. No entanto, as ferramentas atuais de segmentação automatizada de neuroimagem são pobres em segmentar com precisão e confiabilidade o plexo coroide do ventrículo lateral. Além disso, não existe uma ferramenta que segmente o plexo coroide localizado no terceiro e quarto ventrículos cerebrais. Assim, um protocolo delineando como segmentar o plexo coroide no lateral, terceiro e quarto ventrículo é necessário para aumentar a confiabilidade e a replicabilidade dos estudos que examinam o plexo coroide em distúrbios do neurodesenvolvimento e cerebrais. Este protocolo fornece etapas detalhadas para criar arquivos rotulados separadamente no 3D Slicer para o plexo coroide com base em imagens DICOM ou NIFTI. O plexo coroide será segmentado manualmente usando os planos axial, sagital e coronal das imagens T1w, certificando-se de excluir voxels das estruturas da substância cinzenta ou branca que margeiam os ventrículos. As janelarias serão ajustadas para auxiliar na localização do plexo coroide e seus limites anatômicos. Métodos de avaliação da acurácia e confiabilidade serão demonstrados como parte deste protocolo. A segmentação padrão-ouro do plexo coroide usando delineamentos manuais pode ser usada para desenvolver ferramentas de segmentação automatizadas melhores e mais confiáveis que podem ser compartilhadas abertamente para elucidar mudanças no plexo coroide ao longo da vida e dentro de vários distúrbios cerebrais.

Introduction

Função do plexo coroide
O plexo coroide é uma estrutura altamente vascularizada no encéfalo, constituída por capilares fenestrados e uma monocamada de células epiteliais do plexo^coroide1. O plexo coroide projeta-se para o lateral, terceiro e quarto ventrículos cerebrais e produz líquido cefalorraquidiano (LCR), que desempenha um papel importante no padrão neural² e na fisiologia cerebral ^3,4. O plexo coroide secreta substâncias neurovasculares, engloba um repositório semelhante a células-tronco e atua como barreira física para impedir a entrada de metabólitos tóxicos, barreira enzimática para remover metades que contornam a barreira física e barreira imunológica para proteção contra invasores estranhos⁵. O plexo coroide modula a neurogênese6, a plasticidade sináptica7, a^{inflamação8}, o ritmo circadiano9,10, o eixo cérebro-intestino ¹¹ e a cognição¹². Além disso, citocinas periféricas, estresse e infecção (incluindo SARS-CoV-2) podem romper a barreira sangue-LCR 13,14,15,16. Assim, o sistema plexo-LCR coroide é integral para o neurodesenvolvimento, maturação do neurocircuito, homeostase cerebral e reparo¹⁷. Uma vez que alterações imunológicas, inflamatórias, metabólicas e enzimáticas afetam o cérebro, pesquisadores estão usando ferramentas de neuroimagem para avaliar o papel do plexo coroide ao longo da vida e em distúrbios cerebrais 18,19,20. No entanto, existem limitações em ferramentas automatizadas comumente utilizadas para segmentação do plexo coroide, como o FreeSurfer, que resultam em uma segmentação pouco segmentada do plexo coroide. Assim, há uma necessidade crítica de segmentação manual do plexo coroide que possa ser usada para desenvolver uma ferramenta automatizada precisa para segmentação do plexo coroide.

