Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.
Abstract
Sojabohnen (Glycine max) sind eine wertvolle Nutzpflanze in der Landwirtschaft, die Tausende von industriellen Anwendungen hat. Sojabohnenwurzeln sind der primäre Ort der Interaktion mit bodenbürtigen Mikroben, die eine Symbiose eingehen, um Stickstoff und Krankheitserreger zu fixieren, was die Erforschung der Sojabohnenwurzelgenetik von größter Bedeutung für die Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktion macht. Die genetische Transformation von Sojabohnenwurzeln (HRs) wird durch den Agrobacterium rhizogenes-Stamm NCPPB2659 (K599) vermittelt und ist ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion in Sojabohnenwurzeln, das von Anfang bis Ende nur 2 Monate dauert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Methode zur Überexpression und zum Ausschalten eines Gens von Interesse in Sojabohnen-HRs beschreibt. Diese Methodik umfasst die Sterilisation von Sojabohnensaatgut, die Infektion von Keimblättern mit K599 sowie die Auswahl und Ernte genetisch transformierter HRs für die RNA-Isolierung und, falls erforderlich, Metabolitenanalysen. Der Durchsatz des Ansatzes reicht aus, um mehrere Gene oder Netzwerke gleichzeitig zu untersuchen und könnte die optimalen Engineering-Strategien bestimmen, bevor man sich auf langfristig stabile Transformationsansätze festlegt.
Introduction
Sojabohnen (Glycine max) gehören zu den wertvollsten Nutzpflanzen in der Landwirtschaft. Es hat Tausende von kommerziellen und industriellen Verwendungszwecken, wie z. B. Lebensmittel, Tierfutter, Öl und als Rohstoffquelle für die Herstellung1. Seine Fähigkeit, eine symbiotische Beziehung mit stickstofffixierenden Bodenmikroorganismen, insbesondere Rhizobien, einzugehen, erhöht die Bedeutung der Untersuchung der Sojabohnengenetikweiter 2. So kann beispielsweise die Feinabstimmung der Stickstofffixierungseigenschaften in Sojabohnenwurzeln zu einer Verringerung der Kohlenstoffemissionen führen und den Bedarf an Stickstoffdünger erheblich senken3. Daher hat das Verständnis der Genetik, die insbesondere Aspekte der Biologie der Sojabohnenwurzel steuert, breite Anwendungen in der Landwirtschaft und Industrie. In Anbetracht dieser Vorteile ist es wichtig, ein zuverlässiges Protokoll zur Analyse der Funktion von Sojabohnengenen zu haben.
Agrobacterium tumefaciens ist vielleicht das am häufigsten verwendete Werkzeug für die genetische Transformation von Pflanzen, da es in der Lage ist, Transfer-DNA (T-DNA) in das Kerngenom vieler Pflanzenarten zu integrieren. Wenn Agrobacterium eine Pflanze infiziert, überträgt es das tumorinduzierende (Ti) Plasmid in das Wirtschromosom, was zur Bildung eines Tumors an der Infektionsstelle führt. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird seit Jahrzehnten häufig für die Genfunktionsanalyse und zur Modifikation von Pflanzenmerkmalen eingesetzt4. Obwohl jedes interessierende Gen durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation leicht in Wirtspflanzenzellen übertragen werden kann, hat diese Methode mehrere Nachteile. Es ist zeitaufwändig, teuer und erfordert für viele Pflanzenarten, wie z. B. Sojabohnen, umfangreiches Fachwissen. Obwohl einige Sojabohnensorten durch den Keimblattknotenansatz unter Verwendung von A. tumefaciens transformiert werden können, erfordert die Ineffizienz dieses Ansatzes die Notwendigkeit einer alternativen genetischen Transformationstechnologie, die schnell und hocheffizient ist 4,5. Auch ein Laie kann diese Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Haarwurzel-Transformationsmethode (HR) anwenden, um diese Nachteile zu überwinden.
