Summary
Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l'altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.
Abstract
L'obiettivo principale di questa ricerca è stato quello di sviluppare un approccio affidabile ed efficiente per isolare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) dal midollo osseo di ratto. Questo sforzo è sorto a causa delle limitazioni associate al metodo tradizionale di estrazione dei NET dal sangue periferico, principalmente a causa della scarsità di neutrofili disponibili per l'isolamento. Lo studio ha rivelato due metodologie distinte per ottenere neutrofili di ratto dal midollo osseo: una procedura semplificata in una sola fase che ha prodotto livelli di purificazione soddisfacenti e un processo in due fasi più dispendioso in termini di tempo che ha mostrato una maggiore efficienza di purificazione. È importante sottolineare che entrambe le tecniche hanno prodotto una notevole quantità di neutrofili vitali, compresa tra 50 e 100 milioni per ratto. Questa efficienza rispecchia i risultati ottenuti isolando neutrofili da fonti sia umane che murine. Significativamente, i neutrofili derivati dal midollo osseo di ratto hanno mostrato capacità comparabili di secernere NET rispetto ai neutrofili ottenuti dal sangue periferico. Tuttavia, il metodo basato sul midollo osseo ha costantemente prodotto quantità notevolmente maggiori sia di neutrofili che di NET. Questo approccio ha dimostrato il potenziale per ottenere quantità significativamente maggiori di questi componenti cellulari per ulteriori applicazioni a valle. In particolare, questi NET isolati e neutrofili sono promettenti per una vasta gamma di applicazioni, che abbracciano i regni dell'infiammazione, dell'infezione e delle malattie autoimmuni.
Introduction
I neutrofili costituiscono un sottogruppo critico di leucociti che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata. Sono caratterizzati da nuclei e granuli multilobati contenenti varie proteasi e peptidi antimicrobici1. I neutrofili funzionano principalmente attraverso la degranulazione, la fagocitosi e la formazione di NET. L'osservazione dei NET è stata fatta per la prima volta da Takei et al. nel 1996 durante un esperimento in cui i neutrofili sono stati stimolati con acetato di miristato di forbolo (PMA)2. Successivamente, il processo di formazione di NET è stato coniato "NETosis" da Brinkmann et al.3 nel 2004. La loro ricerca ha ulteriormente messo in luce il ruolo cruciale dei NET nelle risposte antimicrobiche mediate dai neutrofili. I NET sono strutture simili a ragnatele composte da cromatina, istoni e proteine antimicrobiche che vengono rilasciate dai neutrofili attivati in risposta a stimoli infettivi e infiammatori. I NET possono immobilizzare e uccidere gli agenti patogeni invasori intrappolandoli ed esponendoli a un'alta concentrazione di peptidi e proteasi antimicrobiche 1,3. Inoltre, i NET contribuiscono alla clearance delle cellule apoptotiche e partecipano alla risoluzione dell'infiammazione. Studi recenti indicano anche che un'eccessiva formazione di NET o una degradazione compromessa di NET possono portare a danni tissutali, malattie autoimmuni, trombogenesi e compromissione della rivascolarizzazione 4,5,6,7,8,9,10.
Il ruolo patogenetico dei NET nella fibrosi incontrollata a seguito di infarto miocardico e formazione di aneurismi ventricolari è stato dimostrato attraverso l'espansione della fibrosi perivascolare 4,11. Il modello dell'infarto del miocardio e l'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo nei topi sono entrambi ben consolidati. I leucociti polimorfonucleati (PMN), un tipo di globuli bianchi abbondanti nel sangue umano, sono un'ottima fonte per isolare i neutrofili umani. Questo metodo elimina la necessità di prelevare il midollo osseo, migliorando così la sicurezza e l'efficienza.
