Summary
Denna forskning beskriver två tekniker för att isolera rikligt med neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Den ena metoden kombinerar ett kommersiellt neutrofilisoleringskit med densitetsgradientcentrifugering, medan den andra endast använder densitetsgradientcentrifugering. Båda metoderna ger funktionella NET som överträffar dem från neutrofiler i perifert blod.
Abstract
Det primära syftet med denna forskning var att utveckla ett tillförlitligt och effektivt tillvägagångssätt för att isolera neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Detta försök uppstod på grund av begränsningar i samband med den traditionella metoden att extrahera NET från perifert blod, främst på grund av bristen på tillgängliga neutrofiler för isolering. Studien avslöjade två distinkta metoder för att erhålla neutrofiler från råttor från benmärg: en strömlinjeformad enstegsprocedur som gav tillfredsställande reningsnivåer och en mer tidskrävande tvåstegsprocess som uppvisade förbättrad reningseffektivitet. Viktigt är att båda teknikerna gav en betydande mängd livskraftiga neutrofiler, mellan 50 och 100 miljoner per råtta. Denna effektivitet speglade de resultat som erhölls genom att isolera neutrofiler från både humana och murina källor. Signifikant är att neutrofiler som härrör från benmärg från råtta uppvisade jämförbar förmåga att utsöndra NET jämfört med neutrofiler erhållna från perifert blod. Den benmärgsbaserade metoden gav dock genomgående betydligt större mängder av både neutrofiler och NET. Detta tillvägagångssätt visade potentialen att erhålla betydligt större mängder av dessa cellulära komponenter för ytterligare nedströmsapplikationer. Noterbart är att dessa isolerade NET och neutrofiler är lovande för en rad tillämpningar, som spänner över områdena inflammation, infektion och autoimmuna sjukdomar.
Introduction
Neutrofiler utgör en kritisk undergrupp av leukocyter som spelar en central roll i det medfödda immunsvaret. De karakteriseras av flerflikiga kärnor och granuler som innehåller olika proteaser och antimikrobiella peptider1. Neutrofiler fungerar främst genom degranulering, fagocytos och bildning av NET. Observationen av NET gjordes först av Takei et al. 1996 under ett experiment där neutrofiler stimulerades med forbolmyristatacetat (PMA)2. Därefter myntades processen för NET-bildning "NETosis" av Brinkmann et al.3 2004. Deras forskning belyste ytterligare den avgörande roll som NET spelar i neutrofilmedierade antimikrobiella svar. NET är nätliknande strukturer som består av kromatin, histoner och antimikrobiella proteiner som frisätts från aktiverade neutrofiler som svar på infektiösa och inflammatoriska stimuli. NET kan immobilisera och döda invaderande patogener genom att fånga dem och utsätta dem för en hög koncentration av antimikrobiella peptider och proteaser 1,3. Dessutom bidrar NET till eliminering av apoptotiska celler och deltar i inflammationsupplösning. Nyligen genomförda studier tyder också på att en överdriven bildning av NET eller försämrad NET-nedbrytning kan leda till vävnadsskador, autoimmuna sjukdomar, trombogenes och försämrad revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
Den patogena rollen av NET vid okontrollerad fibros efter hjärtinfarkt och bildandet av ventrikulära aneurysm har påvisats genom expansion av perivaskulär fibros 4,11. Hjärtinfarktmodellen och isoleringen av neutrofiler från benmärg hos möss är båda väletablerade. Polymorfonukleära (PMN) leukocyter, en typ av vita blodkroppar som finns rikligt i humant blod, fungerar som en utmärkt källa för att isolera humana neutrofiler. Denna metod eliminerar behovet av att skörda benmärg, vilket ökar säkerheten och effektiviteten.