Die HR-Transformation ist ein relativ schnelles Werkzeug, nicht nur für die Analyse der Genfunktion, sondern auch für biotechnologische Anwendungen, wie die Herstellung von spezialisierten Metaboliten und Feinchemikalien sowie komplexer bioaktiver Glykoproteine6. Die Herstellung von Sojabohnen-HRs erfordert kein umfangreiches Fachwissen, da sie durch Verwundung der Oberflächen von Keimblättern und anschließender Inokulation mit Agrobacterium rhizogenes7 erzeugt werden können. A. rhizogenes exprimiert Virulenzgene (Vir), die durch sein Ti-Plasmid kodiert werden, das seinen T-DNA-Abschnitt in das Genom von Pflanzenzellen überträgt, trägt und integriert und gleichzeitig das Wachstum der ektopischen Wurzeln stimuliert8.
Im Vergleich zu anderen Genexpressionssystemen für Sojabohnen, wie z. B. der Biolistik oder der A. tumefaciens-basierten Transformation von Gewebe-, Zell- und Organkulturen, weist das HR-Expressionssystem mehrere Vorteile auf. Erstens sind HRs genetisch stabil und werden schnell auf hormonfreien Medien produziert 1,9,10. Darüber hinaus können HRs spezialisierte Metaboliten in Mengen produzieren, die den nativen Wurzeln entsprechen oder diese überschreiten11,12. Diese Vorteile machen HRs zu einem wünschenswerten biotechnologischen Werkzeug für Pflanzenarten, die mit A. tumefaciens nicht kompatibel sind oder die spezielle Gewebekulturbedingungen benötigen, um kompatible Gewebe zu bilden. Die HR-Methode ist ein effizienter Ansatz zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, der subzellulären Lokalisierung von Proteinen, der rekombinanten Proteinproduktion, der Phytoremediation, der Mutagenese und genomweiten Effekten unter Verwendung der RNA-Sequenzierung13,14,15. Es kann auch verwendet werden, um die Produktion spezialisierter Metaboliten zu untersuchen, die in der Industrie von Wert sind, einschließlich Glyceollinen, die die Abwehr von Sojabohnen gegen den wichtigen mikrobiellen Krankheitserreger Phytophthora sojae behandeln und beim Menschen beeindruckende krebshemmende und neuroprotektive Wirkungen haben16,17.
Dieser Bericht demonstriert ein einfaches, effizientes Protokoll zur Herstellung von HRs für Sojabohnen. Im Vergleich zu früheren HR-Transformationsmethoden bietet dieses Protokoll eine signifikante (33%-50%) Verbesserung der HR-Bildung, indem A. rhizogenes-Transformanten vor der Inokulation von Sojabohnen-Keimblättern auf das Vorhandensein des Ti-Plasmids voruntersucht werden. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls, indem wir mehrere binäre Vektoren transformieren, die Sojabohnen-Transkriptionsfaktor-Gene überexprimieren oder stilllegen.
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Protocol
Anmerkungen: Es wird empfohlen, alle weiteren Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen.
1. Sterilisation von Sojabohnensamen
- Legen Sie in einer Biosicherheitswerkbank 16-20 runde Williams 82-Sojabohnensamen in makellosem Zustand (d. h. ohne Risse oder Schönheitsfehler) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 30 ml 70%igen Isopropylalkohol hinzu, schütteln Sie ihn 30 Sekunden lang vorsichtig und dekantieren Sie dann den Alkohol.
- Schütteln Sie die Samen vorsichtig mit 30 ml 10%iger Bleichmittel für 10 s und lassen Sie die Samen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) in der Lösung ruhen. Nach 5 Minuten das Bleichmittel abtropfen lassen.
- Wiederholen Sie das Schütteln dreimal mit 30 ml sterilem hochreinem H2O für 1 Minute pro Spülgang und entsorgen Sie dasH2Ozwischen jedemSpülgang.
- Legen Sie die sterilisierten Samen auf Filterpapier, das mit 5 ml Keimungs- und Cokultivierungsmedium (GC) (Autoklav, halbstarke Flüssigkeit, Murashige- und Skoog [MS]-Medium mit 1% Saccharose [pH = 5,8] getränkt ist, und fügen Sie dann 2,5 ml/l Vitamine) in sterile Petrischalen hinzu.
