Summary
Denne undersøkelsen skisserer to teknikker for å isolere rikelig nøytrofile ekstracellulære feller (NET) fra rottebenmarg. Den ene metoden kombinerer et kommersielt nøytrofilt isolasjonssett med sentrifugering av tetthetsgradient, mens den andre bare benytter sentrifugering av tetthetsgradient. Begge tilnærmingene gir funksjonelle NET som overgår de fra nøytrofiler i perifert blod.
Abstract
Hovedmålet med denne forskningen var å utvikle en pålitelig og effektiv tilnærming for å isolere nøytrofile ekstracellulære feller (NET) fra rottebenmarg. Denne innsatsen oppsto på grunn av begrensninger knyttet til den tradisjonelle metoden for å ekstrahere NET fra perifert blod, hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelige nøytrofiler for isolasjon. Studien avslørte to forskjellige metoder for å skaffe rotte nøytrofiler fra benmarg: en strømlinjeformet ett-trinns prosedyre som ga tilfredsstillende rensingsnivåer, og en mer tidkrevende to-trinns prosess som viste forbedret rensingseffektivitet. Det er viktig at begge teknikkene ga en betydelig mengde levedyktige nøytrofiler, som varierte mellom 50 og 100 millioner per rotte. Denne effektiviteten gjenspeilet resultatene oppnådd ved å isolere nøytrofiler fra både humane og murine kilder. Det er signifikant at nøytrofiler avledet fra rottebenmarg viste sammenlignbare evner til å utskille NET sammenlignet med nøytrofiler oppnådd fra perifert blod. Imidlertid produserte den benmargsbaserte metoden konsekvent betydelig større mengder av både nøytrofiler og NET. Denne tilnærmingen demonstrerte potensialet til å skaffe betydelig større mengder av disse cellulære komponentene for videre nedstrøms applikasjoner. Spesielt holder disse isolerte NET og nøytrofiler løfte om en rekke applikasjoner, som spenner over rikene av betennelse, infeksjon og autoimmune sykdommer.
Introduction
Neutrofiler utgjør en kritisk delmengde av leukocytter som spiller en sentral rolle i den medfødte immunresponsen. De er preget av multilobed kjerner og granulater som inneholder forskjellige proteaser og antimikrobielle peptider1. Neutrofiler fungerer primært gjennom degranulering, fagocytose og dannelse av NET. Observasjonen av NET ble først gjort av Takei et al. i 1996 under et eksperiment hvor nøytrofiler ble stimulert med phorbol myristate acetate (PMA) 2. Deretter ble prosessen med NET-dannelse laget "NETosis" av Brinkmann et al.3 i 2004. Deres forskning belyste videre den avgjørende rollen som NET i nøytrofilmedierte antimikrobielle responser. NET er nettlignende strukturer sammensatt av kromatin, histoner og antimikrobielle proteiner som frigjøres fra aktiverte nøytrofiler som respons på smittsomme og inflammatoriske stimuli. NET kan immobilisere og drepe invaderende patogener ved å fange dem og utsette dem for en høy konsentrasjon av antimikrobielle peptider og proteaser 1,3. I tillegg bidrar NET til clearance av apoptotiske celler og deltar i betennelsesoppløsning. Nylige studier indikerer også at overdreven dannelse av NET eller nedsatt NET-nedbrytning kan føre til vevskader, autoimmune sykdommer, trombogenese og nedsatt revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
Den patogene rollen til NET i ukontrollert fibrose etter hjerteinfarkt og dannelsen av ventrikulære aneurismer har blitt demonstrert gjennom utvidelse av perivaskulær fibrose 4,11. Myokardinfarktmodellen og isoleringen av nøytrofiler fra benmarg hos mus er begge veletablerte. Polymorfonukleære (PMN) leukocytter, en type hvite blodlegemer rikelig i humant blod, tjener som en utmerket kilde for å isolere humane nøytrofiler. Denne metoden eliminerer behovet for å høste benmarg, og dermed øke sikkerheten og effektiviteten.
