Summary
Nous décrivons ici un protocole simple qui permet d’évaluer in vitro l’abondance des microARN marqués par fluorescence afin d’étudier la dynamique de l’emballage et de l’exportation des microARN dans les vésicules extracellulaires (VE).
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont d’importants médiateurs de la communication cellulaire qui sont sécrétés par une variété de cellules différentes. Ces VE transportent des molécules bioactives, notamment des protéines, des lipides et des acides nucléiques (ADN, ARNm, microARN et autres ARN non codants), d’une cellule à l’autre, entraînant des conséquences phénotypiques dans les cellules réceptrices. De toutes les cargaisons de véhicules électriques, les microARN (miARN) ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la formation du microenvironnement et dans l’éducation des cellules réceptrices en raison de leur dérégulation évidente et de leur abondance dans les véhicules électriques. Des données supplémentaires indiquent que de nombreux miARN sont activement chargés dans les VE. Malgré ces preuves évidentes, les recherches sur la dynamique de l’exportation et les mécanismes de tri des miARN sont limitées. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’analyse par cytométrie en flux de l’EV-miARN qui peut être utilisé pour comprendre la dynamique de la charge EV-miARN et identifier la machinerie impliquée dans l’exportation des miARN. Dans ce protocole, les miARN prédéterminés à être enrichis en VE et appauvris à partir des cellules du donneur sont conjugués à un fluorophore et transfectés dans les cellules du donneur. Les miARN marqués par fluorescence sont ensuite vérifiés pour leur chargement dans les VE et leur épuisement des cellules à l’aide de la qRT-PCR. En tant qu’outil de contrôle de la transfection et d’identification de la population de cellules transfectées, un ARN cellulaire marqué par fluorescence (conservé par cellule et appauvri en EV) est inclus. Les cellules transfectées à la fois avec le miARN EV et le miARN retenu par la cellule sont évaluées pour les signaux fluorescents sur une période de 72 h. L’intensité du signal de fluorescence spécifique des miARN EV diminue rapidement par rapport aux miARN retenus par les cellules. À l’aide de ce protocole simple, il est maintenant possible d’évaluer la dynamique de la charge des miARN et d’identifier divers facteurs responsables de la charge des miARN dans les VE.
Introduction
Les microARN (miARN) sont l’un des sous-ensembles de petits ARN non codants les mieux caractérisés, connus pour leur rôle essentiel dans la régulation des gènes post-transcriptionnels. L’expression et la biogenèse de la plupart des miARN suivent une série coordonnée d’événements qui commence par la transcription des miARN primaires (pri-miARN) dans le noyau. Après le traitement nucléaire par le complexe de microprocesseurs en précurseurs-miARN (pré-miARN), les pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme, où ils subissent un traitement ultérieur par l’endonucléase RNase III, en 21-23 duplex de miARN matures nucléotidiques1. L’un des brins du miARN mature traité se lie aux ARN messagers cibles (ARNm), conduisant à la dégradation ou à la répression traductionnelle des cibles2. Sur la base du rôle pléiotrope des miARN dans la régulation simultanée de plusieurs ARNm cibles diverses, il n’est pas surprenant que l’expression des miARN soit étroitement régulée3. En effet, une expression inappropriée contribue à divers états pathologiques, en particulier dans le cancer. L’expression aberrante des miARN représente non seulement une signature spécifique à la maladie, mais est également apparue comme une cible pour le potentiel pronostique et thérapeutique 4,5,6. En plus de leurs rôles intracellulaires, les miARN ont également des rôles non autonomes. Par exemple, les miARN peuvent être emballés sélectivement dans des VE par des cellules donneuses et exportés vers des sites receveurs où ils suscitent diverses réponses phénotypiques dans la physiologie normale et pathologique 7,8,9.