I NET svolgono anche un ruolo nella fibrillazione atriale associata al rimodellamento cardiaco. Tuttavia, animali di grandi dimensioni come cani e maiali sono stati utilizzati per modellare la fibrillazione atriale, poiché i topi non hanno un atrio abbastanza grande da stabilire un ciclo di rientro o il modello AF, a meno che specifici canali ionici o vie di segnalazione non vengano abbattuti o eliminati12. Mentre è possibile indurre la fibrillazione atriale nei ratti e isolare i neutrofili dal sangue periferico del ratto come descritto in precedenza, i ricercatori hanno riscontrato una limitazione per cui solo 2 x 105-5 x 105 neutrofili potevano essere isolati dal sangue periferico (10 mL per ratto). L'estrazione di un numero sufficiente di NET in ogni punto temporale ha richiesto circa 10-25 ratti (5 x 106 neutrofili in totale), con il risultato di un processo dispendioso in termini di tempo, costoso e spesso a basso rendimento13. A questo proposito, Li He e colleghi presentano una strategia orientata al midollo osseo per ottenere NET adeguati dai ratti14. Nel loro articolo, forniscono una descrizione completa dell'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo di ratto e confrontano le capacità di secrezione NET dei neutrofili periferici e del midollo osseo di ratto. I due metodi delineati si rivolgono a obiettivi sperimentali distinti, entrambi risultando in quantità sufficienti di neutrofili del midollo osseo di ratto e riducendo il numero di ratti necessari. Il metodo di isolamento in due fasi ha dimostrato una purificazione dei neutrofili superiore, mentre il metodo in una fase si è dimostrato efficiente in termini di tempo con livelli di purificazione accettabili. Inoltre, i ricercatori hanno confrontato la NETosis e la formazione di NET tra i neutrofili del midollo osseo di ratto e le loro controparti periferiche, trovando la stessa potenza con PMN. Questi risultati contribuiscono in modo significativo agli studi sulla fibrillazione atriale relativi ai neutrofili e sottolineano l'importanza di selezionare in modo flessibile diverse fonti per l'isolamento dei neutrofili in vari animali da esperimento con diverse distribuzioni di neutrofili.
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Protocol
Lo studio è stato condotto nell'ambito di una licenza di progetto (n. 20211404A) concessa dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan, in conformità con le linee guida del Comitato Etico degli Animali dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan per la cura e l'uso degli animali. In conformità con le linee guida etiche, i ratti utilizzati in questo studio sono stati mantenuti in un ambiente controllato con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura a 22-24 °C e umidità del 50%-60%. Ai ratti è stato dato accesso a cibo e acqua ad libitum. Gli animali utilizzati in questo studio erano ratti maschi Sprague Dawley (SD) di 6-8 settimane, del peso di circa 250 g e privi di agenti patogeni specifici. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Isolamento dei neutrofili di ratto
- Prelievo di midollo osseo
- Mettere il ratto in un contenitore appropriato per l'anestesia (vedi Tabella dei materiali). Somministrare isoflurano al 3% al ratto fino a quando l'animale non è incosciente. Verificare l'assenza di una risposta a un pizzicamento delle dita dei piedi o della coda per garantire la profondità dell'anestesia.
- Una volta che il ratto è stato anestetizzato profondamente, eseguire la lussazione cervicale posizionando il ratto sulla schiena e tenendogli la coda con una mano mentre afferra la testa con l'altra mano. Lussare il collo in modo rapido e deciso applicando un'improvvisa e forte forza verso l'alto sulla coda mentre si tira la testa verso il basso fino a quando il rachide cervicale non viene reciso. Attendere la conferma del decesso, come la cessazione della respirazione e la mancanza di battito cardiaco, prima di procedere con la raccolta o lo smaltimento dei tessuti.
- Immergi il ratto in etanolo al 75% e lascialo riposare per alcuni minuti per sterilizzare il pelo e la pelle. Appoggia il ratto sulla schiena e recisci gli arti inferiori all'altezza dell'anca per proteggere la testa del femore. Usa le forbici da dissezione per tagliare il legamento all'articolazione del garretto e piega l'articolazione del ginocchio all'indietro per esporre il femore e la tibia.
- Usando pinze e forbici, rimuovi con cura muscoli, tendini e altri tessuti collegati alle ossa. Sciacquare le ossa con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per rimuovere eventuali residui di tessuto e sangue. Ripetere l'operazione altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Mettere le ossa pulite in un contenitore sterile.
- Utilizzare una siringa da 5 o 10 ml con un ago per infilare il midollo attraverso entrambe le estremità dell'osso per allentare la matrice midollare. Sciacquare il midollo osseo con 10-15 mL di terreno di cura del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con un'altra siringa, fino a quando non è possibile eliminare il midollo osseo visibile.
- Centrifugare le cellule del midollo osseo a 300 x g per 10 minuti a 20 °C. Aggiungere 5-10 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (vedere la tabella dei materiali) per risospendere le cellule e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti. Aggiungere 4 volte il volume di HBSS alla miscela. Centrifugare le cellule a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante con una pipetta e utilizzare il pellet risultante per un ulteriore utilizzo.