- Stellen Sie die Platten 3 Tage lang bei RT (25 °C) im Dunkeln, bevor Sie die Platten bei 22 °C unter 16 h kaltweißer T5-Leuchtstoffröhre (100 μE m-2·s-1) für 4 Tage umfüllen, damit die Samen keimen können.
Anmerkungen: Entsorgen Sie zerknitterte oder rissige Samen. Die besten Samen sind diejenigen, die groß und gleichmäßig gelb sind. Sterilisieren Sie mindestens die doppelte Anzahl von Samen, die für das Experiment erforderlich sind, um Samen von guter Qualität auszuwählen, da einige Samen aufgrund von Schäden, Krankheiten oder Nichtkeimung möglicherweise nicht optimal sind.
2. Infektion der Keimblätter mit K599
HINWEIS: Verwenden Sie Vektoren der pGWB-Serie, da deren duale Selektion die genomische Integration der gesamten T-DNA-Kassette gewährleistet. Mittels Elektroporation wurde ein binärer Vektor, der das interessierende Gen enthält , in A. rhizogenes pRi2659 umgewandelt18.
- Basierend auf der Sequenz des Plasmids18 von A. rhizogenes pRi2659 wurden Primer zum Nachweis des Ti-Plasmidgens VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 umgekehrt: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Erwartete Verstärkungsgröße: 221 bp). Nach der Transformation werden die Agrobacterium-Kolonien mit einem PCR-Kit auf die Retention von VirD2 mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) getestet (siehe Materialtabelle). PCR-Zyklus: 94 °C für 3 min; 35 Zyklen (94 °C für 1 Minute, 58 °C für 30 Sek., 72 °C für 1 Minute); und 72 °C für 10 min.
- Nach der Auswahl der A. rhizogenes-Kolonie , die sowohl VirD2 als auch das interessierende Gen (GOI) enthält, werden einige Platten auf Luria-Bertani (LB)-Platten, die die entsprechenden Antibiotika (50 mg/L) für das interessierende Plasmid enthalten, gestreift und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Wenn Sie Spectinomycin verwenden, fügen Sie eine Konzentration von 100 mg/l hinzu.
- Verwenden Sie eine P200-Pipettenspitze, um eine ~1,5 cm lange Länge des K599 Agrobacterium von den LB-Platten abzukratzen, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Phosphatpuffer (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Das Agrobakterium wird in sterilisiertem, hochreinemH2O(v/v = 1:1) und Acetosyringon (AS; 100 mM Vorrat an Dimethylsulfoxid [DMSO], v/v = 1:1000) verdünnt. Messen Sie die Absorption mit einer Küvettenröhre bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD600). Der erwartete optimale Bereich liegt zwischen 0,5 und 0,8.
- Tauchen Sie in einer Biosicherheitswerkbank ein sterilisiertes Skalpell in die K599 Agrobacterium-Lösung und machen Sie mehrere 1 mm tiefe Schnitte entlang der Innenfläche (adaxial, flache Seite) des Keimblatts. Verwenden Sie während der Impfung eine sterilisierte Pinzette, um das Keimblatt zu stabilisieren.
- Legen Sie etwa 6-8 Keimblätter mit der Schnittseite nach unten auf eine Petrischale mit Filterpapier, das mit GC-Medium mit AS getränkt ist.
Anmerkungen: Für die Herstellung von 6 Platten sind 50 ml GC-Medium und 50 μl 100 mM AS ausreichend, um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. - Inkubieren Sie die Platten bei RT (25 °C) für 3 Tage unter einer 16-stündigen Photoperiode (~65 μE).
- Übertragen Sie die infizierten Keimblätter auf haarige Wurzelwachstumsplatten (HRG) (Autoklav halbstarke MS mit 3% Saccharose [pH = 5,8] und 2,6 g/L Gelzan, dann 2,5 ml/l Vitaminmischung und 500 mg/L Timentin).