NET spelar också en roll vid förmaksflimmer i samband med hjärtombyggnad. Stora djur som hundar och grisar användes dock för att modellera förmaksflimmer, eftersom möss saknar ett förmak som är tillräckligt stort för att etablera en återinträdescykel eller AF-modellen, såvida inte specifika jonkanaler eller signalvägar slås ner eller slås ut12. Även om det är möjligt att inducera förmaksflimmer hos råttor och isolera neutrofiler från perifert blod från råttor som tidigare beskrivits, stötte forskarna på en begränsning där endast 2 x 105-5 x 105 neutrofiler kunde isoleras från perifert blod (10 ml per råtta). Att extrahera tillräckligt med NET vid varje tidpunkt krävde cirka 10-25 råttor (5 x 106 neutrofiler totalt), vilket resulterade i en tidskrävande, dyr och ofta lågavkastande process13. I detta avseende presenterar Li He och kollegor en benmärgsorienterad strategi för att få adekvata NET från råttor14. I sin artikel ger de en omfattande beskrivning av isolering av neutrofiler från benmärg från råtta och jämför NET-sekretionsförmågan hos perifera neutrofiler och benmärgsneutrofiler hos råttor. De två metoder som beskrivs tillgodoser olika experimentella mål, som båda resulterar i tillräckliga mängder neutrofiler från råttbenmärg samtidigt som antalet råttor som krävs minskar. Tvåstegsisoleringsmetoden visade överlägsen rening av neutrofila granulocyter, medan enstegsmetoden visade sig vara tidseffektiv med acceptabla reningsnivåer. Dessutom jämförde forskarna NETosis och NET-bildning mellan neutrofiler i benmärg hos råttor och deras perifera motsvarigheter, och fann samma styrka som PMN. Dessa fynd bidrar i hög grad till neutrofilrelaterade studier av förmaksflimmer och understryker vikten av att flexibelt välja olika källor för neutrofilisolering i olika försöksdjur med olika neutrofilfördelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien utfördes under en projektlicens (nr 20211404A) beviljad av djuretikkommittén vid West China Hospital, Sichuan University, i enlighet med riktlinjerna från Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University för vård och användning av djur. I enlighet med etiska riktlinjer hölls råttorna som användes i denna studie i en kontrollerad miljö med en 12 timmars ljus/mörker-cykel, temperatur vid 22-24 °C och luftfuktighet på 50%-60%. Råttorna fick tillgång till mat och vatten ad libitum. Djuren som användes i denna studie var 6-8 veckor gamla Sprague Dawley (SD) hanråttor, som vägde cirka 250 g och var specifikt patogenfria. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
1. Isolering av neutrofiler hos råtta
- Skörd av benmärg
- Placera råttan i en lämplig behållare för anestesi (se materialförteckning). Administrera 3 % isofluran till råttan tills djuret är medvetslöst. Kontrollera om det inte finns något svar på en tånyp eller svansnyp för att säkerställa anestesidjupet.
- När råttan är djupt bedövad, utför cervikal luxation genom att placera råttan på rygg och hålla svansen med ena handen samtidigt som du tar tag i huvudet med den andra handen. Vrid nacken ur led snabbt och bestämt genom att applicera en plötslig och stark uppåtriktad kraft på svansen samtidigt som du drar huvudet nedåt tills halsryggraden är avskuren. Vänta på bekräftelse av dödsfallet, såsom andningsuppehåll och brist på hjärtslag, innan du fortsätter med vävnadsinsamling eller kassering.
- Doppa råttan i 75% etanol och låt den sitta i några minuter för att sterilisera päls och hud. Lägg råttan på rygg och skär av de nedre extremiteterna vid höften för att skydda lårbenshuvudet. Använd dissektionssax för att skära igenom ligamentet vid hasleden och vik knäleden bakåt för att exponera lårbenet och skenbenet.
- Använd en pincett och sax för att försiktigt ta bort alla muskler, senor och andra vävnader som är kopplade till benen. Skölj benen med Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) för att ta bort eventuellt kvarvarande vävnadsskräp och blod. Upprepa ytterligare två gånger, totalt tre tvättar. Lägg de rengjorda benen i en steril behållare.