Malgré des preuves évidentes que les miARN associés aux VE sont des biomolécules fonctionnelles, on ne comprend pas complètement comment des sous-ensembles spécifiques de miARN sont dérégulés dans des états pathologiques tels que le cancer et comment la machinerie cellulaire sélectionne et trie les miARN en Evs10,11. Compte tenu du rôle potentiel des microARN EV dans la modulation du microenvironnement, il est essentiel d’identifier les mécanismes impliqués dans l’exportation de certains miARN afin d’élucider pleinement le rôle des VE dans la communication intercellulaire et la pathogenèse de la maladie. Comprendre le processus de libération des miARN dans les VE permettra non seulement de mettre en évidence les médiateurs importants de l’exportation des miARN, mais aussi de fournir des informations sur les thérapies potentielles. Pour atteindre ce niveau de connaissance, il est nécessaire d’adapter les outils pour répondre fidèlement à ces nouvelles questions expérimentales. En effet, les études qui évaluent les VE connaissent une croissance exponentielle en raison de l’introduction de nouvelles techniques et de nouveaux contrôles12,13. En ce qui concerne l’évaluation de l’abondance des miARN exportés dans les VE, le séquençage de nouvelle génération et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR) sont les outils standard actuels. Bien que ces outils soient utiles pour évaluer l’abondance des miARN dans les VE, leur sensibilité et leur spécificité sont limitées, et l’utilisation de ces approches statiques pour évaluer la dynamique est insuffisante. La délimitation de la dynamique de l’exportation des miARN dans les VE nécessite une combinaison d’outils spécialisés. Nous présentons ici un protocole complet utilisant des miARN conjugués par fluorescence, afin d’analyser la dynamique de la libération des miARN à partir des cellules donneuses et de leur incorporation dans les VE. Nous discutons également des avantages et des limites de la méthode et fournissons des recommandations pour une utilisation optimale. La méthode polyvalente présentée dans cet article sera utile aux chercheurs intéressés par l’étude de la libération de miARN dans les VE et de leurs rôles potentiels dans la communication cellulaire et les maladies.
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Protocol
NOTE : L’identification et la validation des miARN exportés de manière sélective sont nécessaires pour être préalables à l’utilisation de cette technique. Étant donné que les différentes lignées cellulaires varient en fonction de la cargaison de miARN triée dans leurs VE, il est recommandé d’évaluer la lignée cellulaire d’intérêt et les VE associées pour les miARN avant utilisation. De plus, la transfection à base de lipofectamine est l’une des étapes critiques du protocole ; Il est recommandé de prédéterminer l’efficacité de la transfection avant de mettre en place l’expérience.
1. Cultiver des cellules en culture et transfecter des cellules avec des miARN EV conjugués aux fluorophores
- Plaquer 200 000 à 400 000 cellules dans des puits triplés dans une plaque à 6 puits dans un milieu de culture approprié. Faites tourner doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80 % de confluence, environ 24 à 48 h.
- Pour chaque puits à transfecter, diluer le réactif de transfection dans 100 μL de milieu sans sérum dans un tube de microcentrifugation selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : La concentration optimale de lipides doit être déterminée pour la lignée cellulaire d’intérêt avant cette configuration. - Pour chaque puits à transfecter, diluer séparément le miARN EV conjugué au fluorophore (2 nM) et le miARN cellulaire (2 nM) dans un tube de microcentrifugation dans 100 μL de milieu sans sérum.
NOTA : Le volume total doit être calculé pour le nombre total de puits transfectés. Dans ce protocole, la fluorescence a été évaluée à 7 points temporels ; par conséquent, le volume total était de 700 μL pour l’étape 1.2 et de 700 μL pour l’étape 1.3. De plus, pour capturer en toute confiance la population de cellules fluorescentes positives, l’utilisateur doit transfecter les cellules avec un miARN brouillé non fluorescent et mettre en place une porte excluant ces cellules. - Ajouter le mélange d’ARN dilué (à partir de l’étape 1.3) au réactif de transfection dilué (à partir de l’étape 1.2) et mélanger doucement en retournant le tube 3 à 4 fois. Laissez incuber le mélange combiné lipide-ARN pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
- Retirez le milieu de culture ordinaire des cellules et ajoutez 800 μL de milieu sans sérum dans chaque puits. Ajouter délicatement 200 μL du mélange lipide-ARN (à partir de l’étape 1.4) goutte à goutte dans les cellules.
REMARQUE : Le milieu Opti-MEM a été utilisé pour la transfection de la lignée cellulaire d’intérêt (cellules Calu6). Essayez d’ajouter le mélange lipide-ARN directement dans le milieu de culture, en évitant d’ajouter le mélange sur les côtés de la plaque.