NET spiller også en rolle i atrieflimmer forbundet med hjerteremodellering. Imidlertid ble store dyr som hunder og griser brukt til å modellere atrieflimmer, da mus mangler et atrium som er stort nok til å etablere en re-entrant syklus eller AF-modellen, med mindre spesifikke ionekanaler eller signalveier blir slått ned eller slått ut12. Mens det er mulig å indusere atrieflimmer hos rotter og isolere nøytrofiler fra rotte perifert blod som tidligere beskrevet, oppdaget forskerne en begrensning der bare 2 x 105-5 x 105 nøytrofiler kunne isoleres fra perifert blod (10 ml per rotte). Ekstrahering av tilstrekkelige NET på hvert tidspunkt krevde ca. 10-25 rotter (5 x 106 nøytrofiler totalt), noe som resulterte i en tidkrevende, kostbar og ofte lav avkastningsprosess13. I denne forbindelse presenterer Li He og kolleger en beinmargsorientert strategi for å oppnå tilstrekkelige NET fra rotter14. I sin artikkel gir de en omfattende beskrivelse av isolering av nøytrofiler fra rotte benmarg og sammenligner NET-sekresjonsegenskapene til rotte perifere og benmarg nøytrofiler. De to metodene skissert imøtekomme til forskjellige eksperimentelle mål, begge resulterer i tilstrekkelige mengder rotte benmarg nøytrofiler samtidig redusere antall nødvendige rotter. To-trinns isolasjonsmetoden viste overlegen nøytrofil rensing, mens ett-trinns metoden viste seg tidseffektiv med akseptable rensenivåer. Videre sammenlignet forskerne NETosis og NET-dannelse mellom rottebenmarg nøytrofiler og deres perifere kolleger, og fant lik styrke med PMN. Disse funnene bidrar betydelig til nøytrofilrelaterte studier av atrieflimmer og understreker viktigheten av fleksibelt å velge forskjellige kilder for nøytrofil isolasjon i forskjellige forsøksdyr med forskjellig nøytrofilfordeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble utført under en prosjektlisens (nr. 20211404A) gitt av Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, i samsvar med retningslinjene fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University for omsorg og bruk av dyr. I samsvar med etiske retningslinjer ble rottene som ble brukt i denne studien holdt i et kontrollert miljø med en 12 timers lys / mørk syklus, temperatur ved 22-24 ° C og fuktighet på 50% -60%. Rottene fikk tilgang til mat og vann ad libitum. Dyrene som ble brukt i denne studien var 6-8 uker gamle Sprague Dawley (SD) hannrotter, som veide ca. 250 g og spesifikt patogenfrie. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse).
1. Isolering av rotte nøytrofiler
- Benmarg høsting
- Plasser rotta i en egnet beholder for anestesi (se materialfortegnelse). Gi rotte 3 % isofluran til dyret er bevisstløst. Sjekk for fravær av respons på en tåklemme eller hale klemme for å sikre dybden av anestesi.
- Når rotta er dypt bedøvet, utfør cervikal dislokasjon ved å plassere rotta på ryggen og holde halen med den ene hånden mens du tar tak i hodet med den andre hånden. Disloc nakken raskt og fast ved å bruke en plutselig og sterk oppadgående kraft på halen mens du trekker hodet nedover til cervical ryggraden er kuttet. Vent på bekreftelse av død, for eksempel opphør av pust og mangel på hjerterytme, før du fortsetter med vevsinnsamling eller avhending.
- Dypp rotta i 75% etanol og la den sitte i noen minutter for å sterilisere pelsen og huden. Legg rotta på ryggen og kutt underekstremitetene ved hoften for å beskytte lårhodet. Bruk disseksjonssaks til å skjære gjennom leddbåndet ved hockleddet og brett kneleddet bakover for å avsløre lårbenet og tibia.