- Använd en 5 eller 10 ml spruta med en nål för att sticka benmärgen genom båda ändarna av benet för att lossa benmärgsmatrisen. Skölj benmärgen med 10-15 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media med en annan spruta tills ingen synlig benmärg kan spolas ut.
- Centrifugera benmärgscellerna vid 300 x g i 10 minuter vid 20 °C. Tillsätt 5-10 ml lysbuffert för röda blodkroppar (se materialförteckning) för att återsuspendera cellerna och inkubera i rumstemperatur i 3 minuter. Tillsätt 4 gånger volymen HBSS till blandningen. Centrifugera cellerna vid 600 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, kassera supernatanten med en pipett och använd pelleten för vidare användning.
- Isolering av neutrofiler från benmärg
- Utför följande ytterligare steg för tvåstegsmetoden:
- Isolera benmärgsceller med hjälp av det kommersialiserade neutrofilisoleringskitet för råtta enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Förbered en densitetsgradient genom att skikta 2 ml 55 % percoll-reagens (se materialtabell), 2 ml 65 % av reagensen, 2 ml 70 % reagens och 2 ml 80 % reagens i ett nytt 15 ml centrifugrör. Centrifugera röret vid 800 x g i 40 minuter vid 20 °C, med accelerationen inställd på 5 och retardationen inställd på 0 eller 1.
- Samla upp 70 % gradientskiktet, inklusive cellskikten vid gränsen mellan 65 % och 70 % gradientreagens, med hjälp av en steril pipett. Överför cellsuspensionen till ett nytt 15 ml centrifugrör. Tillsätt 15 ml HBSS i röret och vänd försiktigt upp och ner på röret flera gånger för att tvätta cellerna. Centrifugera röret vid 300 x g i 10 minuter i rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Utför följande ytterligare steg för enstegsmetoden:
- Utsätt benmärgscellerna för gradienterna utan att använda isoleringskitet för neutrofila granulocyter på råtta.
- Samla upp 70 % gradientskiktet, inklusive celskikten vid gränsen mellan 65 % och 70 % gradient, med hjälp av en steril pipett. Överför cellsuspensionen till ett nytt 50 ml centrifugrör och tvätta cellerna med HBSS. Centrifugera röret vid 400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Räkna de isolerade neutrofilerna med hjälp av en hemocytometer och bedöm viabiliteten med hjälp av trypanblå färgning.
OBS: Protokollet kan modifieras beroende på antalet råttor och önskat antal isolerade neutrofiler. En acceptabel mängd ben erhålls från tre råttor när denna metod används för första gången i en ny försöksmiljö. Alla procedurer bör utföras under sterila förhållanden. Isolering av neutrofiler från benmärgen bör utföras så snabbt som möjligt för att minimera cellskador och förlust av livsduglighet.
- Utför följande ytterligare steg för tvåstegsmetoden:
2. Förvärv av råttnät
- Återsuspendera 0,5 x 108-1 x 108 isolerade neutrofiler i 4 ml RPMI-media (tillsatt med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin) i en steril 10 cm petriskål.
- Tillsätt 500 nM PMA (se materialförteckning) till neutrofilsuspensionen för att inducera NETosis. Inkubera i 3 timmar vid 37 °C och 5 % CO2 °C.
- För den negativa kontrollen, tillsätt DNas I (10 E/ml) till den neutrofila suspensionen för att bryta ned de utsöndrade NET.
- För att skörda NETs, ta bort mediet och tvätta försiktigt NETs som är fästa på petriskålen med HBSS. Använd sedan intensiv spolning med 4 ml färskt media för varje platta för att lossa näten från plattan.
- Samla upp tvättmediet och pipetten ofta för fullständig omblandning av NET.