Plexo coroide no neurodesenvolvimento e nas doenças cerebrais
O papel do plexo coroide nas desordens cerebrais tem sido negligenciado por muito tempo, principalmente por ser considerado um coadjuvante cujo papel era amortecer o cérebro e manter um equilíbrio adequado de sal ^2,21. No entanto, o plexo coroide tem ganhado atenção como uma estrutura ligada a distúrbios cerebrais como síndromes dolorosas²², SARS-CoV-2 16,23,24, neurodesenvolvimento 2 e distúrbios cerebrais ¹⁹, sugerindo um efeito transdiagnóstico no desenvolvimento de distúrbios comportamentais. Nos transtornos do neurodesenvolvimento, os cistos do plexo coroide foram associados a um risco aumentado de atraso no desenvolvimento, transtorno de déficit de atenção/hiperatividade (TDAH) ou transtorno do espectro autista (TEA)^25,26. Além disso, o volume do plexo coroide do ventrículo lateral mostrou-se aumentado em pacientes com CIA²⁷. Nas desordens cerebrais, anormalidades do plexo coroide têm sido descritas desde 1921 em transtornos psicóticos^28,29. Estudos prévios identificaram aumento do plexo coroide usando a segmentação do FreeSurfer em uma grande amostra de pacientes com transtornos psicóticos em comparação com seus parentes de primeiro grau e controles¹⁹. Esses achados foram replicados usando volume de plexo coroide segmentado manualmente em uma grande amostra de população clínica de alto risco para psicose e descobriram que esses pacientes tinham maior volume de plexo coroide em comparação com controles saudáveis³⁰. Há um número crescente de estudos demonstrando aumento do plexo coroide na síndrome dolorosa regional^complexa22, acidente vascular encefálico³¹, esclerose^{múltipla20,32},^{Alzheimer33,34} e^depressão35, com alguns demonstrando uma ligação entre atividade imunológica/inflamatória periférica e cerebral. Esses estudos de neuroimagem são promissores; no entanto, a má segmentação do plexo coroide do ventrículo lateral pelo FreeSurfer²¹ limita a fidedignidade da estimativa automatizada do volume do plexo coroide. Como resultado, estudos em esclerose^{múltipla20,32},^depressão35,^Alzheimer34 e psicose^precoce36 começaram a segmentar manualmente o plexo coroide do ventrículo lateral, mas não há diretrizes atuais de como fazê-lo, nem orientações sobre segmentação do plexo coroide do terceiro e quarto ventrículos.

Ferramentas comuns de segmentação excluem o plexo coroide
Pipelines de segmentação cerebral como FreeSurfer^37,38,39, FMRIB Software Library (FSL)⁴⁰, SLANT⁴¹ e FastSurfer (desenvolvido pelo coautor Martin Reuter)^42,43, segmentam com precisão e confiabilidade estruturas corticais e subcorticais empregando paradigmas baseados em atlas (FSL), atlas e de superfície (FreeSurfer) e de aprendizagem profunda (SLANT e FastSurfer). Os pontos fracos de algumas dessas abordagens incluem velocidade de processamento, generalização limitada para diferentes scanners, forças de campo e tamanhos de voxels^37,44 e alinhamento forçado do mapa de etiquetas em um espaço de atlas padrão. No entanto, a capacidade de segmentar o plexo coroide e a compatibilidade com RM de alta resolução só é abordada pelo FreeSurfer e FastSurfer. As redes neurais por trás do FastSurfer são treinadas com rótulos de plexo coroide FreeSurfer, de modo que herdam as limitações de confiabilidade e cobertura discutidas anteriormente pelo FreeSurfer, com o terceiro e quarto ventrículos sendo ignorados²¹. As limitações atuais para ressonância magnética de alta resolução também existem, mas o fluxo de alta resolução⁴⁵ e o FastSurferVINN⁴³ do FreeSurfer podem ser usados para lidar com esse problema.

Ferramentas atuais de segmentação do plexo coroide
Existe apenas uma ferramenta de segmentação disponível gratuitamente para o plexo coroide, mas a precisão da segmentação é limitada. A segmentação precisa do plexo coroide pode ser afetada por uma variedade de fatores, incluindo (1) variabilidade na localização do plexo coroide (espacialmente não estacionária) devido à sua localização dentro dos ventrículos, (2) diferenças na intensidade do voxel, contraste, resolução (heterogeneidade intra-estrutura) devido à heterogeneidade celular, função dinâmica do plexo coroide, alterações patológicas ou efeitos parciais de volume, (3) diferenças de tamanho ventricular relacionadas à idade ou patologia que afetam o tamanho do plexo coroide, e (4) proximidade de estruturas subcorticais adjacentes (hipocampo, amígdala, caudado e cerebelo), que também são de difícil segmentação. Diante desses desafios, as segmentações do FreeSurfer muitas vezes subestimam ou superestimam, rotulam erroneamente ou ignoram o plexo coroide.