HINWEIS: Es gab einige Probleme mit Timentin von einigen alternativen Anbietern, von denen der K599 nicht beseitigt wurde. Es wird empfohlen, höhere Petrischalen (100 mm x 25 mm) für HRG-Medium zu verwenden. - Inkubieren Sie die HRG-Platten bei 22 °C in einer Wachstumskammer mit den Parametern auf 100 μE Licht bei einer 16-stündigen Photoperiode, bis Primärwurzeln mit Sekundärwurzeln von 2-3 cm Länge beobachtet werden (~3-4 Wochen).
3. Auswahl und Ernte von HRs
- Ernten Sie Primärwurzeln (5-7 cm lang), die aus der Hornhaut wachsen und Sekundärwurzeln (2-3 cm lang) enthalten, mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette. Übertragen Sie auf ausgewählte HRG-Platten, die die entsprechenden Antibiotika enthalten. Lassen Sie die HRs noch 5 Tage auf den ausgewählten HRG-Platten wachsen.
HINWEIS: Kanamycin (50 mg/l), Hygromycin (50 mg/l) oder Phosphinothricin (10 mg/l) werden in der Regel zur Auswahl verwendet. Für Expressionsvektoren wird pGWB2 für die Überexpression, pANDA35HK für das RNAi-Silencing, pGWB6 für die subzelluläre Lokalisation und pMDC7 für die induzierbare Expression verwendet. - Ernten Sie an Tag 5 transgene HRs mit Sekundärwurzeln von 3-6 cm Länge. Bei der Beobachtung fluoreszierender Proteine weisen die Sekundärwurzeln wenig Autofluoreszenz auf. Wenn Sie Elizitor oder chemische Behandlungen durchführen, schneiden Sie die Sekundärwurzeln in 1 cm große Stücke und legen Sie ~100 mg auf HRG-Agar auf einen Haufen. Tränken Sie dann die Stapel mit 80 μl der entsprechenden Behandlung und lassen Sie die Platten bei RT (25 °C) inkubieren.
- Fahren Sie nach der gewünschten Behandlungszeit mit der Extraktion von RNA oder Metaboliten fort.
- Für RNA tupfen Sie die Wurzeln schnell auf einem sterilisierten Papiertuch trocken und ernten Sie sie direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Versiegeln Sie die Oberseite der Tube sofort mit Parafilm, bohren Sie zwei kleine Löcher mit einer spitzen Pinzette und tauchen Sie die Röhren in flüssigen Stickstoff. 3 Tage gefriertrocknen, dann die Proben bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Es ist wichtig, HRs auszuwählen, die weiß sind. Nach 5 Tagen Wachstum auf der selektiven Platte bleiben transgene HRs weiß, aber nicht-transgene Wurzeln werden braun.
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Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus den veröffentlichten Daten19,20. Die Ergebnisse der Kolonie-PCR (cPCR) des transformierten K599 Agrobacterium sind in Abbildung 1 dargestellt. Wie die positiven Kolonien in Abbildung 1 zeigen, wurde das interessierende Gen mittels cPCR nachgewiesen (Abbildung 1A). Ein Drittel bis die Hälfte der Kolonien waren jedoch negativ für das VirD2-Gen-Screening (Abbildung 1B), was auf den Verlust des Ti-Plasmids hindeutet, und wären nicht in der Lage, Hornhaut oder Haarwurzeln zu erzeugen. Abbildung 2 veranschaulicht den gesamten Aufbereitungsprozess von Sojabohnen-HRs und die Genexpressionsanalyse. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GFP-GmJAZ1-6. Abbildung 4 zeigt eine Genexpressionsanalyse, die die Überexpression des Glyceollin-Transkriptionsfaktors GmHSF6-1 und das RNAi-Silencing von GmMYB29A2 in Williams 82 Haarwurzeln zeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden in mehreren neueren Berichten erzielt20,21.