- Bruk tang og saks, fjern forsiktig muskler, sener og annet vev som er koblet til beinene. Skyll beinene med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for å fjerne gjenværende vevsrester og blod. Gjenta to ganger til, for totalt tre vasker. Plasser de rensede beinene i en steril beholder.
- Bruk en 5 eller 10 ml sprøyte med en nål for å stikke margen gjennom begge ender av benet for å løsne margmatriksen. Skyll benmargen med 10-15 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media med en annen sprøyte, til ingen synlig benmarg kan skylles ut.
- Sentrifuger benmargscellene ved 300 x g i 10 minutter ved 20 °C. Tilsett 5-10 ml lysisbuffer for røde blodlegemer (se materialfortegnelse) for å resuspendere cellene og inkubere ved romtemperatur i 3 minutter. Tilsett 4 ganger volumet av HBSS til blandingen. Sentrifuger cellene ved 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur, kast supernatanten med en pipette og bruk den resulterende pelleten til videre bruk.
- Isolering av nøytrofiler fra benmarg
- For totrinnsmetoden utfører du følgende tilleggstrinn:
- Isoler benmargceller ved hjelp av det kommersialiserte nøytrofile isolasjonssettet for rotter i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse).
- Forbered en tetthetsgradient ved å legge 2 ml 55 % percoll-reagens lagvis (se materialtabell), 2 ml 65 % av reagenset, 2 ml 70 % reagens og 2 ml 80 % reagens i et nytt 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger røret ved 800 x g i 40 minutter ved 20 °C, med akselerasjonen satt til 5 og retardasjonen satt til 0 eller 1.
- Samle 70% gradientlaget, inkludert cellelagene ved grensen mellom 65% og 70% gradientreagens, ved hjelp av en steril pipette. Overfør cellesuspensjonen til et nytt 15 ml sentrifugerør. Tilsett 15 ml HBSS i røret og snu forsiktig røret flere ganger for å vaske cellene. Sentrifuger røret ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
- For ett-trinns metoden, utfør følgende tilleggstrinn:
- Emne benmargceller til gradienter uten å bruke rotte nøytrofil isolasjon kit.
- Samle 70% gradientlaget, inkludert cellelagene ved grensen mellom 65% og 70% gradient, ved hjelp av en steril pipette. Overfør cellesuspensjonen til et nytt 50 ml sentrifugerør og vask cellene med HBSS. Sentrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
- Telle de isolerte nøytrofilene ved hjelp av et hemocytometer og vurder levedyktigheten ved hjelp av trypanblå farging.
MERK: Protokollen kan endres avhengig av antall rotter og ønsket antall isolerte nøytrofiler. En akseptabel mengde bein oppnås fra tre rotter når denne metoden brukes for første gang i en ny eksperimentell setting. Alle prosedyrer skal utføres under sterile forhold. Isolering av nøytrofiler fra benmarg bør utføres så raskt som mulig for å minimere celleskader og tap av levedyktighet.
- For totrinnsmetoden utfører du følgende tilleggstrinn:
2. Anskaffelse av rottenett
- Resuspender 0,5 x 108-1 x 108 isolerte nøytrofiler i 4 ml RPMI media (supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin) i en steril 10 cm petriskål.
- Tilsett 500 nM PMA (se materialfortegnelsen) til den nøytrofile suspensjonen for å indusere NETosis. Inkuber i 3 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- For negativ kontroll, tilsett DNase I (10 U/ml) i den nøytrofile suspensjonen for å bryte ned de utskilte NETene.
- For å høste NET-ene, fjern mediet og vask forsiktig NET festet til petriskålen med HBSS. Bruk deretter intens spyling med 4 ml ferske medier for hver plate for å løsne NET fra platen.
- Samle vaskemediet og pipetten ofte for fullstendig resuspensjon av NET.
- Sentrifuger suspensjonen ved 300 × g i 10 minutter ved 20 °C for å fjerne eventuelle flytende celler.