- Centrifugera suspensionen vid 300 × g i 10 minuter vid 20 °C för att avlägsna eventuella flytande celler.
- Överför suspensionen som innehåller NET till en steril tub och förvara vid −20 °C för vidare användning inom 2 veckor.
OBS: NET är känsliga för nedbrytning, så det rekommenderas att använda nyskördat material för bästa resultat.
3. Kontroll av förekomsten av NET
- Fäst cellerna (från steg 2.4) på täckglas med 4 % paraformaldehyd i 15 minuter och NET (från steg 2.7) i 30 minuter till 1 timme.
- Vänd täckglaset på en PBS/PBST-droppe på ett paraffinfilmtäckt provrörsstativ och upprepa tvättprocessen tre gånger i 5 minuter vardera.
- Permeabilisera cellerna med 0,5 % Triton-X-100 i 10 min i rumstemperatur och tvätta tre gånger i PBS/PBST i 1 min vardera. Försegla cellerna med 10 % normalt åsneserum (se Materialförteckning) i rumstemperatur i 1 timme.
- Inkubera cellerna med antikroppar mot neutrofila elastaser från råtta och myeloperoxidasantikroppar från råtta (se materialtabell) över natten vid 4 °C. Tvätta sedan täckglaset i PBS/PBST tre gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera cellerna med den sekundära antikroppen A488-konjugerad åsna anti-kanin IgG (H + L), A594-konjugerad åsna anti-mus IgG (H + L) och A594-konjugerad get anti-Mouse IgG1 (se Materialtabell) i rumstemperatur i 1 timme i mörker. Tvätta sedan täckglaset i PBS/PBST tre gånger i 5 minuter vardera.
- Färga cellkärnor och NET-skelett med 10 mg/ml DAPI. Tvätta sedan täckglaset i PBS/PBST tre gånger i 5 minuter vardera.
- Placera en droppe monteringsmedium på en glasskiva och vänd upp och ner på täckglaset med celler på det. Låt det torka i 1 timme för mikroskopisk analys med nedsänkningslinser; Annars är den redo för inspektion.
OBS: Stor försiktighet måste iakttas vid manipulering av NET, även efter fixering, eftersom de är extremt ömtåliga och lätt kan gå förlorade under beredningen.
4. Kvantifiering av netto
- Bered Tris-EDTA (TE) buffert och PicoGreen (dsDNA assay reagens) arbetslösning enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
- Bered standarder genom att späda stam-DNA till koncentrationer på 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml och 1 μg/ml.
OBS: För att kvantifiera koncentrationen av NET användes dsDNA-analyssatsen (se materialtabell) i enlighet med tillverkarens riktlinjer. Tris-EDTA (TE) buffert och dsDNA-analysreagenser bereddes med en 19-faldig volym dubbeldestillerat vatten respektive en 199-faldig volym TE-buffert. Därefter bereddes standardlösningar (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml och 1 μg/ml) och varje 50 μl av provet kombinerades med 450 μL TE-buffert. - Tillsätt 50 μl av varje prov till 450 μl TE-buffert.
- Tillsätt 100 μl standarder eller prover tillsammans med en lika stor volym analysreagensarbetslösning till varje brunn i en 96-hålsplatta, inklusive standarder och prover.
- Inkubera plattan i rumstemperatur i 2-5 minuter, undvik direkt ljus.
- Läs proverna med hjälp av en fluorescensmikroplattläsare med ett emissionsspektrum på cirka 530 nm och ett absorbansspektrum på cirka 480 nm.
- Beräkna koncentrationen av NET i varje prov med hjälp av standardkurvan som genereras av standarderna.
5. Analys av NETs utsöndring med cellcytometri
- Tillsätt kärnfärgning (se materialtabell) till cellerna som inkuberats i 96-hålsplattan för att nå en slutlig koncentration på 10 ng/ml och inkubera i 30 minuter.
