Summary
यहां, हम ट्रांसजेनिक सोयाबीन बालों की जड़ों के उच्च दक्षता उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स) कृषि में एक मूल्यवान फसल है जिसके हजारों औद्योगिक उपयोग हैं। सोयाबीन की जड़ें मिट्टी से उत्पन्न रोगाणुओं के साथ बातचीत की प्राथमिक साइट हैं जो नाइट्रोजन और रोगजनकों को ठीक करने के लिए सहजीवन बनाती हैं, जो सोयाबीन रूट जेनेटिक्स से जुड़े अनुसंधान को अपने कृषि उत्पादन में सुधार के लिए प्रमुख महत्व देती हैं। सोयाबीन बालों वाली जड़ों (एचआर) के आनुवंशिक परिवर्तन को एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस स्ट्रेन NCPPB2659 (K599) द्वारा मध्यस्थ किया जाता है और सोयाबीन की जड़ों में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक कुशल उपकरण है, जिसमें शुरू से अंत तक केवल 2 महीने लगते हैं। यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो सोयाबीन एचआर में रुचि के जीन को अतिरंजित करने और चुप कराने की विधि को रेखांकित करता है। इस पद्धति में सोयाबीन के बीज नसबंदी, के 599 के साथ कोटिलेडोन का संक्रमण, और आरएनए अलगाव के लिए आनुवंशिक रूप से रूपांतरित एचआर का चयन और कटाई और यदि आवश्यक हो, मेटाबोलाइट विश्लेषण शामिल हैं। दृष्टिकोण का थ्रूपुट एक साथ कई जीनों या नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त है और दीर्घकालिक स्थिर परिवर्तन दृष्टिकोण के लिए प्रतिबद्ध होने से पहले इष्टतम इंजीनियरिंग रणनीतियों को निर्धारित कर सकता है।
Introduction
सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स) कृषि में सबसे मूल्यवान फसलों में से एक है। इसके हजारों वाणिज्यिक और औद्योगिक उपयोग हैं, जैसे कि भोजन, पशु फ़ीड, तेल,और विनिर्माण के लिए कच्चे माल के स्रोत के रूप में। नाइट्रोजन-फिक्सिंग मिट्टी के सूक्ष्मजीवों के साथ सहजीवी संबंध बनाने की इसकी क्षमता, अर्थात् राइजोबिया, सोयाबीन आनुवंशिकी2 का अध्ययन करने के महत्व को और बढ़ाती है। उदाहरण के लिए, सोयाबीन की जड़ों में नाइट्रोजन निर्धारण गुणों को ठीक करने से कार्बन उत्सर्जन में कमी आ सकती है और नाइट्रोजन उर्वरक3 के लिए आवश्यकताओं को बहुत कम किया जा सकता है। इस प्रकार, आनुवंशिकी को समझना जो सोयाबीन जड़ जीव विज्ञान के पहलुओं को नियंत्रित करता है, विशेष रूप से, कृषि और उद्योग में व्यापक अनुप्रयोग हैं। इन लाभों को ध्यान में रखते हुए, सोयाबीन जीन के कार्य का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल होना महत्वपूर्ण है।
एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स शायद पौधे आनुवंशिक परिवर्तन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण है क्योंकि इसमें कई पौधों की प्रजातियों के परमाणु जीनोम में ट्रांसफर डीएनए (टी-डीएनए) को एकीकृत करने की क्षमता है। जब एग्रोबैक्टीरियम एक पौधे को संक्रमित करता है, तो यह ट्यूमर-उत्प्रेरण (टीआई) प्लास्मिड को मेजबान गुणसूत्र में स्थानांतरित करता है, जिससे संक्रमण स्थल पर ट्यूमर का निर्माण होता है। एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन का व्यापक रूप से जीन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए और फसल लक्षणों को संशोधित करने के लिए दशकों से उपयोग किया जाताहै। यद्यपि रुचि के किसी भी जीन को ए. ट्यूमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम से मेजबान पौधों की कोशिकाओं में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है, इस विधि में कई कमियां हैं; यह समय लेने वाला, महंगा है, और सोयाबीन जैसे कई पौधों की प्रजातियों के लिए व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। यद्यपि सोयाबीन की कुछ किस्मों को ए ट्यूमेफेसिएन्स का उपयोग करके कोटिलेडोनेरी नोड दृष्टिकोण द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण की अक्षमता एक वैकल्पिक आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक की आवश्यकता है जो तेजी से और अत्यधिक कुशलहै 4,5। यहां तक कि एक गैर-विशेषज्ञ इन नुकसानों को दूर करने के लिए इस एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ (एचआर) परिवर्तन विधि का उपयोग कर सकता है।