- Overfør suspensjonen som inneholder NET til en steril slange og oppbevares ved -20 °C for videre bruk innen 2 uker.
MERK: NET er følsomme for nedbrytning, så det anbefales å bruke nyhøstet materiale for best resultat.
3. Verifisering av tilstedeværelsen av NET
- Fest cellene (fra trinn 2.4) på dekksedler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og NET (fra trinn 2.7) i 30 minutter til 1 time.
- Vend dekselet på en PBS/PBST-dråpe på et parafinfilmdekket reagensrørstativ og gjenta vaskeprosessen tre ganger i 5 minutter hver.
- Permeabiliser cellene med 0,5% Triton-X-100 i 10 min ved romtemperatur og vask tre ganger i PBS / PBST i 1 min hver. Forsegle cellene med 10% normalt eselserum (se materialfortegnelse) ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber cellene med anti-rotte nøytrofil elastase antistoff og anti-rotte myeloperoxidase antistoff (se tabell over materialer) over natten ved 4 ° C. Deretter vasker du dekselet i PBS/PBST tre ganger i 5 min hver.
- Inkuber cellene med det sekundære antistoffet A488-konjugert esel-antikanin IgG (H + L), A594-konjugert esel-anti-mus IgG (H + L) og A594-konjugert geitanti-mus IgG1 (se materialfortegnelse) ved romtemperatur i 1 time i mørket. Deretter vasker du dekselet i PBS/PBST tre ganger i 5 min hver.
- Flekkcellekjerner og NET-skjeletter med 10 mg/ml DAPI. Deretter vasker du dekselet i PBS/PBST tre ganger i 5 min hver.
- Plasser en dråpe monteringsmedium på et glassglass og snu dekselet med celler på det. La det tørke i 1 time for mikroskopisk analyse med nedsenkningslinser; Ellers er den klar for inspeksjon.
MERK: Stor forsiktighet må utvises når du manipulerer NET, selv etter fiksering, da de er ekstremt skjøre og lett kan gå tapt under forberedelse.
4. Kvantifisering av NET
- Forbered Tris-EDTA (TE) buffer og PicoGreen (dsDNA assay reagens) arbeidsløsning i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
- Forbered standarder ved å fortynne lager-DNA til konsentrasjoner på 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml og 1 μg / ml.
MERK: For å kvantifisere konsentrasjonen av NET ble dsDNA-analysesettet (se materialfortegnelse) brukt, i samsvar med produsentens retningslinjer. Tris-EDTA (TE) buffer- og dsDNA-analysereagenser ble klargjort ved bruk av henholdsvis et 19 ganger volum dobbeltdestillert vann eller et 199 ganger volum av TE-buffer. Deretter ble standardløsninger (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml og 1 μg/ml) fremstilt, og hver 50 μL av prøven ble kombinert med 450 μL TE-buffer. - Tilsett 50 μL av hver prøve til 450 μL TE-buffer.
- Legg til 100 μL standarder eller prøver sammen med et likt volum av analysereagensarbeidsløsning til hver brønn i en 96-brønnplate, inkludert standarder og prøver.
- Inkuber platen ved romtemperatur i 2-5 minutter, unngå direkte lys.
- Les prøvene ved hjelp av en fluorescensmikroplateleser med et utslippsspekter på rundt 530 nm og et absorbansspektrum på rundt 480 nm.
- Beregn konsentrasjonen av NET i hver prøve ved hjelp av standardkurven generert av standardene.
5. Analyse av NETs sekresjon ved cellecytometri
- Legg til kjerneflekk (se materialtabell) til cellene som inkuberes i 96-brønnsplaten for å nå en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml og inkubere i 30 minutter.
- Tilsett cellefritt DNA (cfDNA, se materialtabell) flekk på cellene for å nå en endelig konsentrasjon på 300 nM og inkubere i 10 minutter.
- Bland fluorescerende fargestoffer ved forsiktig pipettering. Ikke kast supernatanten eller vask pelleten.