Três publicações recentes abordaram a lacuna da segmentação confiável do plexo coroide com um Gaussian Mix Model (GMM)⁴⁶, um Axial-MLP⁴⁷ e abordagens de aprendizagem profunda baseadas em^U-Net48. Cada modelo foi treinado e avaliado usando conjuntos de dados privados e rotulados manualmente de no máximo 150 indivíduos com uma diversidade limitada de scanners, locais, dados demográficos e transtornos. Embora essas publicações 46,48,49 tenham alcançado melhorias significativas em relação à segmentação do plexo coroide do FreeSurfer – às vezes dobrando a intersecção entre predição e verdade fundamental, nenhum dos métodos é (1) validado em RM de alta resolução, (2) tem análises dedicadas de generalização e confiabilidade, (3) apresenta grandes conjuntos de dados representativos de treinamento e teste, (4) aborda ou analisa especificamente desafios de segmentação do plexo coroide, tais como efeitos parciais de volume, ou (5) está disponível publicamente como uma ferramenta pronta para uso. Assim, o atual “padrão ouro” para a segmentação do plexo coroide é o traçado manual, por exemplo, utilizando o 3D Slicer⁵⁰ ou ITK-SNAP⁵¹, que não foi descrito anteriormente e tem sido um grande desafio para os pesquisadores que desejam examinar o papel do plexo coroide em seus estudos. O 3D Slicer foi escolhido para segmentação manual devido à familiaridade do autor com o software e por fornecer ao usuário várias ferramentas baseadas em diferentes abordagens que podem ser combinadas para obter o resultado desejado. Outras ferramentas podem ser utilizadas, como o ITK-SNAP, que é orientado principalmente para a segmentação de imagens, e uma vez que a ferramenta é dominada, bons resultados podem ser obtidos pelo usuário. Além disso, os autores realizaram um estudo caso-controle demonstrando a alta acurácia e confiabilidade de sua técnica de segmentação manual utilizando o 3D Slicer³⁰, e que a metodologia específica é descrita neste artigo.

Protocol

O presente protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Beth Israel Deaconess Medical Center. Um indivíduo saudável com ressonância magnética do cérebro livre de artefatos ou movimento foi usado para demonstração deste protocolo, e consentimento informado por escrito foi obtido. Um scanner de RM de 3,0 T com bobina de cabeça de 32 canais (ver Tabela de Materiais) foi usado para adquirir imagens 3D-T1 com resolução de 1 mm x 1 mm x 1,2 mm. Utilizou-se a sequência MP-RAGE ASSET com campo de visão de 256 x 256, TR/TE/TI=7,38/3,06/400 ms, e flip angle de 11 graus.

1. Importando ressonância magnética cerebral para 3D Slicer

NOTA: O 3D Slicer fornece documentação relacionada à sua interface de usuário.

1. Prepare os arquivos DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) ou NIFTI (Neuroimaging Informatics Technology Initiative) do cérebro para importação para o 3D Slicer.
2. Importe dados DICOM clicando no botão DCM no canto superior esquerdo da barra de ferramentas. Em seguida, clique no botão Importar arquivos DICOM para importar dados de formato DICOM.
3. Se os dados de ressonância magnética estiverem no formato NIFTI, importe-os clicando no botão DATA no canto superior esquerdo da barra de ferramentas. Na caixa de diálogo pop-up, selecione Escolher diretório para adicionar aos dados NIFTI de importação em lote em uma pasta ou selecione Escolher arquivo(s) para adicionar para importar arquivos NIFTI específicos. Em seguida, clique no botão OK para prosseguir com o upload de dados para a segmentação de dados 3D Slicer.
4. Após a importação, os dados da RM aparecerão na janela à direita exibindo os planos axial, sagital e coronal.
5. Altere o layout das janelas navegando até Layouts e selecionando um layout específico. Isso pode ser encontrado clicando na imagem do módulo Layouts na própria barra de ferramentas do 3D Slicer ou via View > Layouts no menu do aplicativo.

2. Baixando DICOM de dados de amostra no 3D Slicer

1. Clique no botão Baixar dados de exemplo na tela de abertura da seção Bem-vindo à segmentação de dados. Em seguida, selecione o botão MRHead e ele iniciará o processo de download, que pode levar alguns minutos.
2. Certifique-se de que os dados de ressonância magnética do cérebro com planos axiais, sagitais e coronais sejam mostrados na janela direita.