2. Récolte de cellules transfectées à différents moments pour l’analyse de la fluorescence
- Incuber les cellules transfectées à 37 °C pendant 7 h.
REMARQUE : Pour valider la transfection cohérente des deux miARN (microARN EV et miARN cellulaire), les cellules sont prélevées dans un puits 3 h après la transfection pour analyser la fluorescence à l’aide du cytomètre en flux. - Après la période d’incubation de 7 h, retirer le complexe de transfection des puits et le remplacer par un milieu complet.
- Pour évaluer le point de temps de 7 heures, récoltez les cellules et lavez-les trois fois avec 1x PBS.
- Si vous travaillez avec des cellules adhérentes, ajoutez 200 μL de trypsine dans un puits et attendez que les cellules se détachent de la plaque. Transférez les cellules détachées dans un tube de microcentrifugation et une pastille par centrifugation à 200xg pendant 5 min.
- Jetez le surnageant avec précaution pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Pour le premier lavage PBS, remettez le granulé en suspension dans ~500 μL de 1x PBS et répétez la granulation en utilisant les étapes de centrifugation ci-dessus. Répétez le lavage PBS deux fois de plus.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % et évaluer la fluorescence.
REMARQUE : Après avoir ajouté 2% de PFA, la pastille cellulaire peut être stockée à 4 °C pendant 3-4 jours.
- Récoltez les points temporels restants en suivant les étapes de la section 2.3. Récupérez tous les granulés cellulaires stockés et suivez les étapes de la section 3.
3. Analyse par cytométrie en flux du signal de miARN cellulaire et de miARN EV dans les cellules
- Préparer les cellules pour l’analyse par cytométrie en flux. Filtrer la suspension cellulaire de la section 2 à travers les capuchons de crépine de 35 μm qui font partie des tubes FACS en polystyrène à fond rond pour permettre l’élimination des débris et des agrégats cellulaires qui pourraient interférer avec l’analyse des fluorophores.
- Configurez l’instrument en suivant les instructions d’étalonnage. Allumez le cytomètre en flux et laissez-le se réchauffer pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser. Amorcez le système fluidique avec du liquide de gaine, puis vérifiez et ajustez l’alignement du laser.
- Exécuter le contrôle de la qualité pour confirmer la fluidique de l’instrument. Chargez de l’eau filtrée ultrapure dans le cytomètre en flux et faites-le fonctionner à un débit approprié pour un temps d’acquisition adéquat.
REMARQUE : Le débit et le temps d’acquisition appropriés dépendront du type de cellule d’intérêt, de la complexité de l’échantillon et de la qualité des données souhaitées. - Ouvrez le logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux et confirmez les performances du détecteur et des lasers. Configurez des paramètres de seuil et de tension pour la détection en fonction de la lignée cellulaire d’intérêt et des fluorophores de votre choix.
REMARQUE : Pour toutes les expériences en aval, des cellules Calu6 ont été utilisées.- Définissez le seuil de capture du signal pour les cellules Calu6 au niveau FSC 5000. Effectuez l’analyse pour 1 x 104 cellules pour chaque répétition expérimentale.
- Pour tenir compte du chevauchement spectral entre les différents fluorophores, utilisez des cellules non transfectées et des cellules transfectées indépendamment avec un seul des fluorophores pour mettre en place des contrôles de compensation.
- Pour la détection de l’exportation de miARN, utilisez des miARN-EV candidats (miR-451a et miR-150) conjugués à Alexa-fluor 488, et un miARN-miARN de cellule témoin (cel-miR-67) conjugué à Cy3.
- Pour chaque miARN EV, conjuguer le fluorophore à l’extrémité 5′ du brin 5p. Avant la transfection, recuire le brin conjugué au fluorophore en son brin 3p 100% complémentaire.
- Pour l’analyse de l’expression dans les cellules transfectées, analysez les échantillons à l’aide des canaux FSC, SSC, FITC et PE réglés sur 258, 192, 269 et 423 unités de tension, respectivement (Figure 1A, B).
- Introduire l’échantillon témoin négatif dans le cytomètre en flux. Capturez les signaux de cellule après avoir défini les intensités de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) dans une feuille de calcul personnalisée.