- Legg prøveplaten inn i cytometerinstrumentet.
- Still inn parametrene for fokus og eksponeringstid for de forskjellige kanalene: blå (f.eks. 377/50 nm, em: 470/22 nm), vanligvis med eksponering på 30 000 ms, grønn (f.eks. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) vanligvis med eksponering på 5000 ms.
- Ta svært ensartede bilder av hele tallerkenen i forskjellige kanaler.
- Analyser kjerneflekktellingene for forskjellige grupper. Hvis de er like, kan NETs sekresjon bestemmes av cfDNA-flekktellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er skissert her, avgrenser to forskjellige metoder, hver preget av forbedret rensing eller strømlinjeformede trinn. Begge metodene ga ca. 0,5 x 108-1 x 108 nøytrofile per rotte. Flowcytometrianalyse, ved bruk av vedlegget V-FITC / PI apoptosedeteksjonssett, viste celle levedyktighet over 90%, sammenlignbar med mus og menneskelige kolleger (figur 1). Mens lymfocyttforurensning syntes uunngåelig under nøytrofil isolasjon fra benmarg, viste totrinnsmetoden et forbedret renhetsnivå på 90% sammenlignet med 50% oppnådd ved ett-trinns metoden (figur 2).
Sammenlignbar respons i NET-sekresjon var merkbar mellom perifere og benmargs nøytrofile granulocytter, uavhengig av PMA-stimulering (figur 3). Videre viste rotte-NET begrensede tverrbindingsevner med hverandre (figur 4). I et forsøk på å dykke dypere inn i prosessen med rotte NETosis, ble PMA ansatt som en induktor. NET ble detektert via cfDNA-farging, og omfattende bilder ble tatt ved hjelp av en Cell Imaging Analyzer. Spesielt viste rotte nøytrofiler en høyere tilbøyelighet til spontan NETosis i motsetning til mus og humane nøytrofiler, selv uten ekstern stimulering. Inkubasjon med PMA førte til en 10% økning i cfDNA-innhold etter 4 timer (figur 5). Ved eksponering for 500 nM PMA ga benmargen til hver rotte en endelig konsentrasjon på 8-12 μg / ml NET-DNA. Det er bemerkelsesverdig at intracellulært innhold ble ufullstendig ekstrudert i rotte nøytrofiler under NETosis, noe som resulterte i observasjon av mange intracellulære komponenter. I tillegg viste rotte-NET en tilbøyelighet til å danne en gasbindlignende film på grunn av forbedrede vedheftstendenser, noe som presenterte et distinkt skylignende utseende.
Figur 1 Vurdering av nøytrofil levedyktighet fra benmargsisolasjon. Den optimale kilden til nøytrofil isolasjon av rotter er benmarg, noe som letter etterfølgende nøytrofil ekstracellulær felleoppkjøp. Denne figuren er tilpasset fra He et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Nøytrofil rensing fra perifert blod og benmarg via Wright-Giemsa-farging. (A) Perifert blodopprinnelse. (B) Benmargens opprinnelse via ett-trinns metoden. (C) Benmargens opprinnelse via to-trinns metoden. Benmargsekstraksjon tjener som den foretrukne tilnærmingen for nøytrofil isolasjon av rotter og det påfølgende oppkjøpet av nøytrofile ekstracellulære feller. Skala bar = 20 μm. Forstørrelse = 400x. Denne figuren er tilpasset fra He et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: NET-sekresjon ved inkubasjon med PMA eller PMA + DNase I. Benmargsekstraksjon representerer den foretrukne ruten for nøytrofil isolasjon fra rotter og den påfølgende samlingen av nøytrofile ekstracellulære feller. Denne figuren er tilpasset fra He et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunfluorescerende analyse. Immunfluorescerende farging av kjernen (blå, A), MPO (grønn, B) og fusjonsbilde (C). NET: nøytrofil ekstracellulær felle; MPO: Myeloperoksidase. Benmargsekstraksjon er den favoriserte metoden for