एचआर परिवर्तन एक अपेक्षाकृत तेज़ उपकरण है, न केवल जीन फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए, बल्कि जैव-तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए भी, जैसे कि विशेष मेटाबोलाइट्स और ठीक रसायनों का उत्पादन, और जटिल बायोएक्टिव ग्लाइकोप्रोटीन6। सोयाबीन एचआर के उत्पादन के लिए व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि वे कोटिलेडॉन की सतहों को घायल करके उत्पन्न किए जा सकते हैं, इसके बाद एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स7 के साथ टीकाकरण किया जाता है। राइजोजेनेस अपने टीआई प्लास्मिड द्वारा एन्कोड किए गए विषाणु (वीर) जीन को व्यक्त करता है जो अपने टी-डीएनए खंड को पौधे की कोशिकाओं के जीनोम में स्थानांतरित, ले जाता है और एकीकृत करता है, जबकि एक साथ अस्थानिकजड़ विकास को उत्तेजित करता है।
अन्य सोयाबीन जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में, जैसे कि बायोलिस्टिक्स या ए ट्यूमेफेसिएन्स-आधारित ऊतक, कोशिका और अंग संस्कृति का परिवर्तन, एचआर अभिव्यक्ति प्रणाली कई फायदे प्रदर्शित करती है। सबसे पहले, एचआर आनुवंशिक रूप से स्थिर होते हैं और हार्मोन-मुक्त मीडिया 1,9,10 पर जल्दी से उत्पादित होते हैं। इसके अतिरिक्त, एचआर मूल जड़ों11,12 के बराबर या उससे अधिक मात्रा में विशेष मेटाबोलाइट्स का उत्पादन कर सकते हैं। ये फायदे एचआर को पौधों की प्रजातियों के लिए एक वांछनीय जैव प्रौद्योगिकी उपकरण बनाते हैं जो ए ट्यूमेफेसिएन्स के साथ असंगत हैं या जिन्हें संगत ऊतकों को बनाने के लिए विशेष ऊतक संवर्धन स्थितियों की आवश्यकता होती है। एचआर विधि आरएनए अनुक्रमण13,14,15 का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण, पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन, फाइटोरेमेडिएशन, म्यूटेनेसिस और जीनोम व्यापक प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है। इसका उपयोग विशेष मेटाबोलाइट्स के उत्पादन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जिनका उद्योग में मूल्य है, जिसमें ग्लाइकोलिन शामिल हैं, जो महत्वपूर्ण माइक्रोबियल रोगज़नक़ फाइटोफ्थोरा सोजा के खिलाफ सोयाबीन की रक्षा को दवा देते हैंऔर मनुष्यों में प्रभावशाली एंटीकैंसर और न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियां हैं।
यह रिपोर्ट सोयाबीन एचआर का उत्पादन करने के लिए एक आसान, कुशल प्रोटोकॉल प्रदर्शित करती है। पिछले एचआर परिवर्तन विधियों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल सोयाबीन कोटिलेडोन को इंजेक्ट करने से पहले टीआई प्लास्मिड की उपस्थिति के लिए ए राइजोजेन्स ट्रांसफॉर्मेंट्स की प्रीस्क्रीनिंग करके एचआर गठन की दर में एक महत्वपूर्ण (33% -50%) सुधार प्रदान करता है। हम कई बाइनरी वैक्टर को बदलकर इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का प्रदर्शन करते हैं जो सोयाबीन प्रतिलेखन कारक जीन को ओवरएक्सप्रेस या चुप करते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि सभी आगे के कदम बाँझ परिस्थितियों में आयोजित किए जाएं।
1. सोयाबीन के बीज की नसबंदी
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्राचीन स्थिति (यानी, कोई दरार या दोष नहीं) में 16-20 राउंड विलियम्स 82 सोयाबीन बीज रखें।