- Tillsätt cellfritt DNA (cfDNA, se materialtabell) till cellerna för att nå en slutlig koncentration på 300 nM och inkubera i 10 minuter.
- Blanda de fluorescerande färgämnena genom att försiktigt pipettera. Kasta inte supernatanten eller tvätta pelleten.
- Ladda sample plattan i cytometerinstrumentet.
- Ställ in parametrarna för fokus och exponeringstid för de olika kanalerna: blå (ex: 377/50 nm, em: 470/22 nm), vanligtvis med en exponering på 30 000 ms, grön (ex: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) vanligtvis med en exponering på 5 000 ms.
- Ta mycket enhetliga bilder av hela plattan vid olika kanaler.
- Analysera antalet kärnfläckar för olika grupper. Om de är likartade kan NETs utsöndring bestämmas av antalet cfDNA-fläckar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här beskriver två distinkta metoder, var och en kännetecknad av förbättrad rening eller strömlinjeformade steg. Båda metoderna gav cirka 0,5 x 108-1 x 108 neutrofiler per råtta. Flödescytometrianalys, med hjälp av annexin V-FITC/PI apoptosdetektionskit, uppvisade cellviabilitet över 90 %, jämförbar med mus och mänskliga motsvarigheter (figur 1). Medan lymfocytkontaminering verkade oundviklig vid isolering av neutrofila granulocyter från benmärgen, uppvisade tvåstegsmetoden en ökad renhetsgrad på 90 % jämfört med de 50 % som uppnåddes med enstegsmetoden (figur 2).
Jämförbara svar i NET-sekretion kunde urskiljas mellan perifera neutrofiler och benmärgsneutrofiler, oberoende av PMA-stimulering (Figur 3). Dessutom uppvisade råttnät begränsad förmåga att tvärbinda med varandra (figur 4). I ett försök att fördjupa sig i processen för råttans NETosis användes PMA som inducerare. NET detekterades via cfDNA-färgning och omfattande bilder togs med hjälp av en Cell Imaging Analyzer. Noterbart är att neutrofiler hos råttor uppvisade en högre benägenhet för spontan NETos i motsats till neutrofiler hos mus och människa, även utan extern stimulering. Inkubation med PMA ledde till en 10-procentig ökning av cfDNA-halten efter 4 timmar (Figur 5). Vid exponering för 500 nM PMA gav benmärgen hos varje råtta en slutlig koncentration på 8-12 μg/ml netto-DNA. Det är anmärkningsvärt att intracellulärt innehåll ofullständigt extruderades i råttneutrofiler under NETosis, vilket resulterade i observation av många intracellulära komponenter. Dessutom uppvisade råttnät en benägenhet att bilda en gasvävsliknande film på grund av förbättrade vidhäftningstendenser, vilket gav ett distinkt molnliknande utseende.