rotte nøytrofil isolasjon og den etterfølgende samlingen av nøytrofile ekstracellulære feller. Skala bar = 50 μm. Forstørrelse = 200x. Denne figuren er tilpasset fra He et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Omfattende analyse av cfDNA via cellebildeanalysator under forskjellige forhold. Fluorescerende farging av cfDNA (grønn) og kjernen (blå). Benmargsekstraksjon er den primære tilnærmingen for nøytrofil isolasjon fra rotter og den påfølgende samlingen av nøytrofile ekstracellulære feller. Skala bar = 500 μm. Denne figuren er tilpasset fra He et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isoleringen av nøytrofiler utgjør et sentralt trinn i å studere NETosis, hvor valg av en passende isolasjonsmetode er avgjørende for å oppnå pålitelige resultater. En viktig faktor å veie er forekomsten av lymfocyttforurensning under isolasjon. Å adressere denne utfordringen er spesielt viktig når man isolerer rotte nøytrofiler fra benmarg. Til tross for det distinkte tetthetsområdet for nøytrofiler (1,0814-1,0919, med en topp på 1,0919) sammenlignet med lymfocytter (1,0337-1,0765, med en topp på 1,0526), forblir forurensning med lymfocytter uunngåelig. Dette kan blant annet tilskrives overflod av lymfocytter i beinmargen og økt tetthet av umodne lymfocytter15. Teknikker som tetthetsgradientseparasjon, som bruk av Percoll og Ficoll, kan bidra til å dempe lymfocyttforurensning, selv om det kan være utfordrende å oppnå fullstendig eliminering av lymfocytter. En spesialisert Percoll-løsning, kalibrert til en bestemt tetthetsgradient, kan brukes til å minimere forurensning ved å utnytte tetthetsvariansen mellom rotte nøytrofiler og andre benmargceller. Derfor bør forskere vurdere den potensielle effekten av lymfocyttforurensning på deres eksperimentelle resultater og iverksette tiltak for å redusere dens innflytelse.
Denne studien understreker betydningen av å skreddersy isolasjonsmetoder for å matche spesifikke eksperimentelle krav. I metoden som er skissert tidligere14, viste etttrinnsmetoden å være mindre krevende når det gjelder tid og krefter. Som sådan ble det godkjent for NET-oppkjøp på grunn av den inkonsekvente effekten av forurensende lymfocytter på NET-sekresjon. Disse lymfocyttene kunne deretter elimineres under det siste sentrifugeringsstadiet. Omvendt, for bestrebelser som innebærer nøytrofil isolasjon og påfølgende evaluering av NETosis og NET-sekresjon, ble totrinnsmetoden anbefalt14. Denne tilnærmingen tillot presis kvantifisering av NET produsert av nøytrofiler samtidig som påvirkning av potensielle forstyrrende faktorer som stammer fra andre celleforurensninger ble minimert.
Modifikasjoner kan gjøres i isolasjonsprotokollen for å forbedre både utbytte og renhet. For eksempel kan bruken av et optimalisert tetthetsgradientreagenssett gi flere nøytrofiler. Skånsomme pipetterings- og vaskemetoder kan også redusere celletap og styrke renheten. Feilsøkingshandlinger som overvåking av bufferens pH og temperatur, sammen med justering av sentrifugeringsparametere, kan effektivt løse utfordringer som oppstår under isolasjonsprosessen. En tilhørende begrensning av benmargsisolasjon ligger i sannsynligheten for umoden nøytrofil og annen benmargscelleforurensning, og påvirker dermed både renhet og utbytte. Å utarbeide en strømlinjeformet tilnærming for å utvise lymfocytter kan forbedre den generelle isolasjonseffektiviteten. En annen begrensning gjelder nødvendigheten av dyreofring for benmargsisolering, noe som kan være uegnet for langsgående undersøkelser av rotte nøytrofiler in vivo.