- 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 30 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे से 30 सेकंड के लिए हिलाएं, और फिर अल्कोहल को हटा दें।
- 10 सेकंड के लिए 10% ब्लीच के 30 मिलीलीटर के साथ बीज को धीरे से हिलाएं और बीज को कमरे के तापमान (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए घोल में बैठने दें। 5 मिनट के बाद, ब्लीच को छान लें।
- 30 मिलीलीटर बाँझ अल्ट्राप्योर एच 2 ओ के साथ 1 मिनट प्रति कुल्ला के लिए तीन बार हिलाएं और प्रत्येक कुल्ला के बीच एच2ओ को छोड़ दें।
- निष्फल बीजों को 5 मिलीलीटर अंकुरण और सह-खेती (जीसी) माध्यम (आटोक्लेव आधी ताकत वाले तरल मुराशिगे और स्कूग [एमएस] माध्यम के साथ 1% सुक्रोज [पीएच = 5.8] के साथ संतृप्त फिल्टर पेपर पर रखें और फिर बाँझ पेट्री व्यंजनों में 2.5 एमएल / एल विटामिन जोड़ें।
- बीजों को अंकुरित होने की अनुमति देने के लिए प्लेटों को 4 दिनों के लिए 16 घंटे शांत-सफेद टी 5 फ्लोरोसेंट लाइट्स (100 μE m-2.s-1) के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर 22 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करने से पहले 3 दिनों के लिए आरटी (25 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में प्लेटों को रखें।
नोट: झुर्रीदार या फटे हुए बीज को छोड़ दें। सबसे अच्छे बीज वे हैं जो बड़े और समान रूप से पीले होते हैं। अच्छी गुणवत्ता के बीजों का चयन करने के लिए प्रयोग के लिए आवश्यक बीजों की कम से कम दोगुनी संख्या को निष्फल करें, क्योंकि कुछ बीज क्षति, बीमारियों या अंकुरित होने में विफलता के कारण इष्टतम नहीं हो सकते हैं।
2. K599 के साथ कोटिलेडोन का संक्रमण
नोट: पीजीडब्ल्यूबी श्रृंखला वैक्टर का उपयोग करें, क्योंकि उनका दोहरा चयन पूरे टी-डीएनए कैसेट के जीनोमिक एकीकरण को सुनिश्चित करता है। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग एक द्विआधारी वेक्टर को बदलने के लिए किया गया था जो रुचि के जीन को ए राइजोजेनेस पीआरआई 265918 में बदल देता है।
- राइजोजेनेस पीआरआई 2659 प्लास्मिड18 के अनुक्रम के आधार पर, टीआई प्लास्मिड जीन वीआरडी 2 (वीआरडी 2 आगे: 5'-सीसीसीजीएटीसीजीटीसीएएजीटीएटीएटी -3' का पता लगाने के लिए प्राइमरों को डिजाइन करें; VirD2 रिवर्स: 5'-TCGTCTGGCTCTCTCTCTCTCGT-3'; अपेक्षित प्रवर्धन आकार: 221 बीपी)। परिवर्तन के बाद, पीसीआर किट का उपयोग करके पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा वीआरडी 2 के प्रतिधारण के लिए एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनियों का परीक्षण करें (सामग्री की तालिका देखें)। पीसीआर चक्र: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 35 चक्र (1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
- राइजोजेनेस कॉलोनी के चयन के बाद, जिसमें विरडी 2 और जीन ऑफ इंटरेस्ट (जीओआई) दोनों शामिल हैं, कुछ को लुरिया-बर्टानी (एलबी) मध्यम प्लेटों पर खींचें जिनमें रुचि के प्लास्मिड के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक्स (50 मिलीग्राम / एल) होते हैं और रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं। यदि स्पेक्टिनोमाइसिन का उपयोग कर रहे हैं, तो 100 मिलीग्राम / एल की एकाग्रता जोड़ें।
- एलबी प्लेटों से K599 एग्रोबैक्टीरियम की ~ 1.5 सेमी लंबाई को खुरचने के लिए पी 200 पिपेट टिप का उपयोग करें और फॉस्फेट बफर के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (पीबी; 0.01 एम एनए2एचपीओ4, 0.15 एम एनएसीएल, पीएच 7.5)।