- Dans le diagramme, choisissez FSC pour l’axe X, SSC pour l’axe Y et gate pour la population d’intérêt en dessinant un polygone autour de celle-ci (voir Figure 1B, panneau inférieur).
- Créez un nouveau tracé à l’aide de la population fermée.
- Réglez l’axe X sur le signal de fluorescence 1 (FS1) pour la détection des miARN cellulaires et l’axe Y sur le signal de fluorescence 2 (FS2) pour la détection des miARN EV. Définissez les paramètres de compensation pour les fluorophores individuels à l’aide de cellules transfectées indépendamment avec chacun des miARN marqués par fluorescence. Dans la nouvelle parcelle, porte sur la population d’intérêt.
- Pour la détection des miARN EV, utilisez le canal FITC. Pour l’évaluation du signal cellule-miARN, utilisez le canal PE. Dans le logiciel, créez une porte autour des cellules qui étaient positives pour FITC et PE en dessinant un polygone autour de la population à double fluorescence lorsque FITC a été sélectionné pour l’axe X et PE a été sélectionné pour l’axe Y.
- Enregistrez les statistiques de la population fermée.
- Enregistrez le pourcentage de cellules de la population fermée qui sont positives à la fois pour le FITC et l’EP, ainsi que pour celles qui sont positives pour le FITC ou l’EP.
- Répétez les étapes ci-dessus pour tous les échantillons ou contrôles supplémentaires de l’expérience.
4. Isoler les VE des cellules transfectées
- Pour les cellules cultivées dans des milieux contenant du sérum, épuiser les VE du sérum pour éviter la contamination croisée.
- Pour générer un sérum appauvri en VE, diluez le sérum à 50 % dans un milieu de culture cellulaire pour réduire la viscosité et centrifugez le sérum à 50 % obtenu à 110 000 x g pendant 18 h.
- Collectez soigneusement le surnageant (sérum sans EV) et filtrez-le à l’aide d’un ensemble de filtre de 0,2 μm. Utilisez le sérum sans EV à 50 % obtenu pour générer un milieu complet, dans ce cas, RPMI plus 10 % de sérum.
- Pour collecter les VE, ajoutez le milieu complet appauvri en VE dans les cellules et collectez les VE 48 h après l’incubation.
NOTE : Le protocole décrit ci-dessous a été modifié à partir de Kowal et al.14.
- Cultivez des cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 15 cm jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence. Transfecter les cellules séparément avec des miARN cellulaires et des miARN EV dans 10 mL d’Opti-MEM en suivant le protocole de transfection de la section 1 du protocole.
REMARQUE : Tous les protocoles de transfection ne sont pas mis à l’échelle de manière linéaire. Il peut être essentiel d’adapter et d’évaluer d’abord les conditions de transfection dans des plaques de 15 cm. - Après 7 h, aspirez le milieu de transfection et remplacez-le par le milieu appauvri en EV (15 mL). Cultivez des cellules dans le milieu appauvri en VE pendant 48 h.
- Retirez le milieu conditionné des cellules et distribuez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Centrifuger le milieu conditionné à 2000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires. Transférez le surnageant obtenu dans un tube frais.
- Centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Retirez le surnageant et filtrez-le à l’aide d’un ensemble de filtre de 0,2 μm.
- Transférez le milieu de culture cellulaire filtré dans un tube d’ultracentrifugation stérile à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Pesez et équilibrez les tubes les uns par rapport aux autres. Faire tourner les échantillons à 110 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre le granulé en suspension dans un volume approprié de 1x PBS pour laver et centrifuger à 110 000 x g pendant 90 min à 4 °C.
NOTA : La pastille EV a été remise en suspension dans 60 mL de PBS 1x en fonction du volume maximal autorisé pour les tubes de rotor à angle fixe utilisés dans cette étude. - Aspirer le PBS et suspendre le plomb EV dans un volume approprié (50-100 μL) de PBS frais 1x et vortex. Conservez les véhicules électriques à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
5. Analyse par cytométrie en flux du signal des miARN cellulaires et des miARN EV dans les VE
- Pour préparer la suspension EV pour l’analyse par cytométrie en flux, diluer les VE dans un volume approprié de PBS 1x ultrafiltré.