3. Controle de qualidade e ajuste da imagem de RM

1. Determine qualitativamente a qualidade da imagem e a presença de artefatos devido à movimentação da cabeça ou problemas de varredura revisando criticamente cada corte de RM.
2. Amplie a fatia de imagem clicando com o botão direito do mouse e movendo o mouse para cima ou para baixo para reduzir ou ampliar, respectivamente.
3. Para mover a fatia de imagem, clique com o botão esquerdo do mouse na imagem, mantenha pressionada a tecla Shift e arraste o mouse.
4. Ajustar o brilho da imagem pode ajudar na visualização do plexo coroide. Para fazer isso, clique em Ajustar janela/nível de volume na barra de ferramentas ou clique com o botão esquerdo do mouse na imagem e mova o mouse para cima ou para baixo para aumentar ou diminuir o brilho, respectivamente.
5. O ajuste do contraste também pode ajudar a encontrar o plexo coroide. Clique com o botão esquerdo do mouse na fatia da imagem e mova o mouse para a esquerda ou direita para aumentar ou diminuir o contraste, respectivamente. Para determinar o contraste apropriado para o plexo coroide, use os núcleos de substância cinzenta profunda (massas centrais de substância cinzenta dispostas ao redor do ventrículo lateral e do terceiro ventrículo) ou a intensidade de sinal mostrada na barra de escala de contraste.
6. Uma vez selecionado o contraste preferido, mantenha o mesmo contraste ao longo da segmentação e não ajuste para possíveis variações nas regiões supra e infratentoriais.

4. Criação dos segmentos manuais do plexo coroide

1. Para iniciar a segmentação do plexo coroide lateral, terceiro e quarto ventrículos, crie os arquivos de segmentação no módulo Editor de segmento . Para navegar até lá, clique no Editor de Segmentos na barra de ferramentas ou vá para o menu suspenso Módulos: e selecione Editor de Segmentos.
2. Clique no menu suspenso para segmentação para selecionar segmentações diferentes (se várias segmentações foram criadas) e renomear a segmentação selecionada no momento.
3. Use a lista suspensa Volume mestre para escolher quais conjuntos NIFTI ou DICOM precisam de edição. Somente quando o arquivo de volume é selecionado, o usuário pode iniciar a segmentação/edição.
4. Clique no botão Adicionar duas vezes para adicionar dois segmentos para o plexo coroide do ventrículo lateral. Para renomeá-los, clique duas vezes no nome e altere-os para Plexo coroide do ventrículo lateral direito e Plexo coroide do ventrículo lateral esquerdo.
5. Clique no botão Adicionar novamente para adicionar segmentos para o plexo coroide do terceiro e quarto ventrículo e renomeá-los para “Plexo coroide do^3º ventrículo” e “Plexo coroide do^4º ventrículo“.

5. Visualização de diferentes fatias e segmentações

1. Antes de editar, realize um estudo em segundo plano para saber como se mover entre layouts na janela de exibição e como alterar a exibição ou opacidade das segmentações.
2. Na parte superior da janela de visualização e à esquerda do controle deslizante de fatia, clique no ícone de pino. Isso abrirá um menu suspenso, que pode variar dependendo do layout específico em que a janela está.
   NOTA: A utilização de diferentes layouts pode ser útil na segmentação do plexo coroide, uma vez que sua estrutura pode variar entre indivíduos. Por exemplo, o layout ‘Convencional’ permite que o usuário visualize simultaneamente as três fatias e uma visão 3D da cena. Escolher ‘Somente fatia vermelha/amarela/verde’ dá ao usuário uma visão de perto da fatia 2D para permitir uma segmentação mais precisa do plexo coroide.

6. Delineamento das ROIs do plexo coroide do ventrículo lateral

NOTA: O registro de imagem em um modelo não é necessário para segmentação manual.