- Isolamento di neutrofili dal midollo osseo
- Per il metodo in due passaggi, eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi:
- Isolare le cellule del midollo osseo utilizzando il kit di isolamento dei neutrofili di ratto commercializzato seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare un gradiente di densità stratificando 2 mL di reagente percoll al 55% (vedere Tabella dei materiali), 2 mL del reagente al 65%, 2 mL di reagente al 70% e 2 mL di reagente all'80% in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la provetta a 800 x g per 40 minuti a 20 °C, con l'accelerazione impostata su 5 e la decelerazione impostata su 0 o 1.
- Raccogliere lo strato di gradiente al 70%, compresi gli strati cellulari al confine tra il reagente di gradiente al 65% e il 70%, utilizzando una pipetta sterile. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 15 mL di HBSS nella provetta e capovolgere delicatamente la provetta più volte per lavare le cellule. Centrifugare la provetta a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
- Per il metodo in un solo passaggio, eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi:
- Sottoporre le cellule del midollo osseo ai gradienti senza utilizzare il kit di isolamento dei neutrofili di ratto.
- Raccogliere lo strato di gradiente del 70%, compresi gli strati di cellule al confine tra il 65% e il 70% di gradiente, utilizzando una pipetta sterile. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL e lavare le cellule con HBSS. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
- Contare i neutrofili isolati utilizzando un emocitometro e valutare la vitalità utilizzando la colorazione con blu di tripano.
NOTA: Il protocollo può essere modificato a seconda del numero di ratti e del numero desiderato di neutrofili isolati. Una quantità accettabile di ossa è ottenuta da tre ratti quando questo metodo viene utilizzato per la prima volta in un nuovo ambiente sperimentale. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. L'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo deve essere eseguito il più rapidamente possibile per ridurre al minimo il danno cellulare e la perdita di vitalità.
- Per il metodo in due passaggi, eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi:
2. Acquisizione di NET per ratti
- Risospendere 0,5 x 108-1 x 108 neutrofili isolati in terreni RPMI da 4 mL (integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina) in una capsula di Petri sterile da 10 cm.
- Aggiungere 500 nM di PMA (vedi Tabella dei Materiali) alla sospensione dei neutrofili per indurre NETosis. Incubare per 3 ore a 37 °C e 5% di CO2 .
- Per il controllo negativo, aggiungere DNasi I (10 U/mL) nella sospensione dei neutrofili per degradare i NET secreti.
- Per raccogliere i NET, rimuovere il terreno e lavare delicatamente i NET attaccati alla capsula di Petri con HBSS. Quindi, utilizzare un lavaggio intenso con 4 ml di terreno fresco per ciascuna piastra per staccare i NET dalla piastra.
- Raccogliere frequentemente il mezzo di lavaggio e la pipetta per una risospensione completa dei NET.
- Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 20 °C per rimuovere eventuali cellule galleggianti.
- Trasferire la sospensione contenente i NET in una provetta sterile e conservare a -20 °C per un ulteriore utilizzo entro 2 settimane.
NOTA: I NET sono sensibili alla degradazione, quindi si consiglia di utilizzare materiale appena raccolto per ottenere i migliori risultati.
3. Verifica della presenza di NET
- Fissare le cellule (dal punto 2.4) su vetrini coprioggetti con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e NET (dal punto 2.7) per 30 minuti a 1 ora.
- Capovolgere il vetrino coprioggetto su una gocciolina PBS/PBST su un supporto per provette ricoperto di film di paraffina e ripetere il processo di lavaggio tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Permeabilizzare le cellule con Triton-X-100 allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte in PBS/PBST per 1 minuto ciascuna. Sigillare le celle con il siero d'asina normale al 10% (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora.
- Incubare le cellule con l'anticorpo anti-elastasi neutrofila di ratto e l'anticorpo anti-mieloperossidasi di ratto (vedere Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare le cellule con l'anticorpo secondario A488-coniugato asino anti-coniglio IgG (H + L), A594-coniugato asino anti-topo IgG (H + L) e A594-coniugato capra anti-topo IgG1 (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Colorare i nuclei cellulari e gli scheletri NET con 10 mg/mL di DAPI. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino e capovolgere il vetrino coprioggetto con le celle su di esso. Lasciare asciugare per 1 h per l'analisi microscopica con lenti ad immersione; in caso contrario, è pronto per l'ispezione.
NOTA: È necessario prestare molta attenzione quando si manipolano i NET, anche dopo il fissaggio, poiché sono estremamente fragili e possono essere facilmente persi durante la preparazione.