NOTA : Le volume de charge pour l’analyse par cytométrie en flux des VE doit être déterminé en fonction du nombre de VE dans les échantillons. En gros, s’il y a ~30 000 particules dans la suspension EV, le volume final devrait être de ~500-600 μL dans 1x PBS. Un échantillon propre contient environ 35 à 50 particules/μL. - Utilisez le nano-cytomètre en flux ou un équipement alternatif suffisamment puissant pour analyser des particules de taille nanométrique.
REMARQUE : Ici, le cytomètre en flux nano-Attune NxT a été utilisé. - Ouvrez le logiciel et configurez l’instrument en suivant les instructions d’étalonnage recommandées. Effectuez le test de performance à l’aide de nanobilles de performance. Si les nanobilles sont détectées dans la gamme de taille standard, les performances sont optimales. Déterminer le débit approprié pour la détection des particules EV.
- Effectuez un contrôle de la qualité à l’aide d’eau filtrée ultra-pure pour confirmer la fluidique de l’instrument et les performances du détecteur et des lasers.
- À l’aide de billes d’étalonnage adaptées à l’expérience, réglez le cytomètre en flux pour détecter avec précision les billes de différentes tailles et mesurer les signaux de fluorescence.
REMARQUE : Pour la configuration de l’analyse EV par cytométrie en flux, des billes ApogeeMix ont été utilisées. Ces billes contiennent un mélange de billes de silice non fluorescentes et de billes de polystyrène fluorescent dont la taille varie de 80 nm à 1300 nm.- Configurer les paramètres pour évaluer la sensibilité et la résolution des différentes populations dans le mélange de billes selon le protocole du fabricant. Utilisez le déclenchement approprié pour résoudre la population de billes à partir du bruit de l’instrument.
- Effectuez un vortex complet sur les échantillons pour répartir uniformément les VE avant de les charger pour analyse.
- Ouvrez le logiciel d’analyse de données de cytométrie en flux et introduisez le PBS ultra-filtré. Réglez le déclenchement pour les particules EV à l’aide de PBS ultra-filtré tout en vous assurant que le déclenchement correspond à la taille appropriée des particules en fonction des billes à l’étape 5.5.
- Chargez l’échantillon témoin négatif pour analyser les VE lorsqu’ils passent dans le cytomètre en flux. Capturez les signaux EV tout en traçant le FSC sur l’axe X et le SSC sur l’axe Y.
REMARQUE : Le seuil de SSC pour la capture des VE a été fixé à 300. Le volume d’acquisition a été fixé à 95 μL sur un total de 145 μL de volume tiré. Le débit a été fixé à 12,5 μL/min. L’analyse a été réalisée avec 1 x 10 particulesde 6 EV. La population de VE est hétérogène et se traduira par l’isolement de certains débris en même temps que les VE. La détection globale des particules dans le graphique FSC vs SSC met en évidence les particules dans une gamme variée, ce qui est attendu lors de l’utilisation de préparations brutes de VE. - Créez un nouveau tracé à l’aide de la population fermée.
- Cette fois, choisissez le signal de fluorescence 1 (FS1) pour la détection des miARN cellulaires sur l’axe X et le signal de fluorescence 2 (FS2) pour la détection des miARN EV sur l’axe Y.
- Définir les paramètres de compensation pour les fluorophores à l’aide des échantillons EV isolés à partir de cellules transfectées avec un seul miARN. Dans le nouveau graphique, porte sur la population EV d’intérêt.
- Pour l’analyse de l’expression des miARN conjugués aux fluorophores dans les VE isolés des cellules transfectées, analysez les échantillons de VE à l’aide des canaux FSC, SSC, BL1 et YL1 réglés sur 370, 370, 400 et 400 unités de tension, respectivement (Figure 2A, B).
- Enregistrez les statistiques de la population fermée et visualisez-les à l’aide d’histogrammes et de diagrammes à points.
- Répétez les étapes ci-dessus pour tous les échantillons ou contrôles supplémentaires de l’expérience.