1. Para o plexo coroide do ventrículo lateral, iniciar no plano axial garantindo que as imagens sejam posicionadas com base na linha bicomissural. Em seguida, utilizar o trigono colateral como ponto de referência para localização do plexo coroide do ventrículo lateral.
   1. Uma vez feitas as edições no plano axial, passe para as demais incidências (sagital e coronal) para garantir que a segmentação manual do plexo coroide do ventrículo lateral não esteja capturando o parênquima cerebral ou o LCR circundante.
2. Para começar a editar, clique no segmento para trabalhar e o nome do segmento ficará em destaque.
3. Clique na ferramenta Pintar ou Desenhar na seção Efeitos do Editor de segmentos para iniciar a segmentação manual.
   NOTA: É melhor começar a segmentação em um plano (coronal, axial ou sagital) e, após a segmentação ter sido concluída em todas as fatias, mover para outros planos para verificar e refinar a segmentação manual. Sugere-se que o usuário inicie pelos planos axial ou coronal, pois o plexo coroide do ventrículo lateral é mais facilmente visualizado nessas incidências.
4. Ao usar a ferramenta Desenhar , clique com o botão esquerdo do mouse e mantenha pressionada a tecla para desenhar um contorno no limite do plexo coroide do ventrículo lateral. Depois de rastreado, clique com o botão direito do mouse para preencher a área desenhada.
5. Ao usar a ferramenta Paint , primeiro selecione o diâmetro do pincel a ser usado para pintura. Um pincel de 3% ou 5% é sugerido para um delineamento mais preciso do plexo coroide, enquanto 10% pode ser útil para seleções maiores.
6. Para qualquer uma das ferramentas, utilize o Paint ou o Erase para corrigir quaisquer delineamentos errados adicionando ou removendo seleções.
   NOTA: Referenciar outros planos de visão pode ajudar a identificar a estrutura do plexo coroide do ventrículo lateral em comparação com outras estruturas cerebrais, como a substância cinzenta circundante, o fórnix, o corpo caloso ou o hipocampo. O usuário é encorajado a excluir varreduras cerebrais que têm cistos do plexo coroide identificados.
7. Utilizar o nível do núcleo vermelho como ponto de referência para interromper a segmentação do plexo coroide nos ventrículos laterais.

7. Delineamento das IROs do terceiro e quarto ventrículos do plexo coroide

NOTA: Imagens T1w de maior resolução (como 0,7 ou 0,8 mm) e aquelas obtidas em uma RM de 7T forneceriam uma segmentação manual mais precisa e confiável do plexo coroide do terceiro e quarto ventrículos. A segmentação do plexo coroide do terceiro e quarto ventrículo é mais difícil do que a do plexo coroide do ventrículo lateral, pois essas regiões podem ser muito menores e com menos voxels para delinear.

1. Para o plexo coroide do terceiro ventrículo, iniciar no plano sagital e utilizar o forame de Monro, fórnix, corpo caloso, tálamo e veia cerebral interna como pontos de referência para identificar o plexo coroide no^3º ventrículo. Mover-se entre cortes dentro do mesmo plano pode ajudar a determinar se uma região é o fórnix, tálamo, veia ou plexo coroide do terceiro ventrículo.
   1. Uma vez feitas as edições no plano sagital, navegue até as demais incidências (axial e coronal) para garantir que a segmentação manual do plexo coroide do terceiro ventrículo não esteja selecionando o parênquima cerebral ou o LCR circundante.
2. Da mesma forma, para o plexo coroide do quarto ventrículo, iniciar no plano sagital e utilizar o pedúnculo cerebelar superior, a ponte e a medula como pontos de referência para identificar o plexo coroide no quarto ventrículo. A movimentação entre cortes dentro de um mesmo plano pode auxiliar na determinação se uma região é o cerebelo, a tonsila cerebelar, o véu medular inferior ou o plexo coroide do^4º ventrículo.
   1. Uma vez concluídas as edições no plano sagital, passe para as demais incidências (axial e coronal) para garantir que a segmentação manual do plexo coroide do quarto ventrículo não esteja selecionando o parênquima cerebral ou o LCR circundante.

8. Cálculo dos volumes do plexo coroide

1. No menu suspenso Módulos , navegue até Quantificação e selecione Estatísticas de segmento.
2. Em Entradas, selecione o novo mapa de segmentação para quantificação na ferramenta Segmentação e escolha o volume de RM no volume escalar. Em Tabela de saída (em Saída), escolha a opção Tabela . Depois de concluído, pressione Aplicar e uma tabela contendo o volume do plexo coroide aparecerá em várias unidades.

9. Salvando os segmentos e resultados de volume

1. Clique no botão Salvar no canto superior esquerdo da barra de ferramentas para salvar os arquivos gerados.
2. Salve os arquivos de segmentação como .nrrd (arquivo de segmentação de dados 3D), .nii.gz (arquivo NIFTI) ou .tsv (arquivo de tabela).

10. Determinação da precisão, desempenho e concordância da segmentação

NOTA: Recomenda-se usar o pacote MONAI (consulte Tabela de Materiais), que descreve o Coeficiente de Dados (DC) e a Distância Média de Superfície do DeepMind (avgSD). Detalhes sobre DC e avgSD são descritos abaixo. Para calcular essas métricas, os leitores precisarão saber como programar (por exemplo, python, ler imagens do disco, reformatar os dados para as matrizes de entrada apropriadas para essas funções). Não há um pacote amigável que inclua todas essas métricas.