- एग्रोबैक्टीरियम को निष्फल, अल्ट्राप्योर एच2ओ (वी / वी = 1: 1) और एसिटोसाइरिंगोन (एएस; डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ] में 100 एमएम स्टॉक, वी / वी = 1: 1000) में पतला करें। 600 एनएम (ओडी 600) के ऑप्टिकल घनत्व पर एक क्यूवेट ट्यूब का उपयोग करके अवशोषण को मापें। अपेक्षित इष्टतम सीमा 0.5 और 0.8 के बीच है।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, K599 Agroबैक्टीरियम समाधान में एक निष्फल स्केलपेल डुबोएं और कोटिलेडॉन की आंतरिक सतह (अक्षीय, सपाट पक्ष) के साथ कई 1 मिमी गहरे कट बनाएं। टीकाकरण के दौरान, कोटिलेडॉन को स्थिर करने के लिए निष्फल बल का उपयोग करें।
- एएस के साथ जीसी माध्यम से संतृप्त फिल्टर पेपर युक्त पेट्री डिश पर लगभग 6-8 कोटिलेडॉन को साइड-डाउन रखें।
नोट: 6 प्लेटों को तैयार करने के लिए, 100 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए GC माध्यम का 50 mL और 100 mM AS का 50 μL पर्याप्त है। - 16 घंटे की फोटोअवधि (~ 65 μE) के तहत 3 दिनों के लिए RT (25 °C) पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
- संक्रमित कोटिलेडोन को बालों की जड़ वृद्धि (एचआरजी) प्लेटों (3% सुक्रोज [पीएच = 5.8] और 2.6 ग्राम / एल गेलज़न के साथ आटोक्लेव आधी ताकत वाले एमएस, फिर 2.5 एमएल / एल विटामिन मिश्रण और 500 मिलीग्राम / एल टाइमेंटिन जोड़ें) में स्थानांतरित करें।
नोट: कुछ वैकल्पिक विक्रेताओं से टाइमेंटिन के साथ कुछ समस्याएं थीं, जिनमें से K599 को समाप्त नहीं किया गया था। एचआरजी माध्यम के लिए लंबे पेट्री डिश प्लेट्स (100 मिमी x 25 मिमी) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। - एचआरजी प्लेटों को एक विकास कक्ष में 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिसमें पैरामीटर 16 घंटे की फोटोअवधि पर 100 μE प्रकाश पर सेट होते हैं जब तक कि द्वितीयक जड़ों वाली प्राथमिक जड़ें 2-3 सेमी लंबाई (~ 3-4 सप्ताह) नहीं देखी जाती हैं।
3. एचआर का चयन और कटाई
- प्राथमिक जड़ों (लंबाई में 5-7 सेमी) की कटाई करें जो कैलस से बढ़ती हैं और इसमें बाँझ स्केलपेल और फोर्सप्स का उपयोग करके द्वितीयक जड़ें (लंबाई में 2-3 सेमी) होती हैं। उचित एंटीबायोटिक दवाओं वाले एचआरजी प्लेटों के चयन में स्थानांतरित करें। एचआरजी प्लेटों के चयन पर एचआर को 5 और दिनों के लिए बढ़ने दें।
नोट: कानामाइसिन (50 मिलीग्राम / एल), हाइग्रोमाइसिन (50 मिलीग्राम / एल), या फॉस्फीनोथ्रिसिन (10 मिलीग्राम / एल) आमतौर पर चयन के लिए उपयोग किया जाता है। अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए, pGWB2 का उपयोग ओवरएक्प्रेशन के लिए किया जाता है, pANDA35HK का उपयोग RNAI साइलेंसिंग के लिए किया जाता है, pGWB6 का उपयोग उपकोशिकीय स्थानीयकरण के लिए किया जाता है, और pMDC7 का उपयोग इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति के लिए किया जाता है। - 5 वें दिन, द्वितीयक जड़ों की लंबाई 3-6 सेमी के साथ ट्रांसजेनिक एचआर की कटाई करें। यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का अवलोकन किया जाता है, तो द्वितीयक जड़ों में थोड़ा ऑटोफ्लोरेसेंस होता है। यदि रासायनिक उपचार कर रहे हैं, तो द्वितीयक जड़ों को 1 सेमी टुकड़ों में काट लें और एक ढेर में एचआरजी एगर पर ~ 100 मिलीग्राम रखें। फिर, उचित उपचार के 80 μL के साथ बवासीर को संतृप्त करें और प्लेटों को RT (25 ° C) पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
- वांछित उपचार समय के बाद, आरएनए या मेटाबोलाइट निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें।
- आरएनए के लिए, तेजी से जड़ों को एक निष्फल पेपर तौलिया पर सूखते हैं और उन्हें सीधे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में काटते हैं।