4. Quantificazione delle NET
- Preparare il tampone Tris-EDTA (TE) e la soluzione di lavoro PicoGreen (reagente del saggio dsDNA) secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare gli standard diluendo il DNA madre a concentrazioni di 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL.
NOTA: Per quantificare la concentrazione di NET, è stato utilizzato il kit per il test del dsDNA (vedere la tabella dei materiali), aderendo alle linee guida del produttore. I reagenti del tampone Tris-EDTA (TE) e del dsDNA sono stati preparati utilizzando rispettivamente un volume di 19 volte di acqua bidistillata o un volume di 199 volte di tampone TE. Successivamente, sono state preparate soluzioni standard (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL) e ogni 50 μL del campione è stato combinato con 450 μL di tampone TE. - Aggiungere 50 μL di ciascun campione al tampone TE da 450 μL.
- Aggiungere 100 μL di standard o campioni insieme a un volume uguale di soluzione di lavoro del reagente del saggio a ciascun pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, inclusi standard e campioni.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2-5 minuti, evitando la luce diretta.
- Leggere i campioni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza con uno spettro di emissione di circa 530 nm e uno spettro di assorbanza di circa 480 nm.
- Calcolare la concentrazione di NET in ciascun campione utilizzando la curva standard generata dagli standard.
5. Analisi della secrezione di NET mediante citometria cellulare
- Aggiungere la colorazione del nucleo (vedere la tabella dei materiali) alle cellule incubate nella piastra a 96 pozzetti per raggiungere una concentrazione finale di 10 ng/mL e incubare per 30 minuti.
- Aggiungere alle cellule il colorante di DNA privo di cellule (cfDNA, vedere la tabella dei materiali) per raggiungere una concentrazione finale di 300 nM e incubare per 10 minuti.
- Miscelare i coloranti fluorescenti mediante pipettaggio delicato. Non gettare il surnatante o lavare il pellet.
- Caricare la piastra del campione nello strumento citometrico.
- Impostare i parametri per la messa a fuoco e il tempo di esposizione per i diversi canali: blu (es: 377/50 nm, em: 470/22 nm), di solito con l'esposizione di 30.000 ms, verde (es: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) di solito con l'esposizione di 5.000 ms.
- Cattura immagini altamente uniformi dell'intera piastra su diversi canali.
- Analizza il numero di coloranti del nucleo per diversi gruppi. Se sono simili, la secrezione di NET può essere determinata dal conteggio delle colorazioni di cfDNA.
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Representative Results
Il protocollo qui delineato delinea due metodi distinti, ciascuno caratterizzato da una migliore purificazione o da passaggi semplificati. Entrambi i metodi hanno prodotto circa 0,5 x 108-1 x 108 neutrofili per ratto. L'analisi della citometria a flusso, utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V-FITC/PI, ha mostrato una vitalità cellulare superiore al 90%, paragonabile alle controparti murine e umane (Figura 1). Mentre la contaminazione dei linfociti sembrava inevitabile durante l'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo, il metodo in due fasi ha dimostrato un livello di purezza superiore del 90% rispetto al 50% ottenuto dal metodo in una sola fase (Figura 2).
Risposte comparabili nella secrezione NET sono state distinguibili tra neutrofili periferici e del midollo osseo, indipendentemente dalla stimolazione della PMA (Figura 3). Inoltre, i NET di ratto hanno mostrato limitate capacità di reticolazione tra loro (Figura 4). Nel tentativo di approfondire il processo di NETosi dei ratti, il PMA è stato impiegato come induttore. I NET sono stati rilevati tramite colorazione del cfDNA e le immagini complete sono state acquisite utilizzando un analizzatore di imaging cellulare. In particolare, i neutrofili di ratto hanno mostrato una maggiore propensione alla NETosi spontanea rispetto ai neutrofili di topo e umani, anche senza stimolazione esterna. L'incubazione con PMA ha portato a un aumento del 10% del contenuto di cfDNA dopo 4 ore (Figura 5). Quando esposto a 500 nM di PMA, il midollo osseo di ciascun ratto ha prodotto una concentrazione finale di 8-12 μg/mL NET-DNA. È interessante notare che il contenuto intracellulare è stato estruso in modo incompleto nei neutrofili di ratto durante NETosis, con conseguente osservazione di numerosi componenti intracellulari. Inoltre, i NET di ratto hanno mostrato un'inclinazione a formare una pellicola simile a una garza a causa di una maggiore tendenza all'adesione, presentando un distinto aspetto simile a una nuvola.