1. O escore DC é uma abordagem padrão para quantificar a sobreposição de dois domínios geométricos. Para calcular a pontuação média de DC entre duas segmentações, forneça dois tensores y_pred e y, ou seja, imagens multiquadros com um quadro para cada imagem de rótulo binarizado. Os tensores y_pred e y podem conter segmentações de dois avaliadores manuais diferentes, segmentações repetidas do mesmo avaliador ou previsão automatizada e verdade de solo manual.
   1. Use a função monai.metrics.compute_meandice para calcular o escore médio de DC.
   2. Gere tensores de etiqueta binários adequados com monai.transforms.post.
      Observação : O parâmetro include_background pode ser definido como False para excluir a primeira categoria (índice de canal 0) da computação de DC, que é, por convenção, assumido como um plano de fundo.
2. Considere o escore avgSD menos comum e observe que a abordagem pode diferir à medida que existem várias definições para a distância da superfície. Por exemplo, use a distância máxima (também conhecida como distância de Hausdorff, altamente sensível a outliers), a distância média (como descrito aqui) e o percentil 95 (altamente robusto) como medidas frequentemente usadas.
   1. Use a função compute_average_surface_distance para calcular a pontuação avgSD.
   2. Certifique-se de que essa função calcule a Distância Média da Superfície de y_pred a y na configuração padrão.
   3. Além disso, se simétrico = Verdadeiro, certifique-se de que a distância média simétrica da superfície entre essas duas entradas seja retornada.
3. A análise estatística do escore DC e DP médio em múltiplos casos pode ser realizada usando o robusto teste dos postos sinalizados de Wilcoxon para análise pareada.
4. Considere o uso do coeficiente de correlação intraclasse (CCI) como outro método comumente usado para determinar se vários participantes podem ser classificados de forma confiável por diferentes avaliadores. Lembre-se de que o ICC opera em um conjunto de medidas pareadas (por exemplo, o volume) de segmentações e não diretamente nas imagens de segmentação. Para calcular o ICC, use o software R e o R Studio (consulte Tabela de Materiais), o que torna o processo simples.
   1. Baixe o pacote usando install.packages(“psych”) e carregue a biblioteca(psych).
   2. Insira o quadro de dados, que inclui os participantes (linhas) e um avaliador em cada coluna, usando Data <- data.frame(df). Em seguida, visualize as medições usando gráfico (Dados).
   3. Para executar o ICC, use ICC(Data), que gera uma tabela dos diferentes tipos de ICC, por exemplo, para obter os escores inter ou intra-avaliador.

Representative Results

Discussion

Etapas críticas do protocolo
Três etapas críticas requerem atenção especial na implementação desse protocolo. Primeiro, verificar a qualidade e o contraste das imagens de RM é fundamental para garantir uma segmentação precisa. Se a qualidade da imagem for muito ruim, ou o contraste for muito baixo ou muito alto, isso pode levar ao delineamento impreciso do plexo coroide. O contraste da imagem pode ser ajustado visualizando o valor da escala de cinza da imagem ou calibrando os valores para melhorar o contraste entre os núcleos de substância cinzenta e a substância cinzenta. Em segundo lugar, os avaliadores precisam estar familiarizados com a anatomia do plexo coroide e ter treinamento especializado. Se os avaliadores não estiverem familiarizados com a anatomia do plexo coroide e regiões cerebrais adjacentes, eles podem segmentar o plexo coroide incorretamente, tornando o volume do plexo coroide impreciso. Por fim, é importante avaliar a reprodutibilidade intra e interexaminadores para garantir que os avaliadores que realizam a segmentação manual possam reproduzir a sua própria segmentação do plexo coroide e a de outros avaliadores. Esses números também são altamente relevantes ao validar ferramentas de segmentação automatizadas em um estágio posterior. Além disso, se o conjunto de dados for fixo e se vários avaliadores forem usados para segmentação manual, é recomendável que a mesma configuração de janela seja usada para que os avaliadores estejam olhando para a mesma imagem com o mesmo contraste e brilho. Se a configuração da janela for alterada entre os avaliadores que observam a mesma imagem, a mesma imagem poderá ser segmentada de forma diferente.