6. Validation de la libération de miARN dans les VE par qRT-PCR
- Extrayez l’ARN des VE et des cellules mères à l’aide du kit d’isolement de l’ARN miRVana en suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE : La quantification de l’ARN isolé des VE n’est pas possible car la quantité totale d’ARN isolé des VE ne dépasse généralement pas le seuil de quantité minimale d’une nano-goutte standard. Cela est dû à l’épuisement de l’ARN ribosomique des échantillons EV, qui peut être validé à l’aide du bioanalyseur Agilent. Ainsi, le score d’intégrité pour la quantification de l’ARN-EV n’est généralement pas fiable et n’est pas la représentation réelle de la quantité d’ARN-EV. Par conséquent, pour la quantification qRT-PCR de l’ARN-EV et de l’ARN cellulaire, des volumes égaux d’isolats d’ARN après isolement d’un nombre égal de cellules ont été utilisés. Pour la normalisation de la qRT-PCR, des miARN omniprésents dans plusieurs échantillons, tels que déterminés à partir de données de séquençage de l’ARN acquises précédemment, ont été utilisés. - Convertissez l’ARN extrait en ADNc à l’aide d’un kit de transcriptase inverse spécifique pour les petits ARN.
- Configurez la réaction qRT-PCR à l’aide d’un modèle d’ADNc et d’amorces spécifiques aux miARN en suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE : Pour les expériences de validation, le kit de PCR qRT miRCURY LNA et les amorces correspondantes du fabricant ont été utilisés pour évaluer l’expression des miARN cellulaires et des miARN EV.
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Representative Results
Ici, nous utilisons la cytométrie en flux comme un outil puissant pour étudier la libération de miARN des cellules dans les VE. À l’aide de ce protocole, l’analyse par cytométrie en flux de cellules transfectées avec des miARN cellulaires et des miARN EV a révélé une diminution séquentielle du signal de fluorescence correspondant au miARN EV, tandis que le signal correspondant au miARN cellulaire était retenu dans les cellules. Pour s’assurer que la conjugaison des fluorophores n’interfère pas avec la libération de miARN dans les VE, le miR-451a a été conjugué à deux fluorophores distincts (c’est-à-dire Alexa fluor 488 et Alexa fluor 750), et la rétention cellulaire a été évaluée. Les résultats indiquent une variabilité minimale entre la détection des signaux fluorophores distincts après la transfection, ce qui valide la fiabilité de cette approche (Figure 3A,B).
Étant donné que diverses raisons pourraient expliquer la perte de miR-451a marqué par fluorescence dans les cellules, y compris la dégradation de l’ARN, il était essentiel de vérifier que la perte cellulaire coïncidait avec l’abondance des VE. À l’aide de la cytométrie en flux, l’accumulation de miR-451a conjugué au fluor-488 d’Alexa dans les VE a été observée de manière dépendante du temps, ce qui a permis de mettre en évidence un conditionnement efficace et une libération éventuelle du miARN dans les VE. En revanche, le signal de fluorescence correspondant au miARN retenu par la cellule, cel-miR-67, n’a pas été détecté dans les VE (Figure 4). Ces résultats à l’aide de cette nouvelle approche ont été validés à l’aide de la qRT-PCR, qui a révélé un rapport d’expression EV/cellule significativement plus élevé pour miR-150, un miARN-EV supplémentaire, par rapport au miARN cellulaire, cel-miR-67 (Figure 5).