- पैराफिल्म का उपयोग करके ट्यूब के शीर्ष को तुरंत सील करें, नुकीले बल का उपयोग करके दो छोटे छेद बनाएं, और ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में डुबोएं। 3 दिनों के लिए लियोफिलाइज करें, फिर नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: सफेद एचआर का चयन करना आवश्यक है। चयनात्मक प्लेट पर 5 दिनों के विकास के बाद, ट्रांसजेनिक एचआर सफेद रहेंगे, लेकिन गैर-ट्रांसजेनिक जड़ें भूरे रंग की हो जाएंगी।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रतिनिधि परिणाम प्रकाशित डेटा19,20 से हैं। रूपांतरित K599 Agrobacterium के कॉलोनी पीसीआर (cPCR) परिणाम चित्र 1 में दिखाए गए हैं। जैसा कि चित्र 1 में सकारात्मक कालोनियों द्वारा इंगित किया गया है, सीपीसीआर (चित्रा 1 ए) द्वारा रुचि के जीन का पता लगाया गया था। हालांकि, एक-तिहाई से एक-आधे उपनिवेश विरडी 2 जीन स्क्रीनिंग (चित्रा 1 बी) के लिए नकारात्मक थे, जो टीआई प्लास्मिड के नुकसान का संकेत देते हैं, और कैलस या बालों वाली जड़ों को उत्पन्न करने में असमर्थ होंगे। चित्रा 2 सोयाबीन एचआर और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की समग्र तैयारी प्रक्रिया को दर्शाता है। चित्रा 3 जीएफपी-जीएमजेएजेड 1-6 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को दर्शाता है। चित्रा 4 एक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण है जो विलियम्स 82 बालों वाली जड़ों में ग्लाइसेलिन प्रतिलेखन कारक जीएमएचएसएफ 6-1 और जीएमएमवाईबी 29 ए 2 के आरएनएआई-साइलेंसिंग को दर्शाता है। इसी तरह के परिणाम कई हालिया रिपोर्टों20,21 में प्राप्त किए गए हैं।
चित्रा 1: के599 एग्रोबैक्टीरियम की कॉलोनी पीसीआर (सीपीसीआर) जीन ऑफ इंटरेस्ट या वीआरडी 2 के कॉलोनी पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करके। (ए) ब्याज का जीन सीपीसीआर (बी) वीआरडी 2 सीपीसीआर। संक्षेप: सी = कॉलोनी; +वे = सकारात्मक नियंत्रण; -वे = नकारात्मक नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सोयाबीन बालों वाली जड़ (एचआर) संस्कृति और जीन फ़ंक्शन विश्लेषण प्रक्रिया का अवलोकन। K599 Agrobacterium संक्रमण के 2 सप्ताह बाद घाव स्थल पर कॉलस का गठन हुआ। सेल भेदभाव 1 सप्ताह के बाद हुआ, फिर एचआर बढ़ाव के लिए 1 सप्ताह बीत गया। इसके बाद 24 घंटे के लिए एचआर हार्वेस्टिंग एंड वॉल ग्लूकन एलिसिटर (डब्ल्यूजीई)/मॉक ट्रीटमेंट किया गया। एचआर को क्रमशः अल्ट्रा परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी) विश्लेषण के लिए मेटाबोलाइट निष्कर्षण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आरएनए अलगाव के अधीन किया गया था। डब्ल्यूजीई फाइटोफ्थोरा सोजे से दीवार ग्लूकेन प्राप्त करने वाला है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: ट्रांसजेनिक विलियम्स 82 बालों वाली जड़ों में एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से ट्रांसलेशनल रूप से जुड़े जीएमजेएजेड 1-6 की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। (ए) ग्रीन चैनल (जीएफपी)। (बी) ब्लू चैनल (डीएपीआई)। (सी) हरे और नीले चैनलों का विलय। सभी छवियों को ज़ीस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। DAPI (6 μg / mL) छवियां परमाणु धुंधलापन का संकेत देती हैं। स्केल सलाखों 5 μm हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण । (ए) जीएमएचएसएफ 6-119 विलियम्स 82 सोयाबीन एचआर को 24 घंटे के मॉक ट्रीटमेंट के तहत अतिरंजित करने में जीन अभिव्यक्ति या डब्ल्यूजीई के साथ 24 घंटे के लिए प्राप्त किया गया। (बी) आरएनएआई-जीएमएमवाईबी 29 ए 220 विलियम्स 82 सोयाबीन एचआर में जीन अभिव्यक्ति डब्ल्यूजीई के साथ 24 घंटे के लिए प्राप्त हुई। डब्ल्यूजीई फाइटोफ्थोरा सोजे से दीवार ग्लूकेन प्राप्त करने वाला है। एकनियंत्रण की तुलना में काफी अधिक और काफीकम, युग्मित छात्रों को टी-टेस्ट (पी < 0.01)। त्रुटि पट्टियाँ एसई (एन ≥ 3 जैविक प्रतिकृतियां) का