Figur 1: Bedömning av neutrofila viabiliteter genom benmärgsisolering. Den optimala källan för isolering av neutrofila granulocyter hos råtta är benmärg, vilket underlättar efterföljande förvärv av neutrofila extracellulära fällor. Denna figur är hämtad från He et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Rening av neutrofiler från perifert blod och benmärg via Wright-Giemsa-färgning. A) Perifert blod. B) Benmärgens ursprung med enstegsmetoden. C) Benmärgens ursprung med hjälp av tvåstegsmetoden. Benmärgsextraktion är den föredragna metoden för isolering av neutrofila granulocyter hos råtta och det efterföljande förvärvet av neutrofila extracellulära fällor. Skalstreck = 20 μm. Förstoring = 400x. Denna figur är hämtad från He et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: NET-sekretion vid inkubation med PMA eller PMA + DNas I. Benmärgsextraktion är den föredragna vägen för isolering av neutrofila granulocyter hos råtta och efterföljande insamling av neutrofila extracellulära fällor. Denna figur är hämtad från He et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofluorescensanalys. Immunofluorescensfärgning av kärnan (blå, A), MPO (grön, B) och sammanslagningsbild (C). NET: Neutrofil extracellulär fälla; MPO: Myeloperoxidas. Benmärgsextraktion är den föredragna metoden för isolering av neutrofila granulocyter hos råttor och efterföljande insamling av neutrofila extracellulära fällor. Skalstreck = 50 μm. Förstoring = 200x. Denna figur är hämtad från He et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Omfattande analys av cfDNA via cellavbildningsanalysator under olika förhållanden. Fluorescerande färgning av cfDNA (grönt) och kärna (blått). Benmärgsextraktion är den primära metoden för isolering av neutrofila granulocyter hos råttor och den efterföljande samlingen av neutrofila extracellulära fällor. Skalstapel = 500 μm. Denna figur är hämtad från He et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering av neutrofiler utgör ett avgörande steg i studien av NETosis, där valet av en lämplig isoleringsmetod är av största vikt för att uppnå tillförlitliga resultat. En viktig faktor att väga in är förekomsten av lymfocytkontamination under isoleringen. Att ta itu med denna utmaning är särskilt viktigt när man isolerar neutrofiler från råttor från benmärg. Trots det distinkta densitetsintervallet för neutrofiler (1,0814-1,0919, med en topp på 1,0919) jämfört med lymfocyter (1,0337-1,0765, med en topp på 1,0526), är kontaminering med lymfocyter fortfarande oundviklig. Detta kan delvis tillskrivas överflödet av lymfocyter i benmärgen och den ökade tätheten av omogna lymfocyter15. Tekniker som densitetsgradientseparation, som att använda Percoll och Ficoll, kan hjälpa till att begränsa lymfocytkontaminering, även om det kan vara svårt att uppnå fullständig lymfocyteliminering. En specialiserad Percoll-lösning, kalibrerad till en specifik densitetsgradient, kan användas för att minimera kontaminering genom att dra nytta av densitetsvariationen mellan råttneutrofiler och andra benmärgsceller. Därför bör forskare på ett omdömesgillt sätt bedöma den potentiella effekten av lymfocytkontaminering på deras experimentella resultat och vidta åtgärder för att mildra dess inflytande.
Denna studie understryker betydelsen av att skräddarsy isoleringsmetoder för att matcha specifika experimentella krav. I den metod som beskrivits tidigare14 visade sig enstegsmetoden vara mindre krävande när det gäller tid och ansträngning. Som sådan godkändes den för NET-förvärv på grund av den obetydliga effekten av kontaminerande lymfocyter på NET-sekretionen. Dessa lymfocyter kunde därefter elimineras under det sista centrifugeringssteget. Omvänt, för strävanden som innefattar neutrofilisolering och efterföljande utvärdering av NETosis och NET-sekretion, rekommenderades tvåstegsmetoden14. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde exakt kvantifiering av NET som produceras av neutrofiler samtidigt som påverkan av potentiella förväxlingsfaktorer som härrör från andra cellkontamineringar minimerades.
Ändringar kan göras i isoleringsprotokollet för att förbättra både avkastning och renhet. Till exempel kan användningen av en optimerad densitetsgradientreagensuppsättning ge fler neutrofiler. Skonsamma pipetterings- och tvättmetoder kan också mildra cellförlusten och stärka renheten. Felsökningsåtgärder som övervakning av buffertens pH och temperatur, tillsammans med justering av centrifugeringsparametrar, kan effektivt ta itu med utmaningar som uppstår under isoleringsprocessen. En associerad begränsning av benmärgsisolering ligger i sannolikheten för omogen kontaminering av neutrofiler och andra benmärgsceller, vilket påverkar både renhet och avkastning. Att utforma ett strömlinjeformat tillvägagångssätt för att driva ut lymfocyter skulle kunna förbättra den totala isoleringseffektiviteten. En annan begränsning gäller nödvändigheten av djuravlivning för benmärgsisolering, vilket kan vara olämpligt för longitudinella undersökningar av neutrofiler hos råttor in vivo.