Figure 1 : Mise en place des paramètres du cytomètre en flux pour la détection des signaux dans les cellules. (A) Pour l’analyse de la fluorescence cellulaire, à l’aide du logiciel, les tensions mises en évidence ont été configurées pour les paramètres indiqués. L’instrument a été configuré pour enregistrer 10 000 cellules par échantillon. La vue de l’inspecteur confirme les paramètres configurés pour la détection et l’analyse. (B) Pour l’analyse de la fluorescence cellulaire, le seuil du paramètre FSC a été fixé à 5 000 sous l’onglet des paramètres du cytomètre du logiciel. Le panneau en haut à droite affiche les paramètres laser pour la capture de données. Les panneaux inférieurs montrent une feuille de calcul globale active pendant la progression de la détection des cellules. Les échantillons ont été analysés à un débit moyen et capturés tout en établissant FSC-A et SSC-A comme paramètres de l’axe x et de l’axe y, respectivement. Le portail a été défini à l’aide d’un outil de dessin polygonal autour de la population d’intérêt. Le déclenchement peut être différent pour une autre lignée cellulaire d’intérêt en fonction de la diversité de la population cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mise en place des paramètres de cytométrie en flux pour la détection du signal dans les VE. (A) Pour la détection et l’analyse en aval des VE, le volume d’acquisition a été fixé à 95 μL avec une vitesse d’écoulement fixée à 12,5 μL/min. Le seuil choisi pour la détection EV était de 0,3 x1000 sous l’onglet des paramètres de l’instrument du logiciel en fonction des billes d’étalonnage utilisées. Les tensions pour FSC, SSC, BL1 et YL1 étaient respectivement de 370, 370, 400 et 400. (B) Mise en place d’un dispositif de contrôle permettant de capturer une population hétérogène de VE et de distinguer les VE du bruit de fond de l’instrument. Un échantillon PBS vierge (en haut) a été utilisé comme témoin négatif pour résoudre le bruit de fond de la population de véhicules électriques. L’échantillon EV (en bas) montre que la population d’intérêt ne représente que 1,8 % de la population totale parce que l’échantillon est hétérogène et que les particules se chevauchent dans la gamme de taille. Cependant, un contrôle strict a été choisi pour assurer la détection de la population de VE d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détection de signaux dans les cellules par cytométrie en flux. (A) Une fluorescence correspondant au miARN EV et au miARN cellulaire a été détectée dans les cellules à des moments indiqués entre 7 h et 72 h après la transfection. Le signal correspondant à EV-miR-451a (Alexa fluor-488) a diminué avec le temps par rapport au signal du miARN retenu par la cellule, cel-miR-67. (B) La fluorescence correspondant à l’EV-miR-451a marqué avec le fluor-750 d’Alexa a montré la même tendance que l’Alexa Fluro-488 marqué miR-451a, ce qui indique que le fluorophore n’a pas d’impact sur la rétention des miARN par les cellules. Dans l’ensemble, les résultats représentatifs indiquent que le miARN transfecté se comporte de la même manière que le miARN endogène basé sur l’exportation du miARN dans les VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Détection de signaux dans les VE par cytométrie en flux. Une fluorescence correspondant à EV-miR-451a et cell-cel-miR-67 a été détectée dans les VE 24 h et 48 h après la transfection. Le signal correspondant à EV-miR-451a (Alexa fluor-488) a été capturé dans les VE 48 h après la transfection. En revanche, le signal de cel-miR-67 n’a pas été détecté dans les véhicules électriques. Un échantillon de PBS vierge a été utilisé pour mettre en place le déclenchement de cette expérience, comme le montre la figure 2B. Des échantillons de VE isolés à partir de cellules transfectées avec de l’ARN brouillé non fluorescent ont été utilisés comme témoins négatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantification des miARN EV et des miARN cellulaires dans les cellules et les VE à l’aide de la qRT-PCR. Les cellules Calu6 ont été transfectées avec 2 nM de miR-150 et de cel-miR-67 chacune. Les VE ont été collectés 48 h après la transfection. L’enrichissement en VE a été calculé en divisant le rapport entre l’expression des VE et l’expression cellulaire dans les cellules Calu6 transfectées pour miR-150 et cel-miR-67. Sur la base des résultats du séquençage de l’ARN comparant l’expression des miARN dans les cellules Calu6 et leurs VE correspondantes, miR-30c a été utilisé comme contrôle endogène et normalisateur pour le calcul du changement de pli. Les données présentées proviennent d’une répétition biologique, chaque point de données présentant des réactions qRT-PCR en trois exemplaires. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type, et les valeurs de p ont été calculées à l’aide d’un test t non apparié avec la correction de Welch (**p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Forces | Faiblesses |
| Permet l’évaluation simultanée de l’exportation sélective de plusieurs miARN dans les cellules et des VE respectifs | Exiger des procédures supplémentaires pour différencier les phénomènes d’exportation actifs et passifs |
| L’évaluation de la population hétérogène brute est possible et ne nécessite pas de séparation préalable des populations de VE. Peut être utilisé pour analyser différents types de véhicules électriques REMARQUE : Le seuil de détection des différents types de particules varie |
La faible sensibilité ne permet pas de détecter des concentrations limitées de miARN dans les cellules ou les VE. Ce problème peut être résolu en incorporant une analyse qRT-PCR en aval après l’isolement de l’ARN des VE |
| Nécessite peu de temps pour la mise en place et l’analyse par rapport aux méthodes standard utilisées pour la quantification des miARN | Absence de protocoles de normalisation pour différents types d’équipements, de lignées cellulaires et de divers fluorophores. |
Tableau 1 : Les principales forces et faiblesses du protocole.