Abbildung 1: Kolonie-PCR (cPCR) des K599 Agrobakteriums unter Verwendung von Kolonie-PCR-Primern des interessierenden Gens oder VirD2. (A) Gen von Interesse cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abkürzungen: C = Kolonie; +ve = Positivkontrolle; -ve = Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Überblick über die Sojabohnen-Haarwurzelkultur (HR) und das Verfahren zur Analyse der Genfunktion. Schwielen bildeten sich 2 Wochen nach der Infektion mit K599 Agrobacterium an der Wundstelle. Die Zelldifferenzierung erfolgte nach 1 Woche, dann verstrich 1 Woche für die HR-Verlängerung. Es folgte die HR-Ernte und der Wandglucan-Elizitor (WGE)/Probebehandlung für 24 Stunden. Die HRs wurden einer Metabolitenextraktion für die Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC)-Analyse bzw. RNA-Isolierung für die Genexpressionsanalyse unterzogen. WGE ist der Wandglucan-Auslöser aus Phytophthora sojae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopie von GmJAZ1-6 translational fusioniert mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) in transgenen Williams 82 Haarwurzeln. (A) Grüner Kanal (GFP). (B) Blauer Kanal (DAPI). (C) Zusammenführung von grünen und blauen Kanälen. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Zeiss-Mikroskop aufgenommen. DAPI-Bilder (6 μg/ml) deuten auf eine Kernfärbung hin. Die Maßstabsbalken sind 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Genexpressionsanalyse. (A) Genexpression bei Überexpression von GmHSF6-119 Williams 82 Sojabohnen-HRs unter 24-h-Probebehandlung oder 24-h-Induktion mit WGE. (B) Genexpression in RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 Sojabohnen HRs, die für 24 h mit WGE induziert wurden. WGE ist der Wandglucan-Auslöser aus Phytophthora sojae. einSignifikant größer und bsignifikant kleiner als die Kontrollgruppe, t-Test der gepaarten Studierenden (p < 0,01). Fehlerbalken repräsentieren SE (n ≥ 3 biologische Replikate). Sekundärwurzeln, die von einer Primärwurzel gesammelt wurden, deuteten auf ein biologisches Replikat hin. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Lin et al.19 und Jahan et al.20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In den letzten zehn Jahren wurde die HR-Methode der Sojabohne als leistungsfähiges Werkzeug entwickelt, um Gene zu untersuchen, die an der Stickstofffixierung 22,23, der biotischen und abiotischen Stresstoleranz 24,25 und den Biosynthesewegen von Metaboliten beteiligt sind 26,27. Das Wissen darüber, wie Pflanzen Metaboliten produzieren, hat eine Fülle von Vorteilen für die landwirtschaftliche Produktion und die pharmazeutische Industrie, da es zur Untersuchung von Gennetzwerken genutzt werden kann, die an der Vermittlung biochemischer Abwehrkräfte gegen Krankheitserreger beteiligt sind28.
Um Produktivität und Kosteneffizienz in den Vordergrund zu stellen, vereinfacht dieses Protokoll das Verfahren. Anstatt beispielsweise teurere feste Medien zu verwenden, die ein Geliermittel enthalten, werden Sojabohnensamen unter sterilen Bedingungen mit industrietauglichen Papiertüchern gekeimt, die mit flüssigem Wachstumsmedium getränkt sind. Aseptische Labortechniken und die Aufrechterhaltung steriler Arbeitsbedingungen sind für HR-Transformationsexperimente unerlässlich, da eine Vielzahl von Mikroorganismen wie Pilze und Hefen eine Kontamination von In-vitro-Kulturen verursachen können.