Figura 1: Valutazione della vitalità dei neutrofili dall'isolamento del midollo osseo. La fonte ottimale per l'isolamento dei neutrofili di ratto è il midollo osseo, che facilita la successiva acquisizione della trappola extracellulare dei neutrofili. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Purificazione dei neutrofili dal sangue periferico e dal midollo osseo tramite colorazione di Wright-Giemsa. (A) Origine del sangue periferico. (B) Origine del midollo osseo attraverso il metodo one-step. (C) Origine del midollo osseo attraverso il metodo in due fasi. L'estrazione del midollo osseo è l'approccio preferenziale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la conseguente acquisizione di trappole extracellulari per neutrofili. Barra graduata = 20 μm. Ingrandimento = 400x. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Secrezione netta dopo incubazione con PMA o PMA + DNasi I. L'estrazione del midollo osseo rappresenta la via preferenziale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la successiva raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi in immunofluorescenza. Colorazione immunofluorescente del nucleo (blu, A), MPO (verde, B) e immagine di unione (C). NET: Trappola extracellulare dei neutrofili; MPO: mieloperossidasi. L'estrazione del midollo osseo è il metodo preferito per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la successiva raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Barra della scala = 50 μm. Ingrandimento = 200x. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi completa del cfDNA tramite analizzatore di imaging cellulare in varie condizioni. Colorazione fluorescente del cfDNA (verde) e del nucleo (blu). L'estrazione del midollo osseo è l'approccio principale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la conseguente raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Barra della scala = 500 μm. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'isolamento dei neutrofili costituisce un passo fondamentale nello studio di NETosis, dove la selezione di un metodo di isolamento appropriato è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Un fattore importante da valutare è l'insorgenza di contaminazione linfocitaria durante l'isolamento. Affrontare questa sfida è particolarmente significativo quando si isolano i neutrofili di ratto dal midollo osseo. Nonostante il distinto intervallo di densità dei neutrofili (1,0814-1,0919, con un picco a 1,0919) rispetto ai linfociti (1,0337-1,0765, con un picco a 1,0526), la contaminazione con i linfociti rimane inevitabile. Ciò può essere attribuito in parte all'abbondanza di linfociti nel midollo osseo e all'aumentata densità di linfociti immaturi15. Tecniche come la separazione del gradiente di densità, come l'uso di Percoll e Ficoll, possono aiutare a frenare la contaminazione linfocitaria, anche se ottenere la completa eliminazione dei linfociti può essere difficile. Una soluzione di Percoll specializzata, calibrata su uno specifico gradiente di densità, può essere impiegata per ridurre al minimo la contaminazione sfruttando la varianza di densità tra i neutrofili di ratto e altre cellule del midollo osseo. Pertanto, i ricercatori dovrebbero valutare con giudizio il potenziale impatto della contaminazione linfocitaria sui loro risultati sperimentali e adottare misure per mitigarne l'influenza.
Questo studio sottolinea l'importanza di adattare i metodi di isolamento per soddisfare specifici requisiti sperimentali. Nel metodo delineato in precedenza14, il metodo one-step ha dimostrato di essere meno impegnativo in termini di tempo e impegno. Come tale, è stato approvato per l'acquisizione di NET a causa dell'impatto irrilevante dei linfociti contaminanti sulla secrezione di NET. Questi linfociti potrebbero essere successivamente eliminati durante la fase finale di centrifugazione. Al contrario, per gli sforzi che comportano l'isolamento dei neutrofili e la successiva valutazione della NETosi e della secrezione di NET, è stato raccomandato il metodo in due fasi14. Questo approccio ha permesso di quantificare con precisione i NET prodotti dai neutrofili, riducendo al minimo l'influenza di potenziali fattori confondenti derivanti da altre contaminazioni cellulari.
È possibile apportare modifiche al protocollo di isolamento per migliorare sia la resa che la purezza. Ad esempio, l'utilizzo di un set di reagenti a gradiente di densità ottimizzato può produrre più neutrofili. Allo stesso modo, i metodi di pipettaggio e lavaggio delicati possono mitigare la perdita di cellule e rafforzare la purezza. Le azioni di risoluzione dei problemi, come il monitoraggio del pH e della temperatura del tampone, insieme alla regolazione dei parametri di centrifugazione, possono affrontare efficacemente le sfide incontrate durante il processo di isolamento. Un vincolo associato all'isolamento del midollo osseo risiede nella probabilità di contaminazione immatura da neutrofili e altre cellule del midollo osseo, con un conseguente impatto sia sulla purezza che sulla resa. L'ideazione di un approccio semplificato per espellere i linfociti potrebbe migliorare l'efficienza complessiva dell'isolamento. Un altro vincolo riguarda la necessità di sacrificare animali per l'isolamento del midollo osseo, che potrebbe non essere adatto per indagini longitudinali sui neutrofili di ratto in vivo.