Neutrofil isolasjon for mennesker er hovedsakelig avhengig av perifert blod. Konvensjonelle metoder omfatter Ficoll-Paque, Percoll og immunmagnetisk perleseparasjon 16,17,18. Ficoll-tilnærmingen segregerer leukocyttpopulasjoner basert på oppdrift og er avhengig av et kontrastmiddel for å skille nøytrofiler. Det gir enkelhet og kostnadseffektivitet, men går på kompromiss med renhet og utbytte og gir utfordringer med å eliminere røde blodlegemer. På den annen side utnytter Percoll tetthetsgradienter, noe som gir større nøytrofil renhet og utbytte på bekostning av spesialutstyr og økte utgifter og tid19. Immunomagnetisk perleseparasjon er en nyere, mer spesifikk teknikk som benytter antistoffkonjugerte magnetiske perler som spesifikt binder seg til nøytrofiler med minimal forurensning fra andre leukocytter. Selv om det er mottagelig for automatisering, krever det spesialisert utstyr og medfører høyere kostnader på grunn av perleutgifter. Ved valg av nøytrofil isolasjonsmetode må forskerne veie utbytte, renhet, kostnad og kompleksitet. For tiden innebærer den mest praktiske metoden for human nøytrofil isolasjon bruk av PolymorphPrep20. Denne tilnærmingen gir høyt rensede nøytrofiler i betydelige mengder innen kort tid. PolymorphPreps prinsipp er avhengig av celleseparasjon i henhold til tetthet.
Hos mus er isolering av nøytrofiler fra perifert blod ikke tilrådelig på grunn av lave blodvolumer og utfordringen med å sikre tilstrekkelig mengde og renhet for nedstrøms eksperimenter. Til tross for at rotter gir tilstrekkelige blodmengder (10 ml per rotte), er deres perifere blodegenskaper forskjellig fra mennesker og mus. Rotter viser iboende mangler i nøytrofil ekstraksjon, med monocytter som de mest tallrike kjernefysiske cellene13,14. Derfor gir perifer blodisolasjon bare 2 x 105-5 x 105 nøytrofiler fra en enkelt rotte. Benmarg fungerer som en mer levedyktig nøytrofil kilde, og tilbyr en lett tilgjengelig og rikelig tilførsel uavhengig av dyrets infeksjonsstatus. Alternativt er det upålitelig og intrikat å indusere et inflammatorisk miljø i bukhulen eller brystkassen for å forbedre nøytrofil infiltrasjon for isolasjon. Som sådan fremstår benmargsekstraksjon som en praktisk, pålitelig rute for rotte nøytrofil isolasjon21.
NETosis involverer ulike cellulære prosesser som omfatter DNA-dekondensering, autofagi og intracellulær matriksutdrivelse1. Hos mennesker er NET-ekstrudering omfattende, og etterlater rester av cellemembranen. Oppsiktsvekkende viser rotte nøytrofile studier divergerende mønstre, og avslører mer intracellulært innhold etter stimulering. Til tross for PMA-stimulering, viser rotte nøytrofiler ufullstendig NET-ekstrudering, på linje med deres spontane NETosis. Merkelig nok demonstrerer rotte-NET en tilbøyelighet til aggregerte former (aggNET) i stedet for omfattende nettverksstruktur, potensielt på grunn av redusert evne til kryssbinding. Dette fenomenet kan ha betydelig innvirkning på nøytrofilaggregering og påvirke den bredere immunresponsen hos rotter. Fremtidige anvendelser av benmargsisolasjon kan innebære å undersøke forskjellige signalveier og immunceller i NETosis. I tillegg kan denne metoden lette NETosis-utforskning i varierte sykdomsmodeller, og avdekke nøytrofilenes roller på tvers av forskjellige patologier. Til syvende og sist holder nye teknikker for å isolere og karakterisere NET løfte om å avdekke mekanismene som driver NETosis og dens funksjonelle implikasjoner på tvers av ulike dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 82004154, 81900311, 82100336 og 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