Modificações e solução de problemas
Os usuários podem fazer algumas modificações neste protocolo. Primeiro, o tecido do plexo coroide localizado na área do para-septo e a parte ântero-lateral do corno temporal, adjacente ao septo pelúcido, fórnice e hipocampo, podem tornar desafiadora a segmentação do plexo coroide. Para resolver essa dificuldade, sugere-se a realização da segmentação do plexo coroide nas três dimensões, sendo fornecida uma referência (Figura 6) para segmentação do plexo coroide nessas regiões complexas. Em segundo lugar, também é importante saber quando parar a segmentação. Para o plexo coroide nos ventrículos lateral e terceiro, o núcleo vermelho pode ser usado como um ponto de parada, enquanto para o plexo coroide do quarto ventrículo, o forame de Magendie pode ser usado como um ponto de parada. Em terceiro lugar, podem existir desafios na distinção do limite entre o plexo coroide e o LCR na parte póstero-basal dos ventrículos laterais. Para abordar essa preocupação, a intensidade do sinal e considerações anatômicas podem ser usadas para ajudar o avaliador a tomar decisões de segmentação apropriadas. Quarto, se uma imagem de baixa resolução estiver sendo usada, recomenda-se ser mais conservador no procedimento de segmentação e priorizar o uso de imagens contrastadas para validar a segmentação do plexo coroide nessa região temporal. Se a imagem com contraste não estiver disponível, sugere-se excluir essa região do processo de segmentação. No entanto, se uma imagem de alta resolução está sendo usada, então seria recomendado ser mais liberal no procedimento de segmentação. Além disso, se a demarcação entre o plexo coroide e o parênquima cerebral pode ser feita em uma imagem de alta resolução do corno temporal, então uma imagem contrastada não seria necessária. Em quinto lugar, o 3D Slicer pode ser executado em um computador com tela sensível ao toque, onde uma caneta stylus em vez de um mouse pode ser usada para melhorar o rastreamento do plexo coroide. No entanto, este software não está atualmente disponível no iPad. Por fim, problemas de travamento de software podem ser encontrados em alguns computadores quando o plexo coroide de mais de dez indivíduos foi delineado sucessivamente. Nesse caso, clicar no botão Salvar com frequência pode evitar a perda de dados causada pela falha de software.

Limitações
Embora a segmentação manual do plexo coroide seja o padrão-ouro para a obtenção de dados precisos de volume, existem várias limitações relacionadas ao tipo e à qualidade do exame, bem como à experiência do examinador²¹. Por exemplo, o tamanho do plexo coroide pode variar dependendo da idade ou do estado da doença, o que pode afetar o tamanho do ventrículo e do plexo coroide. Assim, o plexo coroide pode parecer pequeno em indivíduos jovens e saudáveis, dificultando a segmentação manual. Esse problema pode ser agravado se a imagem for de resolução mais baixa (isovoxel de 1,2 ou 1,5 mm) e/ou capturada usando um scanner de ressonância magnética de 1,5 T. A segmentação manual do plexo coroide também pode ser afetada pelo brilho e contraste da imagem, dificultando a identificação dos limites, resultando em superou ou subestimação do volume. Além disso, o plexo coroide do terceiro e quarto ventrículo são estruturas pequenas, que podem ser difíceis de segmentar adequadamente se uma imagem de maior resolução não estiver disponível (isovoxel de 0,7 ou 0,8 mm). Uma limitação do uso de um 3D Slicer em vez de outro software de segmentação manual de código aberto é a incapacidade de realizar a segmentação de imagens simultaneamente em três dimensões, um recurso oferecido através do ITK-SNAP⁵¹ que pode melhorar a velocidade de segmentação da imagem do plexo coroide. Além disso, a segmentação manual é uma tarefa demorada e tediosa, tornando impraticável o estudo do plexo coroide em grandes coortes com milhares ou dezenas de milhares de indivíduos, destacando a necessidade de ferramentas precisas de segmentação automática do plexo coroide. Por fim, a simples contagem dos voxels do plexo coroide sem levar em conta os efeitos parciais de volume do LCR ou da substância branca pode introduzir erros na mensuração do volume.