प्रतिनिधित्व करती हैं। एक प्राथमिक जड़ से एकत्र की गई द्वितीयक जड़ें एक जैविक प्रतिकृति का संकेत देती हैं। इस आंकड़े को लिन एट अल.19 और जहान एट अल.20 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पिछले दशक के दौरान, सोयाबीन एचआर विधि को नाइट्रोजन निर्धारण 22,23, जैविक और अजैविक तनाव सहिष्णुता 24,25, और मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक मार्ग 26,27 में शामिल जीन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। पौधे मेटाबोलाइट्स का उत्पादन कैसे करते हैं, इसका ज्ञान कृषि उत्पादन और दवा उद्योग के लिए बहुत सारे लाभ हैं, क्योंकि इसका उपयोग जीन नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो रोगजनकोंके खिलाफ जैव रासायनिक सुरक्षा की मध्यस्थता में शामिल हैं।
उत्पादकता और लागत दक्षता को प्राथमिकता देने के लिए, यह प्रोटोकॉल प्रक्रिया को सरल बनाता है। उदाहरण के लिए, गेलिंग एजेंट युक्त अधिक महंगे ठोस मीडिया का उपयोग करने के बजाय, सोयाबीन के बीज तरल विकास माध्यम से संतृप्त औद्योगिक-ग्रेड पेपर तौलिए का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में अंकुरित होते हैं। मानव संसाधन परिवर्तन प्रयोगों के लिए सड़न रोकनेवाला प्रयोगशाला तकनीक और बाँझ कार्य स्थितियों को बनाए रखना आवश्यक है, क्योंकि कवक और खमीर जैसे सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला, इन विट्रो संस्कृतियों के संदूषण का कारण बन सकती है।
इसके अतिरिक्त, प्रकाश और फोटोअवधि की उचित तीव्रता का उपयोग करना मानव संसाधन संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है। इन विट्रो संस्कृतियों में पौधों की वृद्धि और विकास प्रक्रिया प्रकाश की तीव्रता और प्रकाशअवधि की गुणवत्ता से काफी प्रभावित होती है, जैसा कि विभिन्न पिछले अध्ययनों में देखा गया है। यदि प्रकाश की तीव्रता या तो बहुत कम या बहुत अधिक है, तो यह रूट प्रेरण की प्रक्रिया को धीमा कर सकती है। इसी तरह, यदि फोटोपीरियड अनुचित है, तो इससे कैलस गठन और विभेदितसेल विकास की विफलता हो सकती है। इसके अलावा, हमारे पिछले प्रयोगों के आधार पर, गैर-ट्रांसजेनिक एचआर एकमात्र एंटीबायोटिक के रूप में उपयोग किए जाने पर कनामाइसिन (50 मिलीग्राम / एल) के लिए प्रतिरोधी हैं। इस कारण से, हम आम तौर पर हाइग्रोमाइसिन और कनामाइसिन के लिए दोहरे प्रतिरोध को एन्कोडिंग करने वाले वैक्टर का उपयोग करते हैं। इस कड़े चयन के तहत, हम कुल जड़ों के 15% -30% की सकारात्मक ट्रांसजेनिक एचआर दर प्राप्त करने में सक्षम हैं, फिर भी उन एचआर में से ~ 80% ने वैक्टर द्वारा एन्कोड किए गए जीन ों को काफी अधिक व्यक्त / चुप कर दिया है।
एचआर परिवर्तन प्रयोगों की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह परीक्षण करना महत्वपूर्ण है कि प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले ए राइजोजेन्स स्ट्रेन टीआई प्लास्मिड को बरकरार रखता है जो विषाणु जीन को एन्कोड करता है। टीआई प्लास्मिड की उपस्थिति पौधे जीनोम4 में टी-डीएनए के सफल एकीकरण के लिए आवश्यक है। टीआई प्लास्मिड का पता लगाने के लिए सीपीसीआर का उपयोग इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम बन गया है। अतीत में, हमने पाया कि हमारे परिवर्तनों का 33% -50% कैली और जड़ों का उत्पादन करने में विफल रहेगा। अनजाने में, यह ए राइजोजीन के परिवर्तन या बाद में संवर्धन के दौरान टीआई प्लास्मिड के नुकसान के कारण था। अब, उनके परिवर्तन के बाद एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनियों के पीसीआर विश्लेषण द्वारा, हम यह सुनिश्चित करते हैं कि टीआई प्लास्मिड मौजूद है और परिवर्तन प्रयोगों का 100% जड़ों का उत्पादन करता है। इस प्रोटोकॉल में सीपीसीआर का उपयोग मानक मानव संसाधन परिवर्तन प्रक्रिया के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त साबित हुआ है। इसने असफल प्रयोगों की संख्या को कम कर दिया है, जिससे समय और संसाधनों दोनों की बचत हुई है। सीपीसीआर चरण ने हमें यह पुष्टि करने की भी अनुमति दी है कि परिवर्तन प्रक्रिया इच्छित रूप से काम करती है, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रयोगों के परिणाम विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।