Darüber hinaus ist die Verwendung der richtigen Lichtintensität und Photoperiode entscheidend für die HR-Kultur. Der Wachstums- und Entwicklungsprozess von Pflanzen in In-vitro-Kulturen wird maßgeblich von der Qualität der Lichtintensität und der Photoperiode beeinflusst, wie in verschiedenen früheren Studien beobachtet wurde. Wenn die Lichtintensität entweder zu niedrig oder zu hoch ist, kann dies den Prozess der Wurzelinduktion verlangsamen. Wenn die Photoperiode ungeeignet ist, kann sie ebenfalls zum Versagen der Kallusbildung und der differenzierten Zellentwicklung führen29. Darüber hinaus sind nicht-transgene HRs nach unseren früheren Experimenten resistent gegen Kanamycin (50 mg/L), wenn sie als alleiniges Antibiotikum verwendet werden. Aus diesem Grund verwenden wir typischerweise Vektoren, die für eine duale Resistenz für Hygromycin und Kanamycin kodieren. Unter dieser stringenten Selektion sind wir in der Lage, eine positive transgene HR-Rate von 15%-30% der gesamten Wurzeln zu erhalten, aber ~80% dieser HRs haben signifikant überexprimierte/stillgelegte Gene, die von den Vektoren kodiert werden.
Um den Erfolg von HR-Transformationsexperimenten sicherzustellen, ist es von entscheidender Bedeutung zu testen, ob der im Experiment verwendete A. rhizogenes-Stamm das Ti-Plasmid beibehält, das für Virulenzgene kodiert. Die Anwesenheit des Ti-Plasmids ist für die erfolgreiche Integration der T-DNA in das Pflanzengenomnotwendig 4. Die Verwendung von cPCR zum Nachweis des Ti-Plasmids ist zu einem wesentlichen Schritt in diesem Protokoll geworden. In der Vergangenheit haben wir festgestellt, dass 33%-50% unserer Transformationen keine Calli und Wurzeln hervorbringen würden. Unwissentlich war dies auf den Verlust des Ti-Plasmids während der Transformation oder anschließenden Kultivierung von A. rhizogenes zurückzuführen. Durch die PCR-Analyse der Agrobacterium-Kolonien nach ihrer Transformation stellen wir nun sicher, dass das Ti-Plasmid vorhanden ist und dass 100% der Transformationsexperimente Wurzeln produzieren. Die Verwendung von cPCR in diesem Protokoll hat sich als wertvolle Ergänzung zum Standardverfahren der HR-Transformation erwiesen. Es hat die Anzahl der fehlgeschlagenen Experimente reduziert und dadurch sowohl Zeit als auch Ressourcen gespart. Der cPCR-Schritt hat es uns auch ermöglicht, zu bestätigen, dass der Transformationsprozess wie vorgesehen funktioniert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse der Experimente zuverlässig und reproduzierbar sind.
Nichtsdestotrotz hat diese vereinfachte Methode einige Einschränkungen. Mit diesem Protokoll können beispielsweise grundlegende zellbiologische Fragen zu Genfunktionen in transgenen HRs beantwortet werden. Fragen, die sich auf andere Pflanzengewebe beziehen, wie z. B. Triebe und Blätter, können jedoch möglicherweise nicht in HRs getestet werden. Es ist immer wichtig zu bestätigen, dass der untersuchte Prozess nicht durch den Spiegel der ektopischen Hormone oder andere Faktoren beeinflusst wird, die durch A. rhizogenes eingeschleppt werden. Forscher sollten ihre Grenzen zur Kenntnis nehmen und Experimente sorgfältig planen, um genaue und aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll eine hocheffiziente Methode zur Untersuchung der Genfunktion in Sojabohnenwurzeln ist. Wir haben kürzlich seinen Wert bei der Untersuchung von Multigen-Engineering-Ansätzen und dem Verständnis von Gennetzwerken gezeigt, die an der Regulierung der biochemischen Abwehr von Sojabohnen beteiligt sind19. Die relative Effizienz des Ansatzes macht ihn ideal für die Beantwortung komplexer Fragen in der Pflanzenbiologie, die die Untersuchung zahlreicher Gene erfordern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) mit der Fördernummer RGPIN-2020-06111 und durch eine großzügige Spende von Brad Lace finanziert. Wir danken Wayne Parrott (University of Georgia) für das K599 Agrobacterium und das vorläufige Protokoll sowie dem Labor Nakagawa & Hachiya (Shimane University) für die leeren Vektoren pGWB2, pGWB6 und pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
References
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