Importância em relação aos métodos existentes
A dependência do FreeSurfer para a segmentação do plexo coroide, que tem baixa acurácia e não segmenta o terceiro e quarto ventrículo do plexo coroide, limita o trabalho fundamental que pode ser realizado para melhor compreender o papel do plexo coroide na saúde e na doença. Além disso, um delineamento mais preciso do plexo coroide também pode ser aproveitado pela comunidade de neuroimagem de Alzheimer para reduzir a contaminação do sinal PET tau temporal medial por ligação fora do alvo no plexo^coroide55. Enquanto as adaptações iniciais de aprendizado de máquina (GMM) e técnicas de aprendizado profundo (3D U-Net, nnU-Net, Axial-MLP 8) para rótulos de plexo coroide melhoraram a precisão de segmentação em rótulos de plexo coroide derivados do FreeSurf46,48,49, os métodos infelizmente são treinados e avaliados apenas em pequenos conjuntos de dados homogêneos, nem ferramentas publicamente disponíveis nem fáceis de usar e incompletos incluindo apenas o plexo coroide dentro dos ventrículos laterais. Uma ressalva é que, no momento da resubmissão desse protocolo, havia um artigo publicado por Yazdan-Panah et al., onde realizaram a segmentação manual do plexo coroide do ventrículo lateral utilizando o ITK-SNAP56. Eles usaram essas imagens segmentadas manualmente para treinar uma U-Net 3D de 2 passos e demonstraram um DC médio de 0,72 com a verdade do solo, e superou as segmentações baseadas em FreeSurfer e FastSurfer⁵⁶. A generalização para outras resoluções, scanners, idades e múltiplas doenças não foi estabelecida e é, de fato, improvável dado o desafio da transferência de domínio.

Aplicações futuras
Devido às limitações apontadas acima, um protocolo para segmentação precisa do plexo coroide é necessário. Além disso, para criar uma ferramenta de segmentação automatizada para o plexo coroide, que pode ser difícil de desenvolver devido à natureza dessa estrutura, é necessário um conjunto abrangente de dados anotados do plexo coroide abrangendo vários parâmetros e combinando-o com um conjunto de inovações metodológicas para o software de código aberto de última geração, o FastSurfer ^42,43, um pipeline de neuroimagem avançado e escalável baseado em aprendizado profundo para segmentação cortical e subcortical automatizada. Foi demonstrado que o FastSurferCNN supera os modelos 3D U-Net, SDNet e QuickNAT para segmentação cortical e subcortical de cerca de 100 estruturas com um DCs médio > 85⁴². Assim, uma grande e abrangente anotação do plexo coroide pode ser usada com o FastSurfer para estender significativamente para (1) uma arquitetura 3D com técnicas de aumento interno aprimoradas, (2) a capacidade de também prever – pela primeira vez – estimativas parciais de volume diretamente, bem como (3) segmentações de saída em resoluções mais altas (super-resolução) para harmonização de dados. Os autores planejam continuar trabalhando na adaptação e desenvolvimento do FastSurfer para criar uma ferramenta de segmentação do plexo coroide altamente precisa para os ventrículos lateral, terceiro e quarto ventrículos e compartilhar o mesmo abertamente com a comunidade de pesquisa.

Materials

3D Slicer	3D Slicer	https://www.slicer.org/	A free, open source software for visualization, processing, segmentation, registration, and analysis of medical, biomedical, and other 3D images and meshes; and planning and navigating image-guided procedures.
FreeSurfer	FreeSurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/	An open source neuroimaging toolkit for processing, analyzing, and visualizing human brain MR images
ITK-SNAP	ITK-SNAP	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php	A free, open-source, multi-platform software application used to segment structures in 3D and 4D biomedical images. 
Monai Package	Monai Consortium	https://docs.monai.io/en/stable/metrics.html	Use for Dice Coefficient and DeepMind average Surface Distance. 
MRI scanner	GE	Discovery MR750 
Psych Package	R-Project	https://cran.r-project.org/web/packages/psych/index.html	A general purpose toolbox developed originally for personality, psychometric theory and experimental psychology.
R Software	R-Project	https://www.r-project.org/	R is a free software environment for statistical computing and graphics. 
RStudio	Posit	https://posit.co/	An RStudio integrated development environment (IDE) is a set of tools built to help you be more productive with R and Python. 
Windows or Apple OS Desktop or Laptop	Any company	n/a	Needed for running the software used in this protocol.