इसके बावजूद, इस सरलीकृत विधि की कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक एचआर में जीन कार्यों के बारे में बुनियादी सेल जैविक प्रश्नों का उत्तर दे सकता है। हालांकि, अन्य पौधों के ऊतकों से संबंधित प्रश्न, जैसे कि शूट और पत्तियां, एचआर में परीक्षण योग्य नहीं हो सकते हैं। यह पुष्टि करना हमेशा महत्वपूर्ण होता है कि अध्ययन की जा रही प्रक्रिया एक्टोपिक हार्मोन के स्तर या ए राइजोजीन द्वारा पेश किए गए अन्य कारकों से प्रभावित नहीं होती है। शोधकर्ताओं को इसकी सीमाओं पर ध्यान देना चाहिए और सटीक और सार्थक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों को सावधानीपूर्वक डिजाइन करना चाहिए।
सारांश में, यहां प्रदर्शित प्रोटोकॉल सोयाबीन की जड़ों में जीन फ़ंक्शन की जांच के लिए एक अत्यधिक कुशल तरीका है। हमने हाल ही में मल्टीजीन इंजीनियरिंग दृष्टिकोण का अध्ययन करने और सोयाबीन जैव रासायनिक सुरक्षा को विनियमित करने में शामिल जीननेटवर्क को समझने में इसके मूल्य का प्रदर्शन किया है। दृष्टिकोण की सापेक्ष दक्षता इसे पौधे जीव विज्ञान में जटिल सवालों के जवाब देने के लिए आदर्श बनाती है जिसके लिए कई जीनों की जांच की आवश्यकता होती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) अनुदान संख्या आरजीपीआईएन-2020-06111 और ब्रैड लेस से उदार दान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम K599 Agrobacterium और प्रारंभिक प्रोटोकॉल के लिए वेन पैरट (जॉर्जिया विश्वविद्यालय) और pGWB2, pGWB6, और pANDA35HK खाली वैक्टर के लिए नाकागावा और हचिया प्रयोगशाला (शिमाने विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
References
- Li, S., et al.
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619 (2020).
- Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
- Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).
- Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
- Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).
- Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
- Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261 (2017).
- Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
- Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).
- Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
- Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).
- Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
- Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545 (2023).
- Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
- Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149 (2019).
- Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171 (2021).
- Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
- Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170 (2021).
- Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
- Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118 (2022).
- Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
- Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).