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Discussion
Le protocole nouvellement établi permet de capturer la cinétique de la libération des miARN dans les VE après la transfection des miARN EV. L’approche permet l’analyse simultanée de plusieurs miARN EV et miARN cellulaires, sous réserve des capacités du cytomètre. De plus, bien que l’analyse par cytométrie en flux puisse fournir des informations précieuses sur la biologie des miARN EV, elle n’est pas sans limites. Bien que certaines des limitations puissent être surmontées lorsqu’elles sont utilisées en conjonction avec d’autres techniques pour une compréhension plus complète.
Un nouveau domaine d’intérêt pour la biologie des VE est la compréhension de l’exportation sélective de miARN en VE15,16. Bien que ce protocole offre un outil puissant pour permettre l’étude de l’exportation sélective des miARN, l’un des défis critiques est de faire la distinction entre l’exportation active et passive. Il faut faire preuve de prudence car la surexpression d’un miARN à une concentration suffisamment élevée pourrait altérer l’exportation de miARN, ce qui pourrait entraîner une charge passive inappropriée. Par conséquent, l’expérimentation visant à déterminer les concentrations optimales de transfection des miARN est cruciale lors de l’étude de l’exportation sélective.
De plus, le protocole, lorsqu’il est combiné à des techniques complémentaires telles que l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), permet au chercheur d’évaluer le nombre de particules EV tout en évaluant la libération de miARN et a le potentiel de permettre de distinguer les altérations des voies de biogenèse des VE et les mécanismes d’exportation des miARN. Ceci est particulièrement important en raison du chevauchement des médiateurs de ces processus17. Étant donné que les miARN peuvent avoir un impact sur divers phénotypes, y compris certains impliqués dans la biogenèse des VE, il serait prudent d’évaluer le nombre de particules après la transfection des miARN18. Pour surmonter cet obstacle, une autre option serait d’incorporer un miARN EV qui reste inchangé dans les conditions expérimentales, excluant ainsi les facteurs impliqués dans la biogenèse des EV tout en mettant en évidence les voies impliquées dans l’exportation des miARN EV.
Plusieurs études ont quantifié les miARN à l’aide de la qRT-PCR, une méthode standard pour la quantification des miARN endogènes 10,11,16. Cependant, il n’a pas la capacité de capturer dynamiquement la libération de miARN dans les VE. Lorsque l’on compare la cytométrie en flux à la qRT-PCR, elles diffèrent considérablement en fonction de la sensibilité et de la conception du test. Bien que la qRT-PCR soit une technique très sensible et théoriquement capable de quantifier le nombre minimal de copies de miARN, la distinction de deux échantillons nécessite une différence d’au moins 2 fois (100 %) dans le nombre de copies des miARN d’intérêt. La cytométrie en flux, quant à elle, capture les différences basées sur le signal en fonction de l’abondance des miARN marqués par fluorescence et peut différencier de petits pourcentages de changements dans les signaux. Néanmoins, sa faible sensibilité limite la détection des miARN avec un nombre de copies limité. Les deux techniques se complètent en synergie lorsqu’elles sont utilisées conjointement, comme indiqué dans le protocole.
En résumé, ce protocole offre un outil précieux pour étudier la dynamique d’exportation sélective des miARN. Malgré les défis susmentionnés, la force de ce protocole réside dans sa capacité à analyser plusieurs miARN simultanément, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de la biologie des miARN, de leur exportation et de leur rôle dans la biologie des VE. Les principales forces et faiblesses du protocole qui doivent être prises en compte sont énumérées dans le tableau 1.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Jill Hutchcroft, directrice de l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université Purdue, pour son soutien et ses conseils. Ce travail a été soutenu par R01CA226259 et R01CA205420 à A.L.K., un prix de l’innovation de l’American Lung Association (ANALA2023) IA-1059916 à A.L.K., une subvention de la facilité de ressources partagées de Purdue P30CA023168 et une bourse doctorale Fulbright accordée par le Département d’État, États-Unis à H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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