L'isolamento dei neutrofili per gli esseri umani si basa prevalentemente sul sangue periferico. I metodi convenzionali comprendono Ficoll-Paque, Percoll e la separazione delle microsfere immunomagnetiche 16,17,18. L'approccio di Ficoll segrega le popolazioni leucocitarie in base alla galleggiabilità e si basa su un agente di contrasto per differenziare i neutrofili. Offre semplicità ed economicità, ma compromette la purezza e la resa e presenta sfide nell'eliminazione dei globuli rossi. D'altra parte, Percoll sfrutta i gradienti di densità, ottenendo una maggiore purezza e resa dei neutrofili al costo di apparecchiature specializzate e di maggiori spese e tempi19. La separazione delle microsfere immunomagnetiche è una tecnica più recente e più specifica che utilizza microsfere magnetiche coniugate con anticorpi che si legano specificamente ai neutrofili con una contaminazione minima da parte di altri leucociti. Sebbene sia suscettibile di automazione, richiede attrezzature specializzate e comporta costi più elevati a causa delle spese per il tallone. Quando si seleziona un metodo di isolamento dei neutrofili, i ricercatori devono soppesare la resa, la purezza, il costo e la complessità. Attualmente, il metodo più conveniente per l'isolamento dei neutrofili umani prevede l'utilizzo di PolymorphPrep20. Questo approccio produce neutrofili altamente purificati in quantità significative in un breve lasso di tempo. Il principio di PolymorphPrep si basa sulla separazione delle cellule in base alla densità.
Nei topi, l'isolamento dei neutrofili dal sangue periferico è sconsigliabile a causa dei bassi volumi di sangue e della difficoltà di garantire una quantità e una purezza sufficienti per gli esperimenti a valle. Nonostante i ratti forniscano quantità di sangue sufficienti (10 ml per ratto), le loro caratteristiche del sangue periferico differiscono da quelle degli esseri umani e dei topi. I ratti presentano intrinsecamente carenze nell'estrazione dei neutrofili, con i monociti che sono le cellule nucleate più abbondanti13,14. Quindi, l'isolamento del sangue periferico fornisce solo 2 x 105-5 x 105 neutrofili da un singolo ratto. Il midollo osseo funge da fonte di neutrofili più praticabile, offrendo una fornitura abbondante e prontamente disponibile indipendentemente dallo stato di infezione dell'animale. In alternativa, l'induzione di un ambiente infiammatorio nella cavità addominale o nel torace per migliorare l'infiltrazione dei neutrofili per l'isolamento è inaffidabile e complessa. In quanto tale, l'estrazione del midollo osseo emerge come una via pratica e affidabile per l'isolamento dei neutrofili di ratto21.
La NETosi coinvolge diversi processi cellulari che comprendono la decondensazione del DNA, l'autofagia e l'espulsione della matrice intracellulare1. Negli esseri umani, l'estrusione NET è completa e lascia dietro di sé resti della membrana cellulare. Curiosamente, gli studi sui neutrofili di ratto mostrano modelli divergenti, rivelando un maggiore contenuto intracellulare dopo la stimolazione. Nonostante la stimolazione della PMA, i neutrofili di ratto mostrano un'estrusione di NET incompleta, allineandosi con la loro NETosi spontanea. Curiosamente, i NET dei ratti dimostrano una propensione per le forme aggregate (aggNET) piuttosto che per la struttura di rete estesa, potenzialmente a causa della ridotta capacità di cross-linking. Questo fenomeno potrebbe avere un impatto significativo sull'aggregazione dei neutrofili, influenzando la risposta immunitaria più ampia nei ratti. Le future applicazioni dell'isolamento del midollo osseo potrebbero comportare l'indagine di vie di segnalazione distinte e cellule immunitarie in NETosis. Inoltre, questo metodo può facilitare l'esplorazione della NETosi in vari modelli di malattia, svelando i ruoli dei neutrofili in diverse patologie. In definitiva, nuove tecniche per isolare e caratterizzare i NET sono promettenti per svelare i meccanismi che guidano la NETosi e le sue implicazioni funzionali in diversi modelli animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