Neutrofilisolering för människor är främst beroende av perifert blod. Konventionella metoder omfattar Ficoll-Paque, Percoll och immunomagnetisk pärlseparering 16,17,18. Ficoll-metoden separerar leukocytpopulationer baserat på flytkraft och förlitar sig på ett kontrastmedel för att differentiera neutrofiler. Det erbjuder enkelhet och kostnadseffektivitet men kompromissar med renhet och avkastning och innebär utmaningar när det gäller att eliminera röda blodkroppar. Å andra sidan utnyttjar Percoll densitetsgradienter, vilket ger större neutrofilrenhet och utbyte på bekostnad av specialutrustning och ökade kostnader och tid19. Immunomagnetisk pärlseparering är en nyare, mer specifik teknik som använder antikroppskonjugerade magnetiska pärlor som specifikt binder till neutrofiler med minimal kontaminering från andra leukocyter. Även om det är möjligt att automatisera kräver det specialutrustning och medför högre kostnader på grund av pärlkostnader. När man väljer en metod för isolering av neutrofila granulocyter måste forskarna väga utbyte, renhet, kostnad och komplexitet. För närvarande är den mest praktiska metoden för isolering av neutrofila granulocyter hos människa att använda PolymorphPrep20. Detta tillvägagångssätt ger högrenade neutrofiler i betydande mängder inom ett kort intervall. PolymorphPreps princip bygger på cellseparation enligt densitet.
Hos möss är det inte tillrådligt att isolera neutrofiler från perifert blod på grund av låga blodvolymer och utmaningen att säkerställa tillräcklig mängd och renhet för nedströmsförsök. Trots att råttor ger tillräckliga blodmängder (10 ml per råtta) skiljer sig deras perifera blodegenskaper från människor och möss. Råttor uppvisar i sig brister i neutrofilextraktion, där monocyter är de vanligast förekommande kärnförsedda cellerna13,14. Perifer blodisolering ger därför endast 2 x 105-5 x 105 neutrofiler från en enda råtta. Benmärg fungerar som en mer livskraftig neutrofilkälla och erbjuder en lättillgänglig och riklig tillgång oavsett djurets infektionsstatus. Alternativt är det opålitligt och invecklat att inducera en inflammatorisk miljö i bukhålan eller bröstkorgen för att öka neutrofilinfiltrationen för isolering. Som sådan framstår benmärgsextraktion som en praktisk, pålitlig väg för isolering av neutrofila granulocyter hos råtta21.
NETos involverar olika cellulära processer som omfattar DNA-dekondensation, autofagi och intracellulär matrisutdrivning1. Hos människor är NET-extrudering omfattande och lämnar efter sig rester av cellmembranet. Intressant nog uppvisar studier av neutrofila granulocyter på råttor divergerande mönster, vilket avslöjar mer intracellulärt innehåll efter stimulering. Trots PMA-stimulering uppvisar råttneutrofiler ofullständig NET-extrudering, i linje med deras spontana NETos. Märkligt nog uppvisar råttnät en benägenhet för aggregerade former (aggNET) snarare än omfattande nätverksstruktur, möjligen på grund av minskad korsbindningsförmåga. Detta fenomen kan avsevärt påverka neutrofilaggregeringen, vilket påverkar det bredare immunsvaret hos råttor. Framtida tillämpningar av benmärgsisolering kan innebära att man undersöker distinkta signalvägar och immunceller i NETosis. Dessutom kan denna metod underlätta NETosis-utforskning i olika sjukdomsmodeller och reda ut neutrofilers roller i olika patologier. I slutändan är nya tekniker för att isolera och karakterisera NET lovande för att reda ut mekanismerna som driver NETosis och dess funktionella konsekvenser i olika djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Finansiering: Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 82004154, 81900311, 82100336 och 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
